CN115433691B

CN115433691B - 沙福芽孢杆菌Bacillus safensis T15及其用途

Info

Publication number: CN115433691B
Application number: CN202210563787.7A
Authority: CN
Inventors: 张晓辉; 李望; 程捷; 叶相相; 代先祝; 杨彩云
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2022-05-23
Filing date: 2022-05-23
Publication date: 2024-03-15
Anticipated expiration: 2042-05-23
Also published as: CN115433691A

Abstract

本发明属于水华治理技术领域，具体涉及沙福芽孢杆菌Bacillus safensis T15及其用途。本发明的目的是为处理水华提供一种新菌株选择。本发明的技术方案是沙福芽孢杆菌Bacillus safensis T15，其保藏号为GDMCC No:62447。本发明还提供了所述沙福芽孢杆菌Bacillus safensis T15在溶藻中的用途。本发明从土壤中分离筛选出一株具有高溶藻活性的菌株，为应用生物方法治理有害蓝藻水华做出贡献。

Description

沙福芽孢杆菌Bacillus safensis T15及其用途

技术领域

本发明属于水华治理技术领域，具体涉及沙福芽孢杆菌Bacillus safensis T15及其用途。

背景技术

近几十年来，世界经济快速发展的同时，水体环境问题也越来越多，水体富营养化便是其中一个严峻的问题。富营养化水体经常引发有害藻类水华，这些有害藻类不仅对渔业产生严重的影响，还对水体环境和公共卫生造成了相当大的威胁。水华导致水体中溶解氧含量、透明度等指标显著降低，影响饮用水供应，并可能导致水处理厂出现过滤器堵塞，混凝效率降低等问题。特别是蓝藻水华的爆发每年都会给全世界造成极大的损失。因此，研究经济可行的水华藻类去除方法具有重要的理论和现实意义。

减少P(磷)输入一直是传统上控制蓝藻水华的重点，减少营养负荷(内部和外部)的方法对于可持续的蓝藻水华控制至关重要。如20世纪70年代开始，一些国家和地区提出了在洗涤剂中禁止添加磷酸盐，严格氮肥和磷肥的使用等管理措施。多个例子表明，在减少营养输入后，藻类总生物量和水华发生率都会减少。蓝藻水华减少的经典例子之一是华盛顿州西雅图市区华盛顿湖的治理，从20世纪20年代到60年代，未经处理的污水输入，使得湖泊持续出现有害蓝藻水华，到1968年，华盛顿湖的污水排放被取消，蓝藻水华发生率显著降低。在另一个更大的湖泊伊利湖中，大量有害藻类生长，直到20世纪80年代早期，政府通过禁止废水处理排放和含磷酸盐洗涤剂使用而使得水华发生事件显著减少。

但营养管理的方法可能需要几年甚至几十年的时间才能看到水质的改善。因为即使在外部营养输入得到控制后很长时间内，水体内部释放的营养也能维持生产力，促进藻类生长。当然，通过营养控制来防止大面积的水华发生，远比在水华形成后治理水华更可取。然而，制定大规模减少营养输入这样的政策决定是一项重大挑战，而且成本极高，并且，流域级营养管理往往更具挑战性。目前对于蓝藻水华的末端治理主要有物理、化学和生物方法。

物理方法去除藻类最明显的优点是减少后续二次污染，包括人工混合、疏浚、超声波处理和气泡法等。物理方法去除藻类一般属于能源密集型，且往往效率较低，对非目标生物的伤害也限制了此类方法的大规模现场应用。

化学方法中，杀藻剂和营养隔离凝固剂、絮凝剂由于便宜、快速的优点，使用最为广泛。化学方法处理水华，方便快捷，但存在二次污染风险以及昂贵等缺点，使其因提供短期的应急水华控制而受到限制。

