CN115261257B - 一株来源于青储草料的富硒枯草芽孢杆菌l11及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明实施例公开了一株来源于青储草料的富硒枯草芽孢杆菌L11。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)L11，于2022年3月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022309。本发明从青储草料中分离获得的菌株，不仅耐硒能显著转化有机硒，最高能耐30mmol/L的亚硒酸钠，48h对3mmol/L的无机硒的转化率高达98.93％，而且对常见的霉菌等病害具有明显的拮抗作用。

Description

一株来源于青储草料的富硒枯草芽孢杆菌L11及其应用

技术领域

本发明实施例涉及微生物技术领域，具体涉及一株来源于青储草料的富硒枯草芽孢杆菌L11及其应用

背景技术

硒元素是人和动植物生命活动不可或缺的微量元素，是人体内组成谷胱甘肽过氧化物酶的重要元素。研究表明硒元素可以提高机体的免疫力且能够增加机体抗氧化性能，减少自由基对机体的伤害，达到抗癌作用。硒在自然界的含量很低，我们国家缺硒地区达到了72％，甚至有30％的地区属于严重缺硒；合理的膳食补硒显得尤为重要。同时，有机硒因其毒性低，吸收和利用率高的特点，被公认为是人们膳食补硒的最佳途径。植食性动物通过摄入富硒饲料，通过自身转化将硒元素进一步转化为有机态硒，不仅能够提高动物自身免疫力和生长代谢，而且能进一步为人类提供更加安全可靠的硒蛋白、硒核酸等高效有机硒。

微生物突变和适应环境能力非常强，自然界中存在着丰富的对无机硒具有代谢能力的微生物类群，这类微生物可以将无机硒高效转化成可供动植物利用的有机态的硒蛋白、硒核酸、硒多糖。有益菌常被用来运用于工业富硒以及农业富硒，生产富硒肥料或富硒饲料。因此，天然的具有高效聚硒、富硒及硒转化的微生物菌种的筛选、鉴定和开发利用具有重要的研究价值和广阔的应用前景。

发明内容

为了解决现有技术中缺乏能够高效转化有机硒的、可用于富硒农产品生产的微生物菌剂的现状，本发明实施例提供一株来源于青储草料的富硒枯草芽孢杆菌L11。

为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

根据本发明实施例的第一方面，提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)L11，于2022年3月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022309。

根据本发明实施例的第二方面，提供一种含如上所述的枯草芽孢杆菌L11的菌剂。

所述菌剂可在本领域常用培养基的基础上发酵获得。一般地，含枯草芽孢杆菌L11的液态菌剂中活菌含量为10～30×10⁸cfu/mL，含枯草芽孢杆菌L11的固态菌剂中活菌含量为80～150×10⁸cfu/g。

根据本发明实施例的第三方面，提供一种利用如上所述的枯草芽孢杆菌L11制备的富有机硒菌剂，在发酵培养中，使用的培养基中亚硒酸钠的浓度为3.0±1mmol/L。

根据本发明实施例的第四方面，提供一种利用如上所述的富硒枯草芽孢杆菌L11生产生物源纳米硒的方法，将枯草芽孢杆菌L11静息细胞接种于含亚硒酸钠的培养基中，进行发酵培养，发酵结束后，向发酵产物中加入溶菌酶，经分离纯化获得纳米硒；其中，所述培养基中亚硒酸钠的浓度为3.0±1mmol/L。

进一步地，所述培养基的配方为：葡萄糖20±2g/L、蛋白胨15±2g/L、氯化钠5±1g/L、牛肉膏0.5±0.1g/L，溶剂为水。

进一步地，所述发酵培养的条件为：通气比为1:(0.8-1.2)，搅拌转速为150-200r/min，培养温度为35-40℃，培养时间为4±1d。

根据本发明实施例的第五方面，提供一种生物源纳米硒，由如上任一项所述的方法制备得到。

进一步地，所述生物源纳米硒的粒径为80-100nm。

根据本发明实施例的第六方面，提供如上所述的枯草芽孢杆菌L11、菌剂、富有机硒菌剂、或生物源纳米硒在制备食品、保健品、禽畜饲料中的应用。

进一步地，在制备禽畜饲料中的应用中，禽畜饲料中枯草芽孢杆菌L11的添加量为1-10×10⁵CFU/g；或，禽畜饲料中富有机硒菌剂的添加量为1-10g/25kg。

本发明实施例具有如下优点：

1、本发明从青储草料中分离获得枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)L11，该菌不仅耐硒能显著转化有机硒，最高能耐30mmol/L的亚硒酸钠，48h对3mmol/L无机硒的转化率高达98.93％，而且对常见的霉菌等真菌病害具有明显的拮抗作用。

