CN103284029A

CN103284029A - 一种富硒沼泽红假单胞菌制剂及其制备方法

Info

Publication number: CN103284029A
Application number: CN2013102343834A
Authority: CN
Inventors: 李帅伟; 李本涛
Original assignee: GUANGZHOU GLAM BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: GUANGZHOU GLAM BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2013-06-14
Filing date: 2013-06-14
Publication date: 2013-09-11

Abstract

本发明涉及一种富硒沼泽红假单胞菌制剂的制备方法，属于微生物技术领域，具体涉及一种富硒沼泽红假单胞菌制剂的液体厌氧发酵生产方法。它包括以下步骤：采用沼泽红假单胞菌作为发酵菌种，接种于经过优化的液体培养基中，在温度为30~35℃的条件下培养96h左右，经过三级扩大培养后，在培养的第2、3、4和5天分别添加亚硒酸钠至25、50、75和100ug/mL，继续培养至第7天后，培养液中硒的浓度下降为10ug/mL左右，硒的转化率可达90%以上，菌体富硒量可达到75mg硒每克干菌种，有机硒含量为97%以上。本发明的优点：用普通的无色透明的细口瓶和聚乙烯桶即可完成沼泽红假单胞菌的大批量发酵，操作简单，效果稳定，能耗低，降低了生产成本，提高了生产效率，制成的富硒沼泽红假单胞菌制剂可以作为动物饲料添加剂，也可以为人类提供富含有机硒的食品。

Description

一种富硒沼泽红假单胞菌制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵工程领域，具体地说是一种添加亚硒酸钠的液体培养基经沼泽红假单胞菌厌氧发酵制备富硒沼泽红假单胞菌的方法。

背景技术

沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）在生物学分类中，属于真细菌纲、红螺菌目、红螺菌科、红假单胞菌属、沼泽红假单胞菌种，具有原始光能合成体系，能在厌氧条件下进行不放氧的光合作用，可利用多种有机物质，能以各种各样的有机质及光能进行异氧生长，其菌体含有丰富的蛋白质、B族维生素和对动物生长发育起促进作用的生理活性物质，还可以起到益生菌的作用，可用于微生物饲料添加剂、畜禽水产养殖。

以微生物为载体富集人体及动物所必需的微量元素以求有机形态、制造成本较低廉而富有多种营养的微量元素产品越来越引起人们的关注。研究表明，许多光合细菌具有一定的耐硒和富硒能力，如深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、沼泽红假单胞菌( Rhodopseudomonas palustris) 等。其中沼泽红假单胞菌具有富集多种微量元素的能力，是发酵工业中比较常用的菌种之一，又是优质的光合细菌饲料添加剂，是目前作为微量元素载体可能性比较大的菌种。沼泽红假单胞菌本身营养丰富，含有多种活性成分，并且是唯一由国家农业部批准作为饲料添加剂使用的光合细菌。研究表明，沼泽红假单胞菌具有较高的蛋白质含量，是一种高效优质的蛋白源。同时，沼泽红假单胞菌中氨基酸种类齐全且消化率高，必需氨基酸总含量达40. 92%，必需氨基酸与总氨基酸的比值为44.30%。另外，沼泽红假单胞菌富含B族维生素及类胡萝卜素，同时还含有多种免疫因子和促生长因子，均有利于个体生长，增强抗病性。因此，从营养角度可以认为沼泽红假单胞菌是一种十分优质的饲料营养源。研究表明，沼泽红假单胞菌具有较高的富硒能力并能将无机硒转化为有机硒。细胞硒含量的高低是菌体富硒能力的基本指标，但硒含量与沼泽红假单胞菌的生物量是一对相互联系和制约的因素，单纯追求高硒含量意义不大。从原料利用与转化上来看，如何提高菌体浓度及硒的转化率，对工业化生产更具有实际指导意义。从促进沼泽红假单胞菌生长及对硒的富集效率来看，硒的添加方式、培养基初始pH、装液量等因素，均对其有重要影响，通过对这些条件的优化可以有效地提高富硒菌体的生物量及富硒效率。