生物方法旨在通过水生动物、植物和微生物对有害藻类的竞争和摄入作用，简化生态系统和食物网结构，为蓝藻创造不利条件，建立健康的水生生态系统。由于其成本低、效益高、能耗低、污染小、可持续发展等特点，被视为一种有前途的蓝藻水华预防和控制方法。运用包括细菌、真菌和病毒等微生物来控制水华是目前一个研究热点。细菌可以通过多种方式发挥作用，例如分泌蓝藻分解物质、直接接触、生物絮凝等。Imai等人研究表明，海洋细菌(Cytophaga sp.)的次生代谢产物对硅藻具有强烈的致死作用；已有相关研究指出，一些真菌也同样具有溶藻活性，如产生抗生素来分解有害蓝藻；病毒可通过直接接触快速处理水华，Safferman等人^[92]从自然环境中分离得到名为LPP-1对织线藻(Plectonema)、鞘丝藻(Lyngbya)和席藻(Phormidiaceae)具有较强特异性的溶藻病毒；浮游动物利用捕食作用，清除入侵物种，此外，鱼类的摄食和消化机制，有利于毒素的清除；据报道，藻类也可通过生物絮凝、分泌物质等方式来控制水华，如棕鞭藻(Ochromonassp.)可消除有毒微囊藻群和降解微囊藻毒素。

物理、化学方法对于处理环境中大规模水华具有局限性，这些方法大多面临着能源投入大、成本高、潜在环境风险等挑战。相比之下，生物方法控制水华，特别是使用天然溶藻细菌，因其无毒、易于扩大、成本低、可持续、经济效率和生态友好等优点引起了广泛的关注。如果设计和管理得当，生物方法可能解决持续控制水华的问题。

发明内容

本发明的目的是为处理水华提供一种新选择。

本发明的技术方案是沙福芽孢杆菌Bacillus safensis T15，其保藏号为GDMCCNo:62447。

本发明还提供了所述沙福芽孢杆菌Bacillus safensis T15在溶藻中的用途。

进一步，所述溶藻的藻类为原核蓝藻和/或真核绿藻。

其中，所述原核蓝藻为Microcystis viridis(铜绿微囊藻viridis)、Microcystisaeruginosa(铜绿微囊藻aeruginosa)、Cyanothece sp.(蓝杆藻)、Microcystiswesenbergii(铜绿微囊藻wesenbergii)、Anabaena sp(鱼腥藻).和/或Synechocystis sp.(集胞藻)。

其中，所述真核绿藻为Chlorella vulgaris(小球藻vulgaris)。

本发明还提供了采用所述沙福芽孢杆菌Bacillus safensis T15溶藻的方法，包括如下步骤：将沙福芽孢杆菌Bacillus safensis T15接种至1/5LB液体培养基，培养后收集菌液、无细胞滤液或菌体，投入到待处理水体中进行溶藻。

进一步的，所述1/5LB液体培养基中添加金属离子，金属离子为Ca²⁺、K⁺、Mg²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Fe³⁺和/或Zn²⁺。

其中，所述沙福芽孢杆菌Bacillus safensis T15的培养时间为3～24h。

具体的，所述溶藻过程中光照时间为14～24h/天。

其中，所述溶藻温度为23～33℃。

优选的，所述溶藻温度为28～33℃。

本发明的有益效果：本发明从土壤中分离筛选出一株具有高溶藻活性的菌株，旨在通过对溶藻菌溶藻特性、溶藻机理的研究，初步探讨溶藻作用机制，为控制蓝藻水华的爆发提供菌种资源和溶藻作用机制探索提供理论基础，为应用生物方法治理有害蓝藻水华做出贡献。T15与藻类的共培养实验结果表明，其溶藻率达到90.77％，不同生长阶段的菌的溶藻效果差异不大。

溶藻菌Bacillus safensis T15，其保藏号为GDMCC No:62447。于2022年4月29日送交保藏，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，邮编510070。

附图说明

图1、溶藻菌T15对M.aeruginosa NIES-843的溶藻效果。(a)右图为T15与M.aeruginosa NIES-843培养6天的溶藻效果，左图为对照(Control是对照)；(b)T15对M.aeruginosa NIES-843的溶藻率，左图为叶绿素含量(左图，Chl-a(mg/L)是叶绿素含量单位为(mg/L)，右图，Algicidal ratio是溶藻效率，横坐标Time(d)是时间，单位为天。

