CN102747021A - 高活菌数光合细菌原代菌种的制种方法 - Google Patents

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苏艳秋
罗国强
顾继锐
白娟
翁云福
伍翠芳
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Abstract

本发明公开了一种高活菌数光合细菌原代菌种的制种方法，涉及生物技术及生物制品领域，该高活菌数光合细菌原代菌种的制种方法包括以下步骤：1)菌种分离、纯化；2)种子筛选。与现有的方法相比，本发明保护的高活菌数光合细菌原代菌种的制种方法制种的原代菌种生长迅速，培养3~5d后OD660nm值即可达到1.5以上，杂菌率低，（＜5%），活菌数高（＞1010~12cfu/ml）。

Description

高活菌数光合细菌原代菌种的制种方法
技术领域
本发明涉及一种生物技术及生物制品领域，特别涉及一种高活菌数光合细菌原代菌种的制种方法。
背景技术
光合细菌（Photosynthetic Bacteria Abbr，简称PSB)是地球上出现最早、自然界中普遍存在、具有原始光能合成体系的原核生物，是在厌氧条件下进行不放氧光合作用的细菌的总称，是一类没有形成芽孢能力的革兰氏阴性菌，是一类以光作为能源、能在厌氧光照或好氧黑暗条件下利用自然界中的有机物、硫化物、氨等作为供氢体兼碳源进行光合作用的微生物。光合细菌广泛分布于自然界的土壤、水田、沼泽、湖泊、江海等处，主要分布于水生环境中光线能透射到的缺氧区。
目前已开发出多种光合细菌的制种方法和制种装置，涉及到的专利有“一种用于规模生产高细胞浓度光合细菌的方法”（公开号CN101386820），“光合细菌制剂的制备方法”（公开号 CN1384188），“光合细菌制剂的制备方法”（公开号CN1400303），“一种制种光合细菌的方法”（公开号CN101358178），“一种浓缩光合细菌的制备方法”（公开号CN1861784），“光合细菌高效制备方法”（公开号CN1597925）。
从上述申请的专利可以看出，目前光合细菌生产企业及科研单位大多集中精力研究光合细菌的大规模生产，在扩繁环节煞费苦心，而对菌种本身没有足够重视，结果造成菌体活性降低、生长速度减慢、杂菌率增高，最终无法保证活菌数，影响使用效果。
术语解释
光合细菌原代菌种：本发明中是指用于大规模生产用的菌种或实验室培养出来的光合细菌菌种。
10倍梯度稀释法：梯度稀释法就是依次稀释10倍，比如取1mL原液加入9mL水稀释10倍，再从这里面取1mL与9mL水混和，依次类推，称梯度稀释。
双层平板法：又叫双层琼脂平板法，先在培养皿中加入混有菌的底层固体培养基，待凝固后再加入半固体培养基。培养一段时间后，观察下层培养基中的菌落数。
菌落：将单个细菌细胞或一小堆同种细胞接种到固体培养基表面（或内层），当它占有一定的发展空间并处于适宜的培养条件下时，该细胞就会迅速生长繁殖并形成细胞堆，即菌落。
单菌落：单菌落是指来源于单一孢子或营养细胞或一群相同的细胞在固体培养基表面或内部形成的肉眼可见的集合体。
纯菌落：菌种单一的菌落。与单菌落的区别在于单菌落可以是不同细胞集合在一起形成的菌落，而纯菌落的话绝对是一个细胞生长繁殖形成的菌落，也称为单克隆。
全价光合细菌培养基：全价光合细菌培养基是指营养价值全面，能满足光合菌生长需求的配合式培养基。
发明内容
针对上述不足之处，本发明的目的之一就在于提供一种高活菌数光合细菌原代菌种的制种方法，该高活菌数光合细菌原代菌种的制种方法制种的光合细菌原代菌种生长迅速，培养3~5d后OD660nm值即可达到1.5以上，杂菌率低，（＜5%），活菌数高（＞1010~12cfu/ml）。
技术方案是：一种高活菌数光合细菌原代菌种的制种方法，该高活菌数光合细菌原代菌种的制种方法包括以下步骤：1) 菌种分离、纯化；2) 种子筛选。
作为优选，该高活菌数光合细菌原代菌种的制种方法还包括原代菌种保存步骤。
作为优选，所述菌种分离、纯化步骤包括以下分步骤：