发明内容

本发明的目的是提供一种富硒沼泽红假单胞菌制剂的制备方法，为人体及动物提供所必需的有机形态硒元素提供一种新的具有可行性的途径。

实现本发明目的的技术方案如下：

一种富硒沼泽红假单胞菌制剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）活化菌种；

（2）配制经过优化的液体发酵培养基；

（3）经过三级放大培养，在第三级培养的第2、3、4和5天分别添加亚硒酸钠至25、50、75和100ug/mL，继续培养至第7天；测定细胞浓度，富硒菌体中总硒含量、无机硒含量、和有机硒含量测定，发酵培养液中残留无机硒含量测定，计算有机硒转化率；

（4）观察发酵液颜色变化并测定发酵液菌数；

（5）将紫红色的发酵液经过冻干干燥或者65℃下加温处理60min以内干燥，制成可用于人类食品的富硒沼泽红假单胞菌制剂；也可以将紫红色的发酵液用植物淀粉吸附并干燥制成畜禽饲料添加剂。

与现有技术相比，本发明的技术优势：

（1）直接利用无色透明的细口瓶、聚乙烯桶即可进行生产，操作简单，质量稳定，成本低廉，易于产业化生产；

（2）产品发酵周期明显缩短，活菌密度到达3.0×10⁹ CFU/mL的时间为96小时之内，而传统的沼泽红假单胞菌发酵达到同样的菌体密度需要100小时甚至更长时间；生产周期大大缩短短，易于产业化；

（3）产品成本与发酵污染风险降低:本发明由于生产周期缩短，生产成本降低，同时，接种量比较大，几乎不会出现杂菌污染，产品发酵失败风险大大降低；

（4）采用厌氧培养罐或通过持续通入二氧化碳或氮气维持其厌氧环境来进行，原料不能重复使用，操作较复杂，成本较高；用聚乙烯桶进行发酵，大大降低了生产成本；

（5）本发明采用经过优化的沼泽红假单胞菌液体发酵培养基，沼泽红假单胞菌菌数含量明显提高，发酵产物活菌浓度可达3.0×10⁹ CFU/mL以上；

（6）无机硒采用梯度添加法, 也就是在发酵初期菌体生长缓慢阶段，培养基中硒浓度保持在较低水平，随着菌体生长繁殖加快，在菌体生长达到稳定期之前，培养基中硒浓度逐步提高至实验确定的水平，采用这种添加方式硒的转化率达到90%以上，菌体富硒量可达到75mg硒每克干菌种以上，有机硒含量为97%以上；

（7）本发明采用真空冷冻干燥法制备富硒沼泽红假单胞菌人类食品，此方法的优点是菌体细胞存活率高；采用植物淀粉吸附发酵液制备富硒沼泽红假单胞菌饲料添加剂，后处理工艺不需要用高速冷冻离心机，将植物淀粉吸附混合物直接干燥和粉碎，包装后即制成产品，后处理工艺大大简化，生产成本更低，操作工艺简单，较易用于大规模的工业化生产和推广应用，适合于我国饲料企业在现有设备条件下生产富硒沼泽红假单胞菌微生态制剂。

具体实施方式

实施例1 制备沼泽红假单胞菌活菌制剂的工艺流程，包括以下步骤：

（1）菌种活化：

本发明采用沼泽红假单胞菌活菌作为发酵菌种，购于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GIM1.167，将-80℃保存的沼泽红假单胞菌活菌菌种在种子培养基（蛋白胨3g，酵母膏3g， MgSO₄·7H₂O 0.5g，无水CaCl₂ 0.3g，琼脂粉15g，调pH7.0，蒸馏水1000ml，高温高压灭菌）试管斜面上划线，光照强度3000~5000lx，30℃培养96个小时。

（2）制备一级种子：

将活化的沼泽红假单胞菌活菌，用接种环挑取一环接种于20mL种子培养基（蛋白胨3g，酵母膏3g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，无水CaCl₂ 0.3g，调pH7.0，蒸馏水1000ml，高温高压灭菌）的试管中，然后加入无菌的液体石蜡至厚度为1~2cm，光照强度3000~5000lx，30℃静置培养96个小时。

