CN106148219A - 沼泽红假单胞菌分离与扩大培养基及其培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种沼泽红假单胞菌的分离和扩大培养基及其培养方法。用本发明中扩大培养方法培养出的光合菌剂原料成本低、菌体生长迅速，颜色鲜艳，液体菌剂稳定、均匀、无沉淀，纯度达到90％以上，目标活菌数可以达到10⁹cfu/ml以上，是现有培养基的7-15倍。

Description

沼泽红假单胞菌分离与扩大培养基及其培养方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，提供了沼泽红假单胞菌分离与扩大培养基及其培养方法。

背景技术

光合细菌(Photosynthetic bacteria，简称PSB)是地球上最早出现具有原始光能合成体系的原核生物，是一大类在厌氧条件下进行不放氧光合作用的细菌的总称，为革兰氏阴性菌，广泛存在于地球生物圈的各处。光合细菌菌体无毒，蛋白质含量高达60％，含B族维生素、辅酶Q和类胡萝卜素。因其特有的固氮、吸氢、固碳、利用硫化物等的新陈代谢方式而具有降解水中亚硝、氨氮及净化水质的作用。随着水产养殖业集约化程度不断提高，水质恶化使病原微生物种类增多、传播速度加快，导致水产生物病害发生日趋频繁，最终给水产养殖业造成严重损失。目前市场上出现各式各样的光合细菌制剂，但是很多产品出现光合细菌浓度不够、颜色不鲜艳或包装桶底部含有大量的菌体沉淀的问题，因此，筛选出优良的具有生物修复功能的光合细菌菌种并且实现大规模培养具有重要的经济价值。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种沼泽红假单胞菌分离与扩大培养基。

本发明提供的用于分离沼泽红假单胞菌的富集培养基，每L培养基含有：NaHCO₃1～3g，酵母粉0.5～1g，K₂HPO₄·3H₂O 0.1-0.3g，NH₄Cl 0.5-2g，NaAc 0.2g-0.4g，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.5g，NaCl 1-3g，Na₂S₂O₃·5H₂O 0.5～1g。

本发明提供的用于分离沼泽红假单胞菌的分离培养基，其为在所述的富集培养基基础上添加最终质量分数为1.0-2.0％的琼脂。

本发明提供的用于沼泽红假单胞菌扩大培养基每L培养基含有：CaCl₂0.1～0.5g，KH₂PO₄0.5～1.0g，NH₄Cl 0.5-2.0g，MgCl₂·6H₂O 0.3-1.0g，NaCl 0.5-2.0g，NaAc·3H₂O 0.5～1.0g，丁二酸钠0.5～1.0g,酵母粉0.1～0.5g，蛋白胨0.1～0.3g，维生素B₁0.001g，维生素B₃0.001g，维生素B₇0.01-0.03mg，H₃BO₃1.0-3.0mg，MnSO₄·H₂O 1.0-2.0mg，NaM_OO₄·2H₂O 0.5-1.5mg，Cu(NO₃)₂·3H₂O0.02-0.05mg，ZnSO₄·7H₂O 0.1-0.3mg。

本发明还提供一种沼泽红假单胞菌的富集分离纯化方法，其包括如下步骤

⑴取自然池塘边的湿润泥土样品与权利要求1所述的富集培养基按重量体积比1:20混合于厌氧管中，上面覆盖1-2cm石蜡油，30℃，1000-2000lx光照厌氧培养至培养液变红；

⑵富集一周后，从培养基变红的厌氧管中取出1mL液体，取稀释度为10^-3、10^-4，10^-5的液体100μL涂板；

⑶观察平板菌落生长状况，7-10天可以见到红色针尖状菌落，及时将菌落挑出划线纯化2-3次，放于光照厌氧箱培养。

用本发明中扩大培养方法培养出的光合菌剂原料成本低、菌体生长迅速，颜色鲜艳，液体菌剂稳定、均匀、无沉淀，纯度达到90％以上，目标活菌数可以达到10⁹cfu/ml以上，是现有培养基的7-15倍。

附图说明

图1沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)的菌落图。

图2所示为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)发酵液。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明中所涉及到的实验器材和试剂如下所示：