图2、(a)T15在LB平板上的菌落特征；(b)T15在光学显微镜下的形态。

图3、基于16S rDNA基因序列分析的T15菌株的进化树。

图4、T15在不同光照条件下与M.aeruginosa NIES-843培养6天后的溶藻率，Algicidal ratio是溶藻效率，dark:light＝14:10是14小时黑暗10小时光照，full dark全暗,full light全光照。

图5、T15在不同温度条件下与M.aeruginosa NIES-843培养6天后的溶藻率Algicidal ratio是溶藻效率，Temperature(℃)温度(摄氏度)。

图6、T15原菌液，无细胞滤液及洗涤菌体对M.aeruginosa NIES-843的溶藻效果Algicidal ratio是溶藻效率，Culture(原菌液)，Cell-free filtrate(无细胞滤液)Washed cells(洗涤菌体)。

图7、(a)菌株T15的生长曲线(OD₆₀₀ 600纳米的吸光值，表征细胞数目)；(b)T15不同生长时期对M.aeruginosa NIES-843的溶藻效果Algicidal ratio是溶藻效率，Time(h)是时间，单位为小时。

图8、(a)添加不同金属离子培养条件下T15不同组分的溶藻效果Culture(原菌液)，Cell-free filtrate(无细胞滤液)Washed cells(洗涤菌体)，Control是对照，1/5LB是加1/5LB培养基，Mn²⁺,Fe³⁺,Zn²⁺,Mg²⁺,Ca²⁺,K⁺,Co²⁺分别是锰，铁，锌，镁，钙，钾，钴离子；(b)分别添加Mn²⁺、Fe³⁺和Zn²⁺培养条件下T15无细胞滤液的溶藻效果，Algicidal ratio是溶藻效率，横坐标Time(d)是时间，单位为天。

图9、不同Mn²⁺浓度培养条件下无细胞滤液的溶藻效果Algicidal ratio是溶藻效率，横坐标Concentration of Mn²⁺(μmol/L)锰离子浓度单位为(μmol/L)。

图10、加入Mn²⁺培养条件下无细胞滤液不同稀释度的溶藻效果Algicidal ratio是溶藻效率，横坐标dilution times是稀释倍数。

图11、(a)与T15处理自然水华20天时的溶藻效果；(b)经T15处理20天时自然水华的叶绿素含量Chl-a(mg/L)是叶绿素含量单位为(mg/L)，横坐标Control是对照，1/5LB(Mn² ⁺)是加1/5LB和锰离子，Culture(Mn²⁺)是加菌液和锰离子。

具体实施方式

Microcystis aeruginosa(铜绿微囊藻)NIES-843购买于日本国立环境研究所微生物菌种保藏中心，其它供试藻株购买于中国科学院淡水藻种库。培养条件为温度28℃，光照强度50μE m^-2s^-1，光暗循环(光︰暗＝14h︰10h)，采用MA(Medium for Alga)培养基和BG11(Blue-Green Medium)培养基进行培养，配方见表1～3。

表1 MA培养基配方

表2 BG11培养基配方

表3 A5*的组成

组分	浓度(g/L)
		H₃BO₃	2.86
MnCl₂·4H₂O	1.86
		ZnSO₄·7H₂O	0.22
NaMoO₄·2H₂O	0.39
		CuSO₄·5H₂O	0.08
Co(NO₃)₂·6H₂O	0.05
		Distilled water(去离子水)	1

表4实施例中用到的主要仪器

实施例1溶藻菌的分离

①自生活垃圾场称取10.0g土样，加到90mL无菌水中，放入适量的玻璃珠，摇匀；

②使用无菌水对混合液进行梯度稀释，稀释倍数为10¹～10⁷，得到不同稀释倍数的水样，在LB固体培养基(配方见表5)平板上进行涂布；

③在28℃恒温培养箱中进行培养，在平板上挑取外观形态具有差异的细菌，在LB固体培养基平板上进行再划线培养，直到出现单菌落。将挑完菌后的平板继续放入恒温培养箱中培养，并观察有无形态差异较大的细菌出现，若有，重复操作；

④挑取单菌落，使用1/5LB在180rpm，28℃的条件下培养至液体变浑浊，按照5％(v/v)的比例将菌液加入到装有30mL培养至对数期的Microcystis aeruginosa NIES-843(以下简称843)的三角瓶中，等体积1/5LB加入到藻液中作为空白对照；