（3）制备二级种子：

经过优化后的沼泽红假单胞菌液体发酵培养基配方：乙酸钠3.5g，氯化铵0.6g，KH₂PO₄ 1.0g，硫酸镁 0.5g，酵母膏1.5g，加蒸馏水750 mL稀释，调pH7.0，并加水至1L，搅拌均匀，经121℃、20min高温高压灭菌；在无色透明的细口瓶的液体培养基中，以20%的比例接入一级种子液，加入无菌的液体石蜡至厚度为2cm，光照强度3000~5000lx，30℃静置培养96个小时（活菌数达到3.2×10⁹ CFU/mL）；

（4）三级大瓶培养：

培养基：乙酸钠3.5g，氯化铵0.6g，KH₂PO₄ 1.0g，硫酸镁 0.5g，酵母膏1.5g，加蒸馏水或冷开水750 mL稀释，调pH7.0，并加水至1L，搅拌均匀，然后加入无菌的液体石蜡至厚度为2cm，培养基加入10L的透明聚乙烯桶内，装液量为40%左右，以20%的比例接入二级种子液，保持温度为30~35℃，pH 7.0-8.0，光照强度3000~10000lx，从静置培养的第2、3、4和5天分别添加亚硒酸钠至25、50、75和100ug/mL，继续培养至第7天后，培养液中硒的浓度下降为9.8ug/mL左右，硒的转化率达90.2%，菌体富硒量达到75.3mg硒每克干菌种，有机硒含量为97.2%；将透明聚乙烯桶放在遮阳网下面进行培养，所有聚乙烯桶要避免阳光直晒，光照强度3000~10000lx，每天上午摇动聚乙烯桶一次，每次摇动10下，观察生长情况；在培养过程中，各聚乙烯桶内培养液的颜色变化均由淡黄、橙黄、浅红色到紫红色，所不同的是紫红色的显现时间。

（5）收集富硒沼泽红假单胞菌菌体并制剂：

将紫红色的发酵液经过低温离心后，收集菌体并加入保护剂进行真空冷冻干燥，制成可用于人类食品的富硒沼泽红假单胞菌制剂；也可以将紫红色的发酵液用植物淀粉吸附并干燥制成畜禽饲料添加剂，以质量比为7:2:1的玉米粉、小麦粉和豆饼粉作为紫红色发酵液的吸附剂，并将植物淀粉吸附的发酵液混合物进行烘干干燥，经过粉碎和包装，制成用于畜禽养殖的微生态饲料添加剂。

实施例2 与上述实施例1不同的是：

（1）透明聚乙烯桶的容积为15L，各级扩大培养的接种量控制为25%，发酵液菌体浓度达到3.0×10⁹ CFU/mL是在培养82小时左右，从静置培养的第2、3、4和5天分别添加亚硒酸钠至25、50、75和100ug/mL，继续培养至第7天后，培养液中硒的浓度下降为9.1ug/mL左右，硒的转化率达90.9%，菌体富硒量达到75.6mg硒每克干菌种，有机硒含量为97.4%；

（2）用植物淀粉吸附发酵液：以等质量的玉米粉和小麦粉混合均匀，作为紫红色发酵液的吸附剂，并将植物淀粉吸附的发酵液混合物进行烘干干燥，经过粉碎和包装，制成用于畜禽养殖的微生态饲料添加剂。

Claims

1.一种富硒沼泽红假单胞菌制剂的制备方法包括以下步骤：

（1）菌种活化：

本发明采用沼泽红假单胞菌活菌作为发酵菌种，购于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GIM1.167，将-80℃保存的沼泽红假单胞菌活菌菌种在种子培养基（蛋白胨3g，酵母膏3g， MgSO₄·7H₂O 0.5g，无水CaCl₂ 0.3g，琼脂粉15g，调pH7.0，蒸馏水1000ml，高温高压灭菌）试管斜面上划线，光照强度3000~5000lx，30℃培养96个小时左右；