①光合细菌菌液采用梯度稀释法稀释；
②称取光合细菌双层平板法下层培养基组分，加入0.2~0.6%琼脂，加热融化，冷却至40~45℃；
③取适宜稀释度稀释液，按照稀释液与培养基1:5~1:7比例，将稀释液和培养基混匀，倒入无菌培养皿，冷却凝固；
④按照光合细菌双层平板法，配制上层培养基，冷却至室温，注满培养皿，加盖，倒置，置于30~40℃，40~70W白炽灯光照条件下培养；
⑤待长出红色单菌落后，去掉上层培养基，用接种环挑取单菌落，接入装有无菌水的Ep管中打散，混匀。按照双层平板法重复操作三次，获得单克隆纯菌落进行下一步操作。整个操作均在无菌超净台进行，保证无菌。
作为优选，所述原代菌种保存为菌种保存于培养架上层，无阳光直射，保持散射光源，同时持续处于间隔20~40min自动持续搅拌1~5min。
作为优选，所述种子筛选步骤包括以下分步骤：
① 培养基制备；
② Ep管培养；
③ 试管培养；
④ 一级种子培养；
⑤ 二级种子培养或扩大培养；
⑥ 三级种子培养。
作为优选，所述培养基制备为按比例称量培养基配方各成分。培养基配方为NaAc 2~5g/L、NH4Cl 0.1~2g/L、NaHCO3 0.4~3g/L、KH2PO4 0.01~1g/L、NaCl 0.5~3g/L、MgCl2 0.05~2g/L、酵母膏0.1~2.5g/L。其中除NH4Cl和NaHCO3外培养基成分100~121℃，灭菌15~30min；NH4Cl和NaHCO3配制成10倍母液，真空抽滤灭菌，以1:6~1:9添加到其余组分中制成无菌全价光合细菌培养基； 
所述Ep管培养为去掉双层平板中的上层培养基，挑取单克隆菌体转接至含有无菌培养基的Ep管中，置于培养箱中30~40℃，40~70W白炽灯光照条件下培养，间隔2h~4h震荡一次，防止附壁影响生长。从第4~7d开始淘汰长势不佳的菌体，保持淘汰率80~90%左右，以获得最优菌株；
所述试管培养为将Ep管中筛选得到的菌体转接至无菌试管，加满无菌培养基，密封管口，其余操作同上；
所述一级种子培养为向无菌小型锥形瓶中加入无菌培养基，按照接种比例将试管培养筛选留下的菌体转接进去，瓶口密封。培养4~7d开始淘汰长势不佳的菌体，保持淘汰率80~90%左右，以获得最优菌株；
所述二级种子培养为向无菌中型锥形瓶中加入无菌培养基，按照接种比例将一级种子筛选留下的菌体转接进去，瓶口密封。培养4~7d开始淘汰长势不佳的菌体，保持淘汰率80~90%左右，以获得最优菌株；所述扩大培养为将选出的二级菌种按比例接种至500mL锥形瓶进行培养；
所述三级种子培养为按照1：10的比例，向装有5L培养基的大型锥形瓶中加入500mL筛选出的二级种子。放入一颗经过消毒处理的磁力转子，保鲜膜封口，橡皮筋扎紧。移上光合细菌原代菌种培养架，室温，40~70W白炽灯光照下培养。培养架参数设置为间隔20~40min自动持续搅拌1~5min，防止菌体附壁影响生长。
作为优选，所述光合细菌为沼泽红假单胞菌。
本发明的另一目的是提供一种高活菌数光合细菌原代菌种培养基。
技术方案是：一种高活菌数光合细菌原代菌种培养基，该培养基由以下原料制成：NaAc 2~5g/L、NH4Cl 0.1~2g/L、NaHCO3 0.4~3g/L、KH2PO4 0.01~1g/L、NaCl 0.5~3g/L、MgCl2 0.05~2g/L、酵母膏0.1~2.5g/L。
本发明的再一目的是提供一种高活菌数光合细菌原代菌种，该高活菌数光合细菌原代菌种生长迅速（培养3~5d后 OD660nm值即可达到1.5以上）、杂菌率低（＜5%）、活菌数高（＞1010~12cfu/ml）。
技术方案是：一种高活菌数光合细菌原代菌种，该高活菌数光合细菌原代菌种是采用上述方法制种出来的。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明技术在原有菌种培养基础上，经过不断摸索、验证，总结出“多级筛选，九成淘汰，择优扩大”的菌种优化制种流程。采用本发明技术，逐级淘汰，可不断选择生长旺盛的菌种，保证公司原代菌种质量。同时通过建立相关技术标准与操作规范，使整个产品流程具有可追溯性，有助于告别作坊式的无序生产，加强公司对原代菌种质量控制，使原代菌种生长迅速，培养3~5d后 OD660nm值即可达到1.5以上，杂菌率低，（＜5%），活菌数高（＞1010~12cfu/ml）。
 