⑤每组设置3个平行，放在人工气候培养箱中培养，培养条件：温度28℃，光照强度50μE m^-2s^-1，光暗循环(光︰暗＝14h︰10h)。每天手动摇瓶3次，并观察藻液的情况。

从土壤中筛选出了多株具有形态差异的菌株，按5％(v/v)的比例在843藻液中加入培养好的不同种类菌液进行培养，等体积的1/5LB液体培养基加入藻液中作为空白对照。经过观察，发现其中命名为T15的菌株与843共培养6天后，藻细胞死亡现象最为明显，相比于其它分离得到的菌株，其对藻细胞的影响更显著，如图1(a)所示。明显看到，加入1/5LB液体培养基的对照组藻液颜色深绿，藻细胞生长未受到明显影响，生长较好；而与溶藻菌T15菌液培养的藻液，在第6天时，藻液呈现出白色浑浊状，表明藻细胞在溶藻菌T15的作用下，正常生长受到严重影响，并最终死亡。

观察溶藻现象并每天取样测定Chl-a(叶绿素a)含量，叶绿素a是藻类光合作用的核心因素，其含量是反映藻类生长的最直接的参数。因此，测定叶绿素a含量能体现藻的生长状态或受胁迫状态。结果如图1(b)左图所示。未经溶藻菌T15处理的藻细胞Chl-a含量随时间的增长而逐渐上升，而藻细胞与T15培养体系下，其Chl-a含量逐渐下降，到第6天时，其Chl-a含量仅为0.33mg/L。以溶藻率为指标，结果如图1(b)右图所示，T15溶藻率在前4天内迅速升高，之后缓慢升高逐渐趋于稳定，在第6天时，达到90.77％，表明溶藻菌T15对843具有较好的溶藻活性。

分离得到的菌株以20％甘油比例储存于-80℃。因需降低LB培养基本身对藻细胞生长的影响，后续实验采用1/5LB培养基在28℃、180rpm转速下培养溶藻菌。

表5 Luria-Bertani(LB)培养基配方

组分	浓度(g/L)
		Tryptone胰蛋白胨	10
Yeast extract酵母提取物	5
		NaCl	5
琼脂粉	1.6％(m/v，固体时添加)

实施例2菌株鉴定

(1)菌株T15的形态观察

将分离、纯化得到具有溶藻效果的菌株T15，使用LB固体培养基平板进行稀释涂布并置于28℃恒温培养箱中培养至出现单菌落，肉眼观察其形态特征；挑取单菌落于LB液体培养基中，培养至液体浑浊，取少量菌液于光学显微镜下观察其形态特征。

从图2(a)中可以看到，菌落颜色呈现灰白色，表面粗糙褶皱，呈现圆形或扁平状，凸起，边缘不整齐；图2(b)中菌株T15呈现杆状形态，菌体端部位置观察到有呈圆形或卵圆形的芽孢，直径大于菌体。

(2)菌株T15的分子鉴定

使用LB液体培养基将菌株T15培养至对数期，以菌液作为模板，以通用引物27F(SEQ ID No.1，5’-agagtttgatcatgg ctcag-3’)/1492R(SEQ ID No.2，5′-tacggttacctgttacgactt-3′)进行16s rDNA基因片段(SEQ ID No.3)的PCR扩增。反应体系如下：Taq Mix酶12.5μL、Primer 1 1μL、Primer 2 1μL、DNA模板1μL和dd H₂O 9.5μL。PCR反应条件为：95℃先预变性2min，然后95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，进行30个循环；最终在72℃延伸5min。将PCR产物送至上海生物工程股份有限公司进行测序，将获得的序列在EzBioCloud数据库(https://www.ezbiocloud.net/)里搜索下载与其同源性高的多个序列。根据Neighbor-Joining方法，使用DNAMAN与MEGA 5软件构建系统发育树，设置bootstrap值为1000。结果见图3。菌株T15属芽孢杆菌属，与之亲缘关系较近的是Bacillussafensis subsp.safensis，结合T15的16S rDNA序列比对结果和表观特征分析，初步将其鉴定为Bacillus safensis(沙福芽孢杆菌)。