2、本发明利用枯草芽孢杆菌L11生产的生物源纳米硒，呈球形或近似球形，粒径为80-100nm，此粒径范围的纳米硒可以被动植物细胞吸收，生物利用率极高，同时该方法具有操作简单、制备方便等优点，适用于工业化大规模生产。

3、本发明利用枯草芽孢杆菌L11生产的菌剂、富有机硒菌剂或生物源纳米硒作为饲料添加剂，能够提高禽畜富硒转化及促进牲畜生长提高免疫能力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

图1是枯草芽孢杆菌L11的菌落外观和显微图片。

图2是枯草芽孢杆菌L11将亚硒酸钠转化为有机硒效果，A.固体培养基上菌落状况，B.二级发酵液转化亚硒酸钠状况。

图3是枯草芽孢杆菌L11对青储过程中主要致腐真菌抑菌效果，A.对黄曲霉菌的抑制；B.对腐皮镰刀菌的抑制；C.对黑葡萄穗霉的抑制；D.对炭疽菌的抑制。

图4是枯草芽孢杆菌L11与相关种的16S rDNA序列系统发育分析，注：MEGA4.1软件，临位连接法显示菌株L11与相关种的16S rDNA系统发育树，进行1000次的相似度重复计算，图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50％数值，上标的“T”表示模式菌株，(B.,Bacillus)。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

从青储草料中分离富硒益生菌的方法

1、富集

将青储成熟的草料样本(湖北省红安县七里坪镇富硒奶牛养殖基地青贮玉米杆草垛)100克，切碎，加入到含有10克石英砂的无菌蒸馏水500mL中浸泡2小时后，振荡，取100mL洗脱液，加入10克左右粗制红糖，25℃，摇床100rpm振荡培养24h得到菌悬液。

2、初筛

将步骤1中得到的菌悬液按照10^-2、10^-3、10^-4、10^-5不同的稀释倍数进行稀释，分别取100μL稀释后的菌悬液均匀涂布于含亚硒酸钠分别为100mg/L，200mg/L，500mg/L，1000mg/L，1500mg/L的无菌的牛肉膏蛋白胨固体培养基的培养皿上，30℃培养箱中倒置培养48h，观察生长情况。

3、分离纯化

挑取在含硒1500mg/L的牛肉膏蛋白胨固体培养基上仍有生长的深红色菌株，在无菌的牛肉膏蛋白胨固体培养基的培养皿上平板划线，然后在25℃培养箱中倒置培养48h，挑取红色菌落重复划线三次，再分离出红色单菌落，将最后的单菌落接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中培养，得到单菌悬液。

4、梯度稀释平板法复筛

配制浓度分别为l.5g/L、1g/L、500mg/L、200mg/L、0mg/L的亚硒酸钠溶液，分别倒入10mL融化的不加硒肉膏蛋白胨固体培养基中，将培养皿倾斜大约5mm，等待冷凝后，置于水平，再倒入等体积融化的加硒琼脂培养基，室温放置3h制成线性梯度平板；取步骤3得到的单菌悬液1mL加入到9mL无菌水中混合均匀，然后再稀释到10^-3、10^-4、10^-5不同的稀释倍数，分别取100μL稀释后的单菌悬液涂布于线性梯度平板上，观察菌株在平板上的生长状态，挑选富硒效果较好且生长较好的菌株，为所筛选的高富硒微生物。

所述牛肉膏蛋白胨液体培养基的配方为：牛肉膏0.5g/L，蛋白胨1.0g/L，NaCl0.5g/L，pH为7.0。所述牛肉膏蛋白胨固体培养基的配方为：牛肉膏0.5g/L，蛋白胨1.0g/L，NaCl 0.5g/L，2％的琼脂，pH为7.0。所述含硒牛肉膏蛋白胨液体培养基的配方为：牛肉膏0.5g/L，蛋白胨1.0g/L，NaCl 0.5g/L，硒1000mg/L，pH为7.0。

5、抑菌富硒微生物二筛

以发酵不良的青储饲料中常见的致病真菌：黄曲霉菌、腐皮镰刀菌、黑葡萄穗霉、炭疽菌作为指示菌株，采取平板对峙培养法和抑菌圈法将步骤4筛选出的菌株进行二次筛选，取对上述致病真菌有明显抑菌效果(抑菌圈直径明显)的菌株，为富硒益生菌菌株，进行进一步鉴定。结果见表1。

表1.青贮饲料中高富硒微生物菌株对病原菌的抑制效果

菌株编号	黄曲霉菌	腐皮镰刀菌	黑葡萄穗霉	炭疽菌
					L21	-	++	-	+
L48	-	-	-	-
					L109	-	-	+	++
L77	+	-	+	-
					L11	+	+++	+++	+++