超净台：苏净安泰SW-CJ-2FD型

生化培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂SPX-250B-X型

分光光度计：上海精密科学仪器有限公司721N型

显微镜：OLIMPUS CX31型

光照厌氧操作箱：Thermo SCIENTIFIC Forma Anaerobic system

其他试剂购自北京智博鼎盛生物科技有限公司。

实施例1

1.配制光合细菌培养基

富集培养基(/L)：NaHCO₃2g，酵母粉1g，K₂HPO₄·3H₂O0.2g，NH₄Cl 1g，NaAc·3H₂O 0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NaCl 0.2g，Na₂S₂O₃·5H₂O 1g，pH7.0，121℃高压灭菌20min。

分离培养基在富集培养基基础上添加琼脂，最终质量分为1.5％，121℃高压灭菌20min。

维生素母液配制如下：各称量VB1、VB3、VB71g、1g、0.015g溶于100mL水中，0.2μm孔径的薄膜滤菌器过滤除菌，用时每L取100μl；

微量元素母液配制如下：

各称取H₃BO₃0.7g、MnSO₄·H₂O 0.3898g、NaM_OO₄·2H₂O0.188g、Cu(NO₃)₂·3H2O 0.01g、ZnSO₄·7H₂O 0.06g溶于250mL水中，121℃灭菌20min，用时每L取100mL。

扩大培养基(/L)：CaCl₂0.1g，KH₂PO₄0.5g，NH₄Cl 1g，MgCl₂·6H₂O 0.5g，NaCl 1g，NaAc·3H₂O 1g，二水合丁二酸钠1g，酵母粉0.1g，蛋白胨0.1g，维生素母液100μl，微量元素母液1mL，pH6.8，121℃高压灭菌20min。

2.富集：

取自然池塘边的湿润泥土样品1g与所述的富集培养基20ml混合于厌氧管中，上面覆盖1-2cm石蜡油，30℃，1000-2000lx光照厌氧培养至培养液变红；

富集一周后，从培养基变红的厌氧管中取出1mL液体，取稀释度为10^-3、10^-4，10^-5的液体100μL涂布分离培养基平板，10天左右观察到有红色菌落长出；挑出红色菌落平板画线至纯。

3.鉴定

挑取单菌落进行16S rRNA菌落PCR，送Invitrogen测序。测得序列在NCBI上进行Blast比对，初步鉴定为沼泽红假单胞菌Rhodopseudomonas palustri，与沼泽红假单胞菌R.palustris ATCC17003的16S rRNA基因相似性距离为100％。该菌的菌落图如图1所示：生长缓慢，5天可出现单菌落，大小0.5mm～1mm；厌氧状态下为暗红色菌落，革兰氏染色为阴性短杆状，固体平板培养为短杆状。

将分离到沼泽红假单胞菌Rhodopseudomonas palustris保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2014年5月8日，保藏编号分别为：CGMCC No.9136。

4.扩大培养

在含4.5L培养基的桶中接种10％的种子液，封盖，放于纸箱中，每箱6桶，箱内悬挂一盏60W白炽灯，培养4天后菌液变为鲜红色。之后用10桶各5L培养好的种子液接种于含有1吨培养基的透明塑料薄膜管中，两端密封，光照培养5～6天左右，分装至5L桶中(图2)。

对比例1扩大培养基的配制及比较

1.沼泽红假单胞菌扩大培养基的配制(/L)：

CaCl₂0.1g，KH₂PO₄1.0g，NH₄Cl0.5g，MgCl₂·6H₂O0.3g，NaCl 1g，NaAc·3H₂O 0.5g，二水合丁二酸钠1g，酵母粉0.5g，蛋白胨0.1g，维生素母液100μl，微量元素母液1mL，pH6.8，121℃高压灭菌20min。

2.本发明中用的扩大培养基与现用RCVBN培养基培养效果比较

2.1本发明中的扩大培养基培养步骤

(1)按照培养基配方称取各个组分，其中维生素母液过滤除菌，微量元素母液与其他培养基组分单独灭菌，灭完后微量元素母液每升加1mL，维生素母液每升加100μl。

(2)将灭好菌的培养基分装至5L已用酒精消毒的塑料桶中，每桶4.5L，接种CGMCC No.9136种子液500mL，封盖。置于纸箱中白炽灯光照培养4天，可以作为下一步大规模培养的种子液。