SEQ ID No.3，16s rDNA：

ccttcttgtcaccttcggcggctggctccataaaggttacctcaccgacttcgggtgttgcaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccagcttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaacagatttatgggattggctaaaccttgcggtcttgcagccctttgttctgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactgaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgtccccgaagggaaagccctatctctagggttgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactaaggggcggaaaccccctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagttacagaccagagagtcgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccactctcctcttctgcactcaagtttcccagtttccaatgaccctccccggttgagccgggggctttcacatcagacttaagaaaccgcctgcgagccctttacgcccaataattccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttaggtaccgtcaaggtgcgagcagttactctcgcacttgttcttccctaacaacagagctttacgatccgaaaaccttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgtcgccttggtgagccattaccccaccaactagctaatgcgccgcgggtccatctgtaagtgacagccgaaaccgtctttcatccttgaaccatgcggttcaaggaactatccggtattagctccggtttcccggagttatcccagtcttacaggcaggttacccacgtgttattggcccgtccgccgctaacatccgggagcaagctcccttctgtccgctcgacttgcatgtatagcaccccgcctgcac

实施例3溶藻特异性

使用1/5LB液体培养基将溶藻菌T15培养1天后，以5％(v/v)比例接种至不同的供试藻株(表6，供试藻株购买于中国科学院淡水藻种库)中，同时将等体积的1/5LB液体培养基加入到藻液中作为空白对照，每组设置3个平行，置于人工气候培养箱中培养，观察藻液变化并取样测Chl-a含量，计算溶藻率。

通过下述公式计算溶藻率：溶藻率(％)＝(C₀-Ct)/C₀×100％；其中，C₀指对照组的Chl-a的含量，C_t指处理组的Chl-a的含量。

根据Wintermans等人的方法(Wintermans JF,Demots A.SPECTROPHOTOMETRICCHARACTERISTICS OF CHLOROPHYLLS A AND B AND THEIR PHEOPHYTINS IN ETHANOL[J].Biochimica Et Biophysica Acta.1965；109(2):448-+.)稍作修改。取一定体积(V₁)的藻液在室温条件下，10,000rpm离心10min，弃去上清；将收集得到的藻细胞反复冻融3次使藻细胞裂解；加入一定体积(V₂)的95％乙醇重悬样品，置于4℃下过夜；将样品在10,000rpm，常温条件下，离心10min，取上清液测定其在649nm、665nm、750nm处的吸光度值，并根据下述公式计算Chl-a的含量：Chl-a(mg/L)＝[(A665-A750)×13.7-(A649-A750)×5.76]×V₂/V₁。

其中，Microcystis viridis FACHB-1337、Microcystis aeruginosa FACHB-905、Cyanothece sp.PCC 7822、Microcystis wesenbergii FACHB-1112、Cyanothece sp.ATCC51142、Anabaena sp.PCC 7120、Synechocystis sp.PCC 6803及Aphanizomenon sp.FACHB-1416属于原核蓝藻；Chlorella vulgaris UTEX 395、Scenedesmus obliquus FACHB-417、Oocystis sp.FACHB-1426及Pediastrum sp.FACHB-932属于真核绿藻。根据表6中的数据，可以看出，在培养6天后，T15对原核藻和真核藻的溶藻效果之间具有明显差异。T15对于实验中的原核藻均表现出溶藻效果，特别是对于微囊藻具有较其他藻更高的溶藻率。此外，Cyanothece sp.PCC 7822是属于产胞外多糖较多的藻株，但T15对其溶藻效果依然较好，胞外多糖的含量对于T15的溶藻效果影响不大。T15对鱼腥藻Anabaena sp.PCC 7120溶藻活性较低，甚至对束丝藻Aphanizomenon sp.FACHB-1416未表现出明显的溶藻效果。而T15对于真核绿藻的最高溶藻率仅为30％左右，甚至对于Pediastrum sp.FACHB-932和Oocystissp.FACHB-1426等出现了促进其生长的作用。结果表明，T15对于单细胞原核藻具有较高的溶藻活性，而对于丝状藻及真核藻溶藻活性则较差。