具体实施方式
本发明采用以下方法步骤制种高活菌数光合细菌原代菌种：
（1）高活菌数光合细菌原代菌种分离、纯化。
①将光合细菌菌液采用10倍梯度稀释法稀释。
②按光合细菌配方： NaAc 2~5g/L、NH4Cl 0.1~2g/L、NaHCO3 0.4~3g/L、KH2PO4 0.01~1g/L、NaCl 0.5~3g/L、MgCl2 0.05~2g/L、酵母膏0.1~2.5g/L。称取光合细菌双层平板法下层培养基组分，加入质量百分比为0.2~0.6%琼脂，加热融化，冷却至40~45℃。
③取①所得的稀释液，按照稀释液与培养基体积比为1:5~1:7比例，将稀释液和培养基混匀，倒入无菌培养皿，冷却凝固。
④按照光合细菌双层平板法，配制上层培养基（0.8~1.3%琼脂），冷却至室温，注满培养皿，加盖，倒置，置于30~40℃，40~70W白炽灯光照条件下培养。
⑤待长出红色单菌落后，去掉上层培养基，用接种环挑取单菌落，接入装有无菌水的Ep管（Emergency preparedness管）中打散，混匀。按照双层平板法重复操作三次，获得单克隆纯菌落进行下一步操作。整个操作均在无菌超净台进行，保证无菌。
（2）高活菌数光合细菌原代菌种种子筛选。
①培养基制备：按比例称量培养基配方各成分，培养基配方为NaAc 2~5g/L、NH4Cl 0.1~2g/L、NaHCO3 0.4~3g/L、KH2PO4 0.01~1g/L、NaCl 0.5~3g/L、MgCl2 0.05~2g/L、酵母膏0.1~2.5g/L，其中除NH4Cl和NaHCO3外的培养基成分100~121℃，灭菌15~30min。NH4Cl和NaHCO3配制成10倍母液，真空抽滤灭菌，以体积比1:6~1:9添加到其余组分中制成无菌全价光合细菌培养基。
② Ep管培养：去掉双层平板中的上层培养基，挑取单克隆菌体转接至含有无菌培养基的Ep管中，置于培养箱中30~40℃，40~70W白炽灯光照条件下培养，间隔2h~4h震荡一次，防止菌体附壁影响生长。从第4~7d开始淘汰长势不佳的菌体，保持淘汰率80~90%左右，以获得最优菌株。
③ 试管培养：将Ep管中筛选得到的菌体转接至无菌试管，加满无菌全价光合细菌培养基，密封管口，置于培养箱中30~40℃，40~70W白炽灯光照条件下培养，间隔2h~4h震荡一次，防止菌体附壁影响生长。从第4~7d开始淘汰长势不佳的菌体，保持淘汰率80~90%左右，以获得最优菌株。
④ 一级种子培养：向无菌小型锥形瓶（100ml）中加入无菌全价光合细菌培养基，按照接种比例10~20%将试管培养筛选留下的菌体转接进去，瓶口密封。培养4~7d开始淘汰长势不佳的菌体，保持淘汰率80~90%左右，以获得最优菌株。
⑤ 二级种子培养：向无菌中型锥形瓶（250ml）中加入无菌全价光合细菌培养基，按照接种比例将一级种子筛选留下的菌体转接进去，瓶口密封。培养4~7d开始淘汰长势不佳的菌体，保持淘汰率80~90%左右，以获得最优菌株。
可以对选出的菌种P-2-X 进行一次扩大培养，方法为将选出的二级菌种按比例接种至500mL锥形瓶进行培养。
⑥ 三级种子培养：按照二级种子液与三级种子培养液之间的体积比1：10的比例，向装有5L无菌全价光合细菌培养基的大型锥形瓶中加入500mL筛选出的二级种子或扩大培养种子。放入一颗经过消毒处理的磁力转子，保鲜膜封口，橡皮筋扎紧。移上光合细菌原代菌种培养架，室温，40~70W白炽灯光照下培养。培养架参数设置为间隔20~40min自动持续搅拌1~5min，防止菌体附壁影响生长。
（3）原代菌种保存
将培养架上培养好的光合细菌三级种子保存于培养架最上层，无阳光直射，保持散射光源，同时持续间隔20~40min自动搅拌1~5min。采用这种菌种保存方法，菌液一直处于均质状态，且颜色鲜艳，菌体容易复活，且能快速生长。