(3)称量1吨培养液所需要的各个成分，先用少量自来水完全溶解，再与剩下的自来水充分混合于一端已经封好、长度2m的透明塑料薄膜管中，接种10桶光合细菌种子液，上方均匀悬挂白炽灯若干。光照培养5天，得到高纯度的光合细菌菌液，分装于5L桶中封盖即可。

2.2对照实验

(1)通用光合菌RCVBN培养基成分(/L)：

D-L苹果酸4g，MgSO₄·6H₂O 0.12g，(NH₄)₂SO₄4g，CaCl₂0.075g，KH₂PO₄0.5g，K₂HPO₄·3H₂O 0.3g，EDTA-Na 0.02g，维生素母液100μl，微量元素母液1mL。

(2)培养基配制及培养

按照培养基成分称量所需养分，pH6.8，121℃高压灭菌20min。

将灭菌的培养液分装至已消毒5L桶中，种子液接种量10％，放于纸箱中光照培养5天。

2.3效果比较

以得到光合菌液的纯度和目标活菌数作为比较指标，应用RCVBN培养基培养出的光合细菌纯度为80％，活菌数为5.3×10⁸cfu/mL，应用本发明培养基培养出的光合细菌纯度可达到90％，活菌数可以达到3.8×10⁹cfu/mL，提高了近7倍，此外从外观上观察菌液也更加的鲜艳。

对比例2扩大培养基的配制及比较

1.沼泽红假单胞菌扩大培养基的配制(/L)：

CaCl₂0.5g，KH₂PO₄0.5g，NH₄Cl 1.0g，MgCl₂·6H₂O 0.5g，NaCl 1.0g，NaAc·3H₂O 1.0g，二水合丁二酸钠0.8g，酵母粉0.2g，蛋白胨0.2g，维生素母液100μl，微量元素母液1mL，pH6.8，121℃高压灭菌20min。

2.本发明中用的扩大培养基与现用RCVBN培养基培养效果比较

2.1本发明中的扩大培养基培养步骤

(1)按照培养基配方称取各个组分，其中维生素母液过滤除菌，微量元素母液与其他培养基组分单独灭菌，灭完后微量元素母液每升加1mL，维生素母液每升加100μl。

(2)将灭好菌的培养基分装至5L已用酒精消毒的塑料桶中，每桶4.5L，接种CGMCC No.9136种子液500mL，封盖。置于纸箱中白炽灯光照培养4天，可以作为下一步大规模培养的种子液。

(3)称量1吨培养液所需要的各个成分，先用少量自来水完全溶解，再与剩下的自来水充分混合于一端已经封好、长度2m的透明塑料薄膜管中，接种10桶光合细菌种子液，上方均匀悬挂白炽灯若干。光照培养5天，得到高纯度的光合细菌菌液，分装于5L桶中封盖即可。

2.2对照实验

(1)通用光合菌RCVBN培养基成分(/L)：

D-L苹果酸4g，MgSO₄·6H₂O 0.12g，(NH₄)₂SO₄4g，CaCl₂0.075g，KH₂PO₄0.5g，K₂HPO₄·3H₂O 0.3g，EDTA-Na 0.02g，维生素母液100μl，微量元素母液1mL。

(2)培养基配制及培养

按照培养基成分称量所需养分，pH6.8，121℃高压灭菌20min。

将灭菌的培养液分装至已消毒5L桶中，种子液接种量10％，放于纸箱中光照培养5天。

2.3效果比较

以得到光合菌液的纯度和目标活菌数作为比较指标，应用RCVBN培养基培养出的光合细菌纯度为80％，活菌数为6.1×10⁸cfu/mL，应用本发明培养基培养出的光合细菌纯度可达到93％，活菌数可以达到6.5×10⁹cfu/mL，提高了近10倍，此外从外观上观察菌液也更加的鲜艳。

对比例3扩大培养基的配制及比较

1.沼泽红假单胞菌扩大培养基的配制(/L)：

CaCl₂0.3g，KH₂PO₄0.6g，NH₄Cl 1.5g，MgCl₂·6H₂O 0.8g，NaCl 1.5g，NaAc·3H₂O 1.0g，二水合丁二酸钠0.5g，酵母粉0.5g，蛋白胨0.1g，维生素母液100μl，微量元素母液1mL，pH6.8，121℃高压灭菌20min。