表6 T15对不同种类藻细胞的溶藻活性

实施例4光照、温度对溶藻效果的影响测定

(1)不同光照条件：

使用1/5LB液体培养基将溶藻菌T15培养1天后，以5％(v/v)比例接种至843藻液中，同时将等体积的1/5LB液体培养基加入到藻液中作为空白对照，每组设置3个平行，置于24h全光照，24h全黑暗，光暗循环(光照︰黑暗＝14h︰10h)的条件下进行培养，并取样测定Chl-a含量，计算溶藻率。

培养6天，取样测定计算各条件下的溶藻率。如图4所示，可以直观明显的看到，在全黑暗，即实验全程中没有光照参与的条件下，其溶藻率与光暗循环及全光照条件下相比，具有非常显著的差异。结果表明，光照是溶藻菌T15溶藻的一个重要限制因素。

(2)不同温度条件：

将不同光照条件换为不同温度(23℃，28℃，33℃)条件，其余操作同(1)。培养6天，取样测定计算各温度条件下T15的溶藻率，结果如图5所示。在第6天时，23℃，28℃，33℃条件下T15的溶藻率分别达到73.65％、88.26％和87.39％，23℃条件下的溶藻率与28℃和33℃相比，差异明显。

实施例5溶藻菌溶藻方式测定

为探究T15的溶藻方式为直接溶藻或间接溶藻。将用1/5LB液体培养基培养1天的T15菌液，在6,000rpm，室温条件下，离心10min，得到上清液和菌体，然后用MA液体培养基洗涤菌体细胞3次，去除代谢物，最后用等体积的MA液体培养基重悬菌体；使用0.22μm的无菌滤头对上清液进行过滤除菌，得到无细胞过滤液。将T15的原菌液、洗涤后的菌体以及无细胞过滤液按照5％(v/v)的比例接种至843藻液中，等体积的1/5LB液体培养基及MA液体培养基加入到藻液中作为空白对照，每组设置3个平行，放置在人工气候培养箱中培养。每天手动摇瓶3次，观察藻液变化，在共培养的第6天取藻液样测定计算溶藻率。

结果如图6所示，从图中可以看到，共培养6天后，溶藻菌T15菌液对843的溶藻率为86.44％，无细胞滤液和菌体的溶藻率分别为42.33％和21.91％，无细胞滤液和菌体的溶藻率远远低于菌液。

实施例6溶藻菌不同生长时期无细胞滤液溶藻效果测定

将用1/5LB液体培养基培养不同时间的T15菌液在6,000rpm，室温下离心10min，得到不同培养时间的上清液，使用0.22μm的无菌滤头将上清液进行过滤除菌，得到无细胞过滤液。将无细胞过滤液以5％(v/v)的比例接种至843藻液中，藻液中加入等体积的1/5LB液体培养基作为空白对照，每组设置3个平行，人工气候培养箱中培养。每天手动摇瓶3次，观察溶藻现象，在培养的第6天取藻液样测定计算溶藻率。

溶藻菌T15的生长曲线如图7(a)所示。从图中可以看出T15的各生长阶段时间区间大致为：适应期(0～6h)，对数期(6～16h)，稳定期(18～24h)，之后进入衰亡期。根据生长曲线测定结果，分别选取培养3、10、24h的T15菌液进行溶藻实验，探究不同生长期的T15的溶藻效果差异。将不同生长时期的T15菌液按照5％(v/v)的比例接种到843藻液中，共培养6天后，取样测定计算溶藻率，结果如图7(b)所示。其溶藻率分别达到77.88％、81.99％、84.64％，不同生长阶段的T15均表现出了较好的溶藻效果，且差异不大。处于适应期的T15也表现出了较好的溶藻效果，推测其在培养体系下，利用藻细胞代谢物，生长繁殖，最终有着较高的溶藻活性。结果表明，溶藻菌T15所处于的生长阶段不影响其对843的溶藻活性。