实施例1
（1）沼泽红假单胞菌菌种分离、纯化培养。
①将沼泽红假单胞菌菌液采用10倍梯度稀释法稀释到10-9、10-10、10-11。
②称取光合细菌双层平板法下层培养基组分，加入质量分数0.4%的琼脂，加热融化，冷却至40~45℃。
③取稀释液，按照稀释液与培养基1:5比例，将稀释液和培养基混匀，倒入无菌培养皿，冷却凝固。
④按照光合细菌双层平板法，配制上层培养基（1.0%琼脂），冷却至室温，注满培养皿，加盖，倒置，置于30℃，70W白炽灯光照条件下培养。
⑤待长出红色单菌落后，去掉上层培养基，用接种环挑取单菌落，接入装有无菌水的Ep管中打散，混匀。按照双层平板法重复操作三次，获得单克隆纯菌落进行下一步操作。整个操作均在无菌超净台进行，保证无菌。
（2）沼泽红假单胞菌原代菌种筛选
①培养基制备：按照光合细菌全价培养基配方称取各成分，其中除NH4Cl和NaHCO3外的培养基成分100~121℃，灭菌15~30min。将NH4Cl和NaHCO3粉末溶解配制成10倍母液，真空抽滤灭菌，以NH4Cl与NaHCO3母液与其它成分体积比1:9添加到其余组分中制成无菌全价光合细菌培养基。
②Ep管培养：去掉双层平板中的上层培养基，挑取单克隆菌体转接至含有无菌培养基的Ep管中，置于培养箱中30℃，70W白炽灯光照条件下培养，间隔2h~4h震荡一次，防止附壁影响生长。从第4~7d开始淘汰长势不佳的菌体，保持淘汰率80~90%左右，以获得最优菌株。
③试管培养：将Ep管中筛选得到的菌体转接至无菌试管，加满无菌光合细菌全价培养基，密封管口，置于培养箱中30℃，70W白炽灯光照条件下培养，间隔2h~4h震荡一次，防止菌体附壁影响生长。从第4~7d开始淘汰长势不佳的菌体，保持淘汰率80~90%左右，以获得最优菌株。
④一级种子培养：向无菌小型锥形瓶（100ml）中加入无菌光合细菌全价培养基，按照10%接种比例将试管培养筛选留下的菌体转接进去，瓶口密封。培养4~7d开始淘汰长势不佳的菌体，保持淘汰率80~90%左右，以获得最优菌株。
⑤二级种子培养：向无菌中型锥形瓶（250ml）中加入无菌光合细菌全价培养基，按照接种比例将一级种子筛选留下的菌体转接进去，瓶口密封。培养4~7d开始淘汰长势不佳的菌体，保持淘汰率80~90%左右，以获得最优菌株。
⑥三级种子培养：按照二级种子液与三级种子培养液之间体积比为1:10的比例，向装有5L培养基的大型锥形瓶中加入500mL筛选出的二级种子。放入一颗经过消毒处理的磁力转子，保鲜膜封口，橡皮筋扎紧。移上光合细菌原代菌种培养架，室温，70W白炽灯光照下培养。培养架参数设置为间隔20~40min自动持续搅拌1~5min，防止光合细菌细胞粘附到培养瓶壁，造成受光不足，营养吸收不充分，影响生长。
经过制种流程后获得的沼泽红假单胞菌原代菌种见下表。
对比实施例1
按照光合细菌全价培养基配方，配制液体光合细菌培养基，将没有经过菌种分离、纯化及种子筛选流程的沼泽红假单胞菌菌液按照10%接种比例接种到配制好的光合细菌全价培养基中，放入一颗磁力转子，保鲜膜封口，橡皮筋扎紧管口。移上培养架，室温、70W白炽灯光照下培养。培养架参数设置为间隔20~40min自动持续搅拌1~5min，防止光合细菌细胞粘附到培养瓶壁，造成受光不足，营养吸收不充分，影响生长。培养5d后，获得的光合细菌P1菌液见下表。
 
实验名称 比较项目 OD660nm值 杂菌率 活菌数(cfu/ml)
实施例1 1.65 3% 4.19×1012
对比实施例1 1.10 10% 8.14×109

Claims (12)

1.一种高活菌数光合细菌原代菌种的制种方法，其特征在于该高活菌数光合细菌原代菌种的制种方法包括以下步骤：
1) 菌种分离、纯化；
2) 种子筛选。
2.根据权利要求1所述的高活菌数光合细菌原代菌种的制种方法，其特征还包括以下步骤：原代菌种保存。
3.根据权利要求1或2所述的高活菌数光合细菌原代菌种的制种方法，其特征在于所述菌种分离、纯化步骤包括以下分步骤：
①光合细菌菌液采用梯度稀释法稀释；