注：(1)对黄曲霉、腐皮镰刀、炭疽菌菌，抑菌圈直径≤10mm的标“-”；10mm＜抑菌圈直径≤12mm的标“+”；12mm＜抑菌圈直径≤15mm的标“++”；15mm＜抑菌圈直径≤20mm的标“+++”；抑菌圈直径＞20mm的标“++++”。

(2)对黑葡萄穗霉菌，抑菌带宽度≤1mm的标“-”；1mm＜抑菌带宽度≤2mm的标“+”；2mm＜抑菌带宽度≤5mm的标“++”；5mm＜抑菌带宽度≤10mm的标“+++”；抑菌带宽度＞10mm的标“++++”。

从表1可以看出菌株L11对黄曲霉菌、腐皮镰刀菌、黑葡萄穗霉、炭疽菌的拮抗作用强。对筛选得到的菌株L11进行传代培养5次，并对其进行保藏。

实施例2

菌株L11的鉴定

1、形态特征

染色：按本领域常规方法进行革兰氏染色，发现该菌株为革兰氏阳性菌。

形态特征：于LB培养基上37℃培养24小时，观测菌落形态及颜色(图1A)；取菌体图片，染色后用光学显微镜观察菌体形态(图1B)。结果描述如下：菌落白色，不透明，无皱褶；菌体为杆状，含有一个芽孢，具有运动性。

2、生理生化特征：参照API 50CHE和API 20E说明书进行，结果见表2。

表2.菌株L11的生理生化特征

注：表中的“+”表示实验结果为阳性，“-”表示实验结果为阴性。

3、分子生物学分析鉴定

(1)DNA提取

取单菌落接种于5ml相应的培养基中，37℃温育24小时。取1.0ml菌液于1.5ml离心管中，13,000rpm离心2min，弃上清。沉淀重悬于1.0ml 0.85％NaCl中。室温13,000rpm离心2min，弃上清。沉淀重悬于550μl 1×TE中。加17μl溶菌酶(35mg/ml)，37℃温育30min。加3μl蛋白酶K(20mg/ml)，37℃温育30min。加30μl 10％SDS，37℃温育30min。加100μl 5M NaCl充分混匀。加80μl CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃水浴10min。加等体积(0.7～0.8ml)氯仿/异戊醇(24:1)，轻轻振荡混匀。室温，13,000rpm离心10min。将上清液转移到一新1.5ml离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)轻轻振荡混匀。13,000rpm离心10min。将上清液转移到一新1.5ml离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀4小时。13,000rpm离心10min，去上清液得到基因组DNA沉淀。加入70％乙醇漂洗2次，晾干后溶于50μL TE中，即得到总DNA。

(2)扩增16S rDNA

以总DNA为模板，细菌16S rDNA通用引物(正向引物：5’-AGA GTT TGA TCC TGGCTC AG-3’；反向引物：5’-AAG GAG GTG ATC CAC CC-3’)扩增16S rDNA。扩增反应体系为100μl：Taq(5U/μl)0.8μl；10×PCR Buffer(Mg²⁺Plus)10μl；dNTP Mixture(2.5mM/each)8μl；模板DNA 2.5ng；引物F1(10μmol/L)2μl，引物R1(10μmol/L)2μl；ddH₂O补足到100μl。反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性1min,57℃退火1min,72℃延伸1min20sec，反应30循环；72℃补齐延伸5min。

(3)16S rDNA序列分析

由上海生工对反应条带进行测序，16S rDNA基因序列见SEQ ID NO:1。测序结果与GenBank中所登录的细菌16S rDNA序列进行比对分析，基因同源性达到99％以上。

结合形态学、生理生化及16S rDNA序列分析，根据《Bergey’s Mannual ofDeterminative Bacteriology》(Holt,J.G.,Gibbons,N.E.,1994)，确定菌株L11为枯草芽孢杆菌。

将该菌株进行保藏，保藏名称为：枯草芽孢杆菌L11(Bacillus subtilis L11)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏日期：2022.3.24，保藏编号为CCTCC NO：M 2022309。

实施例3

枯草芽孢杆菌L11对青储饲料中常见病原真菌的抑制作用

按照本领域的常规操作方法，以发酵不良的青储饲料中常见的致病真菌：黄曲霉菌、腐皮镰刀菌、黑葡萄穗霉、炭疽菌作为指示菌株，采用平板对峙培养法或抑菌圈法培养枯草芽孢杆菌L11，并考察枯草芽孢杆菌L11对上述每种指示菌的抑制能力。