实施例7添加不同离子培养溶藻菌的各组分溶藻效果测定

将MA培养基中的金属离子溶液(Ca(NO₃)₂·4H₂O、KNO₃、MgCl₂·6H₂O、CoCl₂·6H₂O、MnCl₂·4H₂O、FeCl₃·6H₂O、ZnCl₂)分别添加到1/5LB液体培养基中，使其终浓度为在MA液体培养基中的浓度，分别培养溶藻菌T15。将经过培养得到的T15菌液在6,000rpm，室温条件下，离心10min，得到上清液，使用0.22μm的无菌滤头进行过滤除菌，得到无细胞过滤液。再将无细胞过滤液以5％(v/v)的比例接种至843藻液中，藻液中加入等体积的1/5LB液体培养基作为空白对照，每组设置3个平行，于人工气候培养箱中培养。每天手动摇瓶3次，观察藻液变化情况。

结果可见图8(a)。从图中可以看出，添加Mn²⁺、Fe³⁺和Zn²⁺较添加其它离子的培养条件下，T15的无细胞滤液溶藻效果明显。同时如图8(b)所示，在添加Mn²⁺、Fe³⁺和Zn²⁺培养后的T15无细胞滤液较1/5LB液体培养基的T15无细胞滤液溶藻率都有所提高。添加Mn²⁺培养的T15无细胞滤液溶藻率较其他处理组较高，后续实验选择Mn²⁺来研究促进T15的溶藻效果的原因。

为确定不同Mn²⁺浓度对T15无细胞滤液的溶藻效果影响，探究较低的促进溶藻活性的浓度。在1/5LB培养基中添加不同浓度的Mn²⁺，如图9所示(其中25.48μmol/L为MA中Mn²⁺浓度)，培养T15，以其无细胞滤液进行溶藻实验，未添加Mn²⁺的1/5LB液体培养基培养的T15无细胞滤液作为对照。Mn²⁺浓度在6.37～50.96μmol/L的范围内，T15的无细胞滤液的溶藻率没有显著差异，为保持溶藻活性的实验一致性，选择Mn²⁺浓度为25.48μmol/L继续后续实验。

为进一步研究含Mn²⁺培养条件下溶藻菌T15无细胞滤液的特性，将在含Mn²⁺培养条件下得到的T15无细胞滤液使用1/5LB液体培养基稀释不同的倍数，再将其按照5％(v/v)比例加入到843藻液中。培养6天后，取样测定计算溶藻率，具体实验操作同上，结果如图10所示。将含Mn²⁺培养的T15无细胞滤液稀释4倍，其溶藻率与不含Mn²⁺培养的T15无细胞滤液溶藻率相近，但添加与不添加Mn²⁺培养T15，两者之间的OD₆₀₀值远远达不到4倍之差。

实施例8溶藻菌对水华水样的溶藻测试

溶藻菌T15经培养基中培养1天后，以10％(v/v)的比例接种至微囊藻水华水样，水样采集自养殖鱼塘，加入等量培养基作为对照，实验体系为3L。在28℃，180rpm，光暗循环(光照︰黑暗＝14h︰10h)的光照条件下震荡培养。观察水样状况，隔一段时间取样进行Chl-a含量测定。结果可见图11，在处理20d后，从图11(a)中可以明显看到加入菌液的处理组中藻液严重黄化，其叶绿素含量为0.34mg/L(可见图11(b))，水样组的叶绿素含量为0.83mg/L，加入含Mn²⁺的培养基的处理组叶绿素含量为0.98mg/L。加入含Mn²⁺的培养基的处理组中的叶绿素含量稍高于水样组中的叶绿素含量，这可能是由于添加1/5LB培养基，藻液中有机物含量增多，有利于藻的生长。但加入菌液的处理组中，叶绿素含量远低于其余两处理组。实验结果表明T15对以微囊藻为优势藻属的自然水华治理具有较好的效果。

通常，溶藻菌的溶藻实验以实验室培养的单细胞形式的藻类作为研究对象，而自然条件下爆发的水华，藻类一般以藻菌群体的形式存在。因此，即使溶藻菌在实验室条件下具有较高溶藻活性，也经常被质疑处理自然水华是否具有活性。在本发明中，进行了T15对自然水华水样的溶藻实验，结果表明，T15能够有效地杀死了以群体形式存在的微囊藻。在自然条件下，T15可作为潜在的控制蓝藻水华的生物资源，以更加安全、生态的方式调节浮游植物群落组成，改善水体环境。

