CN112831435B - 一种分离的产氮假单胞菌及其在还原硒元素中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种分离的产氮假单胞菌及其在还原硒元素中的应用，所述的产氮假单胞菌的保藏编号为CCTCC NO：M2020955。本发明首次提供了一种兼具高耐硒能力和高硒还原力的菌株产氮假单胞菌，能在浓度高达445mmol/L无机硒培养液中发酵，制得一种纳米硒‑有机硒营养液，且该营养液可应用于农业的富硒种植、养殖等方面，并获得良好的使用效果，具有广阔的应用前景。

Description

一种分离的产氮假单胞菌及其在还原硒元素中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种分离的产氮假单胞菌及其在还原硒元素中的应用。
背景技术
硒是一种对人体和动物非常重要的必需微量元素，在抗癌、抗氧化和增强免疫力等方面具有重要作用，并且很多慢性疾病都与人体缺硒有关。我国早期使用硒矿粉基施或硒酸盐/亚硒酸盐等叶面喷洒农作物，达到生产富硒农产品的目的。然而，研究发现，大部分农作物尤其是主粮作物对无机硒的吸收转化率很低，并且在基施硒矿粉时，易将重金属带入土壤，带来二次污染，硒酸盐/亚硒酸盐等无机硒，则易被雨水冲刷而渗入地下或流入江河湖泊，形成面源污染。
随着技术的不断进步，生物纳米硒则越来越受到人们的关注。其原因在于：1)生物活性方面，生物纳米硒与生物有机硒大致相当；2)安全性方面，生物纳米硒比生物有机硒更安全；3)使用方面，生物纳米硒不溶于水，在用于农作物喷施时，与作物表面结合更紧密，不易被雨水冲刷，作物转化利用率更高，喷施作业时间窗口更宽泛，尤其在雨季或雨量丰沛的地区，其优势体现得更加充分。因此，生物纳米硒具有生物活性高、作物吸收转化率高、安全性好、生态友好等显著优势在未来的富硒功能农业、环境治理等方面有着广阔的应用前景。
目前，纳米单质硒制备方法主要有物理和化学方法合成。但物理和化学方法制备的纳米单质硒不稳定，易聚集并转化为几乎无活性的灰硒和黑硒。通过微生物转化技术制备有机硒或生物纳米硒则备受青睐。然而，由于作为生物有机硒/生物纳米硒原材料的硒酸盐或亚硒酸盐的高细胞毒性，使得很多微生物在高硒环境培养和转化时，其生长均会受到抑制甚至是灭杀；与此同时，部分微生物虽然能够耐受高浓度硒，但却并不转化。因此，兼具高的硒耐受能力和无机硒转化能力的微生物菌株则鲜有报道。
申请号为201911406047.7的专利文献提及一种高产纳米硒的光合细菌桃红荚硫菌(Thiocapsa roseopersicina)，其对亚硒酸钠的耐受浓度达到了145mmol/L，并以其为基础培养制备纳米硒活菌制剂。但由于其为光合细菌且为严格厌氧菌，培养条件相比普通细菌而言，需特殊光照设备，对设备和工艺控制要求更高，生产成本高企限制了其规模化应用。
针对上述问题，本发明首次提供了一种兼具高耐硒能力和高硒还原力的菌株产氮假单胞菌，通过液体发酵，将无机硒转化为生物纳米硒和有机硒，制备一种纳米硒-生物有机硒营养液，且该营养液可应用于农业的富硒种植、养殖等方面，并获得良好的使用效果，具有广阔的应用前景。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供了一种分离的产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)，所述的产氮假单胞菌的保藏编号为CCTCC NO：M2020955。
本发明的另一个目的在于提供了一种纳米硒-有机硒营养液的制备方法，该方法简单，快捷，适合大规模推广。
本发明的最后一个目的在于提供了产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)的应用，所述菌株可在高无机硒浓度下进行硒元素的还原或转化。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种分离的产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)：申请人在在恩施的硒矿附近采集土样，加入到含10mmol/L亚硒酸钠的富集培养基里进行富集培养，每隔三天更换一次培养基，经过4次处理后，取一定量培养液涂布于分离平板(含10mmol/L亚硒酸钠的牛肉膏蛋白胨固体培养基)，培养24-48h后，挑取红色单菌落，然后经若干次分离纯化得若干株纯化菌落，分别对其显微镜检和革兰氏染色，观察其形态特征。再通过16S rDNA测序比对，对其进行菌种鉴定。其中HSE2002菌株被鉴定为产氮假单胞菌(P.azotoformans)
上述菌株已于2020年12月22日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)HSE2002，保藏编号：CCTCC NO：M2020955，地址：中国武汉武汉大学。
上述的的产氮假单胞菌，革兰氏阳性菌，细胞呈短杆状，无运动性，细胞大小0.3-0.5×0.8-1.4μm。菌落形态圆形光滑，生长温度为4-40℃。
产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)的应用，包括利用该菌株还原硒元素，例如无机硒，或是利用该菌株制备单质硒、生物纳米硒，用于农业的富硒种植、养殖等领域。
一种纳米硒-有机硒营养液的制备方法，包括将OD600值为0.5-2.5的产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)HSE2002以1％～100％的接种量接种至无机硒培养基中，在4-40℃培养16-120h，即得。