2.本发明中用的扩大培养基与现用RCVBN培养基培养效果比较

2.1本发明中的扩大培养基培养步骤

(1)按照培养基配方称取各个组分，其中维生素母液过滤除菌，微量元素母液与其他培养基组分单独灭菌，灭完后微量元素母液每升加1mL，维生素母液每升加100μl。

(2)将灭好菌的培养基分装至5L已用酒精消毒的塑料桶中，每桶4.5L，接种CGMCC No.9136种子液500mL，封盖。置于纸箱中白炽灯光照培养4天，可以作为下一步大规模培养的种子液。

(3)称量1吨培养液所需要的各个成分，先用少量自来水完全溶解，再与剩下的自来水充分混合于一端已经封好、长度2m的透明塑料薄膜管中，接种10桶光合细菌种子液，上方均匀悬挂白炽灯若干。光照培养5天，得到高纯度的光合细菌菌液，分装于5L桶中封盖即可。

2.2对照实验

(1)通用光合菌RCVBN培养基成分(/L)：

D-L苹果酸4g，MgSO₄·6H₂O 0.12g，(NH₄)₂SO₄4g，CaCl₂0.075g，KH₂PO₄0.5g，K₂HPO₄·3H₂O 0.3g，EDTA-Na 0.02g，维生素母液100μl，微量元素母液1mL。

(2)培养基配制及培养

按照培养基成分称量所需养分，pH6.8，121℃高压灭菌20min。

将灭菌的培养液分装至已消毒5L桶中，种子液接种量10％，放于纸箱中光照培养5天。

2.3效果比较

以得到光合菌液的纯度和目标活菌数作为比较指标，应用RCVBN培养基培养出的光合细菌纯度为80％，活菌数为5.5×10⁸cfu/mL，应用本发明培养基培养出的光合细菌纯度可达到93％，活菌数可以达到8.1×10⁹cfu/mL，提高了近15倍，此外从外观上观察菌液也更加的鲜艳。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种用于分离沼泽红假单胞菌的富集培养基，其特征在于，每L培养基含有：NaHCO₃1～3g，酵母粉0.5～1g，K₂HPO₄·3H₂O0.1-0.3g，NH₄Cl 0.5-2g，NaAc 0.2g-0.4g，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.5g，NaCl1-3g，Na₂S₂O₃·5H₂O 0.5～1g。

2.一种用于分离沼泽红假单胞菌的分离培养基，其特征在于，其为在权利要求1所述的富集培养基基础上添加最终质量分数为1.0-2.0％的琼脂。

3.一种用于沼泽红假单胞菌的扩大培养基，其特征在于，每L培养基含有：CaCl₂0.1～0.5g，KH₂PO₄0.5～1.0g，NH₄Cl0.5-2.0g，MgCl₂·6H₂O 0.3-1.0g，NaCl 0.5-2.0g，NaAc·3H₂O0.5～1.0g，丁二酸钠0.5～1.0g,酵母粉0.1～0.5g，蛋白胨0.1～0.3g，维生素B₁0.001g，维生素B₃0.001g，维生素B₇0.01-0.03mg，H₃BO₃1.0-3.0mg，MnSO₄·H₂O 1.0-2.0mg，NaM_OO₄·2H₂O 0.5-1.5mg，Cu(NO₃)₂·3H₂O 0.02-0.05mg，ZnSO₄·7H₂O 0.1-0.3mg。

4.一种沼泽红假单胞菌的富集分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤

⑴取自然池塘边的湿润泥土样品与权利要求1所述的富集培养基按重量体积比1:20混合于厌氧管中，上面覆盖1-2cm石蜡油，30℃，1000-2000lx光照厌氧培养至培养液变红；

⑵富集一周后，从培养基变红的厌氧管中取出1mL液体，取稀释度为10^-3、10^-4，10^-5的液体100μL涂板；

⑶观察平板菌落生长状况，7-10天可以见到红色针尖状菌落，及时将菌落挑出划线纯化2-3次，放于光照厌氧箱培养。