序列表

<110> 西南大学

<120> 沙福芽孢杆菌Bacillus safensis T15及其用途

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtttgat catggctcag 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tacggttacc tgttacgact t 21

<210> 3

<211> 1455

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccttcttgtc accttcggcg gctggctcca taaaggttac ctcaccgact tcgggtgttg 60

caaactctcg tggtgtgacg ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgcggca 120

tgctgatccg cgattactag cgattccagc ttcacgcagt cgagttgcag actgcgatcc 180

gaactgagaa cagatttatg ggattggcta aaccttgcgg tcttgcagcc ctttgttctg 240

tccattgtag cacgtgtgta gcccaggtca taaggggcat gatgatttga cgtcatcccc 300

accttcctcc ggtttgtcac cggcagtcac cttagagtgc ccaactgaat gctggcaact 360

aagatcaagg gttgcgctcg ttgcgggact taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg 420

acaaccatgc accacctgtc actctgtccc cgaagggaaa gccctatctc tagggttgtc 480

agaggatgtc aagacctggt aaggttcttc gcgttgcttc gaattaaacc acatgctcca 540

ccgcttgtgc gggcccccgt caattccttt gagtttcagt cttgcgaccg tactccccag 600

gcggagtgct taatgcgtta gctgcagcac taaggggcgg aaacccccta acacttagca 660

ctcatcgttt acggcgtgga ctaccagggt atctaatcct gttcgctccc cacgctttcg 720

ctcctcagcg tcagttacag accagagagt cgccttcgcc actggtgttc ctccacatct 780

ctacgcattt caccgctaca cgtggaattc cactctcctc ttctgcactc aagtttccca 840

gtttccaatg accctccccg gttgagccgg gggctttcac atcagactta agaaaccgcc 900

tgcgagccct ttacgcccaa taattccgga caacgcttgc cacctacgta ttaccgcggc 960

tgctggcacg tagttagccg tggctttctg gttaggtacc gtcaaggtgc gagcagttac 1020

tctcgcactt gttcttccct aacaacagag ctttacgatc cgaaaacctt catcactcac 1080

gcggcgttgc tccgtcagac tttcgtccat tgcggaagat tccctactgc tgcctcccgt 1140

aggagtctgg gccgtgtctc agtcccagtg tggccgatca ccctctcagg tcggctacgc 1200

atcgtcgcct tggtgagcca ttaccccacc aactagctaa tgcgccgcgg gtccatctgt 1260

aagtgacagc cgaaaccgtc tttcatcctt gaaccatgcg gttcaaggaa ctatccggta 1320

ttagctccgg tttcccggag ttatcccagt cttacaggca ggttacccac gtgttattgg 1380

cccgtccgcc gctaacatcc gggagcaagc tcccttctgt ccgctcgact tgcatgtata 1440

gcaccccgcc tgcac 1455

Claims

1.沙福芽孢杆菌（Bacillus safensis ）T15，其保藏号为GDMCC No:62447。

2.权利要求1所述沙福芽孢杆菌（Bacillus safensis）T15在溶藻中的用途，所述溶藻的藻类为原核蓝藻和/或真核绿藻；

所述原核蓝藻为绿色微囊藻（Microcystis viridis）、铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）、蓝杆藻（Cyanothece sp.）ATCC 51142和/或惠氏微囊藻（Microcystis wesenbergii）；

所述真核绿藻为小球藻（Chlorella vulgaris）。

3.采用权利要求1所述沙福芽孢杆菌（Bacillus safensis ）T15溶藻的方法，其特征在于，包括如下步骤：将沙福芽孢杆菌（Bacillus safensis ）T15接种至1/5LB液体培养基，培养后收集菌液、无细胞滤液或菌体，投入到待处理水体中进行溶藻；

所述溶藻的藻类为原核蓝藻和/或真核绿藻；

所述真核绿藻为小球藻（Chlorella vulgaris）。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述1/5LB液体培养基中添加金属离子，金属离子为Ca²⁺、K⁺、Mg²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Fe³⁺和/或Zn²⁺。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述沙福芽孢杆菌（Bacillus safensis）T15的培养时间为3～24h。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述溶藻过程中光照时间为14～24h/天。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述溶藻温度为28～33℃。