所述含无机硒培养基包括：牛肉膏1-20g/L，蛋白胨1-20g/L，氯化钠1-10g/L，无机硒12.5-445mmol/L，pH值为6.0-9.0，其余为水；
优选的，所述含无机硒培养基中硒的浓度为50-445mmol/L；
所述的无机硒为硒酸盐、亚硒酸盐、氧化硒中的一种或多种的混合物；
以上所述的方法中优选的，无机硒培养基中无机硒分批投入，保持培养基中的硒浓度≤200mmol/L。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明提供的还原硒，即产氮假单胞菌，能在浓度高达445mmol/L无机硒培养液中发酵，制得一种纳米硒-有机硒营养液；
(2)本发明提供的产氮假单胞菌兼具高耐硒和高转化能力，可在高浓度硒含量培养液中进行发酵培养，而环境中的微生物则不能耐受如此高的硒浓度而被抑杀。因此，发酵培养基不用进行物理或化学手段除菌或灭菌，大幅降低生产设备投入和生产成本；
(3)本发明提供的纳米硒-有机硒营养液以产氮假单胞菌为基础，通过微生物转化技术制备得到，以纳米硒为主，其有机硒为辅，基本不含无机硒，具有高生物活性，且使用安全，不会产生药害及二次污染，可用于富硒种植和富硒养殖领域。
(4)由于纳米硒具有水不溶性，在农作物种植过程中以叶面肥形式喷施，易于附着于叶片并被吸收转化，提高了转化利用率。同时，只需满足喷施后较短时间不下雨即可，后期即使下雨，也不会被轻易从叶片冲刷掉；一方面提高硒的生物利用度，另一方面也不会造成江、河、湖及地下水等水体面源污染。此外，也利于多雨地区和季节相关农作物喷施作业，喷施时间窗口更易得。
(5)本发明采用的菌株对无机硒的耐受程度大幅度提高，可达445mmol/L本发明所述Pseudomonas azotoformansHSE2002菌株则主要将无机硒还原成生物纳米硒，少部分转化为有机硒。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。本发明实施例是以亚硒酸钠(即亚硒酸盐)为例，说明产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)HSE2002对无机硒的还原能力；事实上，产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)HSE2002对其他形式的无机硒，例如硒酸盐、氧化硒等，均具有高效的还原能力，限于篇幅，本发明实施例不再赘述。
实施例1：
产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)HSE2002的获得：
在恩施的硒矿附近采集土样，加入到含10mmol/L亚硒酸钠的富集培养基里进行富集培养，每隔三天更换一次培养基，经过4次处理后，取一定量培养液涂布于分离平板(含10mmol/L亚硒酸钠的牛肉膏蛋白胨固体培养基)，培养24-48h后，挑取红色单菌落，即为初筛菌株。然后经若干次分离纯化得若干株纯化菌落，分别对其显微镜检和革兰氏染色，观察其形态特征。再通过16S rDNA测序比对，对其进行菌种鉴定。其中HSE2002菌株被鉴定为产氮假单胞菌(P.azotoformans)
上述菌株已于2020年12月22日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)HSE2002，保藏编号：CCTCC NO：M2020955，地址：中国武汉武汉大学。
上述的的产氮假单胞菌，革兰氏阳性菌，细胞呈短杆状，无运动性，细胞大小0.3-0.5×0.8-1.4μm。菌落形态圆形光滑，生长温度为4-40℃。
保藏菌种接种于牛肉膏蛋白胨固体平板上，置于37℃恒温培养箱中培养16-24h，再挑取菌苔接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于37℃培养箱中恒温培养24-48h，即得种子液。
实施例2：
产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)HSE2002在转化无机硒中的应用：
(1)菌种活化：将产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，置于37℃培养箱中恒温培养24h，得活化菌种；
(2)种子液制备：将活化菌种接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，16-24h培养至种子液的OD600值为1.5，得种子液；
(3)接种：将种子液接入含无机硒液体培养基中，所述种子液和含无机硒培养基的体积比为0.05：1，发酵培养120h，即得；
所述含无机硒培养基组分为：牛肉膏15g/L，蛋白胨8g/L，氯化钠6g/L，亚硒酸钠，pH值为7.5；所述的亚硒酸钠的浓度分别为：445mmol/L、250mmol/L、190mmol/L、100mmol/L。
表1
Figure BDA0002900107740000041
Figure BDA0002900107740000051
单质硒的测定参考文献出处Biswas,K.C.,L.L.Barton,et al.(2011)."A novelmethod for the measurement of elemental selenium produced by bacterialreduction of selenite."Journal of Microbiological Methods 86(2):140-144.