（2）制备一级种子：

将活化的沼泽红假单胞菌活菌，用接种环挑取一环接种于20mL种子培养基（蛋白胨3g，酵母膏3g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，无水CaCl₂ 0.3g，调pH7.0，蒸馏水1000ml，高温高压灭菌）的试管中，然后加入无菌的液体石蜡至厚度为1~2cm，光照强度3000~5000lx，30℃静置培养96个小时左右；若培养基灭菌后未立即使用，则需在沸水浴中加热10min驱氧后使用；

（3）制备二级种子：

经过优化后的沼泽红假单胞菌液体发酵培养基配方：乙酸钠3.5g，氯化铵0.6g，KH₂PO₄ 1.0g，硫酸镁 0.5g，酵母膏1.5g，加蒸馏水750 mL稀释，调pH7.0，并加水至1L，搅拌均匀，经121℃、20min高温高压灭菌；在无色透明的细口瓶的液体培养基中，以10~35%的比例接入一级种子液，加入无菌的液体石蜡至厚度为1~2cm，光照强度3000~5000lx，30℃静置培养96个小时左右（活菌数达到3×10⁹ CFU/mL 左右）；

（4）三级大瓶培养：

培养基：乙酸钠3.5g，氯化铵0.6g，KH₂PO₄ 1.0g，硫酸镁 0.5g，酵母膏1.5g，加蒸馏水或冷开水750 mL稀释，调pH7.0，并加水至1L，搅拌均匀，然后加入无菌的液体石蜡至厚度为1~2cm，培养基加入透明聚乙烯桶内（容量为5 L、10L、15L或者更大），装液量为40%左右，以10~35%的比例接入二级种子液，保持温度为30~35℃，pH 7.0-8.0，光照强度3000~10000

lx，从静置培养的第2、3、4和5天分别添加亚硒酸钠至25、50、75和100ug/mL，继续培养至第7天后，培养液中硒的浓度下降为10 ug/mL左右，硒的转化率可达90%以上，菌体富硒量可达到75mg硒每克干菌种，有机硒含量为97%以上；将透明聚乙烯桶放在遮阳网下面进行培养，所有聚乙烯桶要避免阳光直晒，光照强度3000~10000lx，每天上午摇动聚乙烯桶一次，每次摇动10下，观察生长情况；在培养过程中，各聚乙烯桶内培养液的颜色变化均由淡黄、橙黄、浅红色到紫红色，所不同的是紫红色的显现时间；

（5）收集富硒沼泽红假单胞菌菌体并制剂：

将紫红色的发酵液经过低温离心后，收集菌体并加入保护剂进行冻干干燥或者65℃下加温处理60min以内，经过干燥和包装，制成可用于人类食品的富硒沼泽红假单胞菌制剂；

也可以将紫红色的发酵液用植物淀粉吸附并干燥制成畜禽饲料添加剂：以玉米粉、小麦粉或豆饼粉，或者其任意组合，作为紫红色发酵液的吸附剂，并将植物淀粉吸附的发酵液混合物进行烘干干燥，经过粉碎和包装，制成用于畜禽养殖的微生态饲料添加剂。

2.根据权利要求1所述的富硒沼泽红假单胞菌制剂，其特征在于所述的液体发酵培养基为：乙酸钠3.5g，氯化铵0.6g，KH₂PO₄ 1.0g，硫酸镁 0.5g，酵母膏1.5g，自来水或者冷开水进行配制。

3.根据权利要求1所述的富硒沼泽红假单胞菌制剂，其特征在于：培养温度为温度为30~35℃，pH 7.0~8.0。

4.根据权利要求1所述的富硒沼泽红假单胞菌制剂，其特征在于：各级种子菌接种量为10~35%的接种量。

5.根据权利要求1所述的富硒沼泽红假单胞菌制剂，其特征在于：所用的菌种为红假单胞菌属沼泽红假单胞菌种。

6.根据权利要求1所述的富硒沼泽红假单胞菌制剂，其特征在于：该沼泽红假单胞菌活菌制剂的应用领域为人类食品或者畜禽饲料添加剂。