②称取光合细菌双层平板法下层培养基组分，加入0.2~0.6%琼脂，加热融化，冷却至40~45℃；
③按照稀释液与培养基1:5~1:7比例，将稀释液和培养基混匀，倒入无菌培养皿，冷却凝固；
④按照光合细菌双层平板法，配制上层培养基，冷却至室温，注满培养皿，加盖，倒置，置于30~40℃，40~70W白炽灯光照条件下培养；待长出红色单菌落后，去掉上层培养基，用接种环挑取单菌落，接入装有无菌水的Ep管中打散，混匀；
⑤按照双层平板法重复操作三次，获得单克隆纯菌落；
⑥整个操作均在无菌超净台进行，保证无菌。
4.根据权利要求3所述的高活菌数光合细菌原代菌种的制种方法，其特征在于所述原代菌种保存为：菌种保存于培养架上层，无阳光直射，保持散射光源，同时持续处于间隔20~40min自动持续搅拌1~5min。
5.根据权利要求1或2所述的高活菌数光合细菌原代菌种的制种方法，其特征在于所述种子筛选步骤包括以下分步骤：
① 培养基制备；
② Ep管培养；
③ 试管培养；
④ 一级种子培养；
⑤ 二级种子培养或扩大培养；
⑥ 三级种子培养。
6.根据权利要求5所述的高活菌数光合细菌原代菌种的制种方法，其特征在于：
所述培养基制备为按比例称量培养基配方各成分。
7.培养基配方为NaAc 2~5g/L、NH4Cl 0.1~2g/L、NaHCO3 0.4~3g/L、KH2PO4 0.01~1g/L、NaCl 0.5~3g/L、MgCl2 0.05~2g/L、酵母膏0.1~2.5g/L。
8.其中除NH4Cl和NaHCO3外培养基成分100~121℃，灭菌15~30min；NH4Cl和NaHCO3配制成10倍母液，真空抽滤灭菌，以1:6~1:9添加到其余组分中制成无菌全价光合细菌培养基；
所述Ep管培养为去掉双层平板中的上层培养基，挑取单克隆菌体转接至含有无菌培养基的Ep管中，置于培养箱中30~40℃，40~70W白炽灯光照条件下培养，间隔2h~4h震荡一次，防止菌体附壁影响生长；从第4~7d开始淘汰长势不佳的菌体，保持淘汰率80~90%左右，以获得最优菌株；
所述试管培养为将Ep管中筛选得到的菌体转接至无菌试管，加满无菌培养基，密封管口；
所述一级种子培养为向无菌小型锥形瓶中加入无菌培养基，按照接种比例将试管培养筛选留下的菌体转接进去，瓶口密封；培养4~7d开始淘汰长势不佳的菌体，保持淘汰率80~90%左右，以获得最优菌株；
所述二级种子培养为向无菌中型锥形瓶中加入无菌培养基，按照接种比例将一级种子筛选留下的菌体转接进去，瓶口密封；培养4~7d开始淘汰长势不佳的菌体，保持淘汰率80~90%左右，以获得最优菌株；所述扩大培养为将选出的二级菌种按比例接种至500mL锥形瓶进行培养；
所述三级种子培养为按照1：10的比例，向装有5L培养基的大型锥形瓶中加入500mL筛选出的二级种子；放入一颗经过消毒处理的磁力转子，保鲜膜封口，橡皮筋扎紧；移上光合细菌原代菌种培养架，室温，40~70W白炽灯光照下培养；培养架参数设置为间隔20~40min自动持续搅拌1~5min，防止菌体附壁影响生长。
9.根据权利要求6所述的高活菌数光合细菌原代菌种的制种方法，其特征在于：所述原代菌种保存为菌种保存于培养架上层，无阳光直射，保持散射光源，同时持续处于间隔20~40min自动持续搅拌1~5min。
10.根据权利要求1-9所述的高活菌数光合细菌原代菌种的制种方法，其特征在于：所述光合细菌为沼泽红假单胞菌。
11.一种权利要求1-10所述的高活菌数光合细菌原代菌种的制种方法中使用的培养基，其特征在于该培养基由以下原料制成：NaAc 2~5g/L、NH4Cl 0.1~2g/L、NaHCO3 0.4~3g/L、KH2PO4 0.01~1g/L、NaCl 0.5~3g/L、MgCl2 0.05~2g/L、酵母膏0.1~2.5g/L。
12.一种高活菌数光合细菌原代菌种，其特征在于：该高活菌数光合细菌原代菌种是采用权利要求1-10所述的方法培养出来的。
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