有机硒的测定方法参照DBS42/002-2014。
通过上述结果可以看到，产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)HSE2002，在培养基中，可耐受的445mmol/L的无机硒，并持续保持还原活力；同时在发酵产物中，单质硒占主要地位。
实施例3：
产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)HSE2002在转化无机硒中的应用：
(1)菌种活化：将产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，置于37℃培养箱中恒温培养24h，得活化菌种；
(2)种子液制备：将活化菌种接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，培养至种子液的OD值为1.5，得种子液；
(3)接种：将种子液接入含无机硒的液体培养基中，所述种子液和含无机硒培养基的体积比为0.05：1，发酵培养96h，即得；
所述含无机硒培养基组分为：牛肉膏15g/L，蛋白胨8g/L，氯化钠6g/L，亚硒酸钠，pH值为7.5；所述的亚硒酸钠的浓度分别为：445mmol/L、250mmol/L、190mmol/L、100mmol/L。
当无机硒液体培养基中的亚硒酸钠的终浓度为445mmol/L时，亚硒酸钠是分3次加入，第1次加入总亚硒酸钠量的20％，培养24h；第2次加入总亚硒酸钠量的50％，培养24h；第3次加入剩余的亚硒酸钠。例如，若是将种子液接种至1L的液体培养基中，亚硒酸钠第1次加入89mmol，第2次加入222.5mmol，第3次加入133.5mmol。
当无机硒液体培养基中的亚硒酸钠的终浓度为445mmol/L时，亚硒酸钠分3次加入，第1次加入总亚硒酸钠量的30％，培养24h；第2次加入总亚硒酸钠量的50％，培养24h；第3次加入剩余的亚硒酸钠。
当无机硒液体培养基中的亚硒酸钠的终浓度为190mmol/L时，亚硒酸钠分3次加入，第1次加入总亚硒酸钠量的40％，培养24h；第2次加入总亚硒酸钠量的40％，培养24h；第3次加入剩余的亚硒酸钠。
当无机硒液体培养基中的亚硒酸钠的终浓度为100mmol/L时，亚硒酸钠分2次加入，第1次加入总亚硒酸钠量的60％，培养48h；第2次加入总亚硒酸钠量的40％。
发酵结束后，测试发酵液中的无机硒的含量，无机硒的测定方法参照湖北省食品安全地方标准富硒食品中无机硒的测定方法(DBS42/010-2018)，结果如下：
表2
Figure BDA0002900107740000061
可以看到，与一次性添加亚硒酸钠相比，通过分批次加入，缩短发酵时长，提高单质硒生产效率的作用，同时提高单质硒的产量。
实施例4：
产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)HSE2002制备生物纳米硒在水稻种植中的应用：
将上述实施例3表2中硒浓度为100mmol/L发酵组中的96h的发酵液，用水稀释至硒浓度为63.5mmol/L，将其用于水稻富硒种植，于破口期或孕穗期叶面喷施一次，用量为200-300mL/亩，即能收获稻谷，并能加工成富硒大米。
表3富硒水稻种植
喷施时期 破口期 孕穗期
大米硒含量(μg/kg) 284 231
实施例5：
产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)HSE2002制备生物纳米硒在富硒养殖中的应用：
将上述实施例3表2中硒浓度为100mmol/L发酵组中的96h的发酵液，用水稀释至硒浓度为63.5mmol/L，，将其用于蛋鸡养殖，生产富硒鸡蛋。操作方法为：将上发酵液拌入饲料，1吨饲料拌入500-800mL发酵液，混匀即为富硒饲料，然后正常投喂，连续喂养8-10天，所生产的蛋经检测，硒含量为710μg/kg，即为富硒蛋。

Claims (9)

1.一株分离的产氮假单胞菌（Pseudomonas azotoformans），所述的产氮假单胞菌的保藏编号为CCTCC NO：M2020955。
2.权利要求1所述的产氮假单胞菌在还原硒元素中的应用。
3.权利要求1所述的产氮假单胞菌在制备单质硒中的应用。
4.利用权利要求1所述的产氮假单胞菌制备的单质硒-有机硒菌剂。
5.权利要求4所述的单质硒-有机硒菌剂的制备方法，包括：将OD600值为0.5-2.5的权利要求1所述的产氮假单胞菌以1%~5%的接种量接种至无机硒培养基中，在4-40℃培养16-120h；
所述含无机硒培养基为：牛肉膏1-20g/L，蛋白胨1-20g/L，氯化钠1-10g/L，无机硒12.5-445 mmol/L，pH值为6.0-9.0，其余为水。
6.根据权利要求5所述的方法，所述的无机硒为硒酸盐、亚硒酸盐、氧化硒中的一种或多种的混合物。
7.根据权利要求5所述的方法，无机硒培养基中无机硒分批投入，保持培养基中的硒浓度≤200mmol/L。
8.权利要求4所述的单质硒-有机硒菌剂在富硒种植中的应用。
9.权利要求4所述的单质硒-有机硒菌剂在农业富硒动物养殖中的应用。
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