枯草芽孢杆菌L11对黄曲霉菌、腐皮镰刀菌、黑葡萄穗霉、炭疽菌的抑菌效果如图3所示。

从图3可以看出枯草芽孢杆菌L11对黄曲霉菌、腐皮镰刀菌、黑葡萄穗霉、炭疽菌均具有明显的抑制作用。

由此可见，枯草芽孢杆菌L11在防治由黄曲霉菌、腐皮镰刀菌、黑葡萄穗霉、炭疽菌中的至少一种引起的禽畜病害的应用中，具有良好的应用前景。

实施例4

枯草芽孢杆菌L11对亚硒酸钠耐受浓度测试

将枯草芽孢杆菌L11菌种按照1％接种量接种至含有亚硒酸钠浓度分别为：0mmo/L、1mmo/L、3mmo/L、5mmo/L、10mmo/L、20mmo/L、30mmo/L及40mmo/L的LB培养基中，37℃、120rmp条件下培养24h后，以接种1％L11菌株的LB液体培养基为标准调0，测量各浓度培养基培养的菌悬液OD600值来检验L11对亚硒酸钠浓度的耐受性，结果显示(表3)：L11在亚硒酸钠浓度为1mmo/L、3mmo/L、5mmo/L时，24h后菌悬液OD600值均达到3.0以上，与未加亚硒酸钠的菌株生长情况差别不大，说明亚硒酸钠在5mmo/L以下时对枯草芽孢L11生长影响不大，当亚硒酸钠浓度达到30mmo/L时，24h时L11菌悬液开始进入对数生长期，而为40mmo/L时L11菌体生长比较缓慢；因此，判断L11对亚硒酸钠耐受浓度可达到30mmo/L。

表3.枯草芽孢杆菌L11对亚硒酸钠耐受浓度测定

实施例5

枯草芽孢杆菌L11液态菌剂的制备方法

1、枯草芽孢杆菌L11的活化及母液制备

活化：从枯草芽孢杆菌L11的冷冻干燥管或者菌种保藏管中，用无菌接种针挑取部分菌粉或单菌落至LB液体培养基(100mL)中，至37℃、120rmp条件下培养24h后，至LB培养基变浑浊。取菌悬液至LB固体培养基中划线培养24h。

一级母液的制备：挑取上述LB固体培养基上的单菌落接种于LB液体培养基中，至37℃、120rpm条件下培养24h后，即可得一级母液。

二级母液的制备：二级母液培养基配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨15g/L、氯化钠5g/L、牛肉膏0.5g/L，溶剂为水。将一级母液接入种子罐中，接种量为1％(V/V)；培养条件为：通气比1:1，搅拌转速为150r/min，培养温度37℃，罐压0.01MPa，培养时间为24h。培养结束时得到二级母液，其活菌含量可达5×10⁸cfu/mL。

2、发酵制备含有枯草芽孢杆菌L11的液态菌剂

培养基配方为：玉米淀粉15g/L、豆粕20g/L、玉米浆25g/L、(NH₄)₂SO₄ 2.5g/L、N₂HPO₄ 2g/L、MgSO₄ 3g/L，溶剂为水。将上述培养基至于发酵罐中，灭菌。将步骤1准备的二级母液接入发酵罐中，接种量为1％(V/V)，培养条件：通气比为1:1，搅拌转速为150r/min，培养温度37℃，罐压0.01MPa，培养时间为48h，得到液态菌剂。

本实施例制备的液态菌剂中活菌含量为30×10⁸cfu/mL。

实施例6

枯草芽孢杆菌L11固态菌剂的制备方法

将枯草芽孢杆菌L11接种于LB液体培养基中，37℃培养12小时后，得到菌悬液，并将其离心收集菌泥，冷冻干燥成纯干菌粉；将上述干菌粉与玉米淀粉按重量比1:4的比例混合制成固态菌剂，所成固态菌剂中活菌含量为100×10⁸cfu/g。

其中，干菌粉的制备过程采用本领域的常规方法，如将菌悬液离心收集菌泥，冷冻干燥成干菌粉的过程。

如本领域技术人员可以想到的，菌悬液的培养方法还可以采用本领域的常规方法进行操作。

实施例7

利用枯草芽孢杆菌L11生产生物源纳米硒

以枯草芽孢杆菌L11静息细胞为试验材料，通过生物合成法转化亚硒酸钠生产生物源纳米硒粒子。运用正交试验法优化得到利用L11合成纳米硒的最佳生产工艺条件。具体实施方法简述如下：

将实施例5中的一级母液按照接种量为5％(v/v)，接种至无菌二级母液培养基中，通气比1:1，搅拌转速为150r/min，培养温度37℃，培养72h，离心(16000/min,8min)收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体3次，制备成OD660约为2.5的菌种悬液，在37℃静置孵育24h即为静息细胞悬液。

在无菌二级母液培养基中添加浓度为3.0mmol/L的亚硒酸钠(Na₂SeO₃)，静息细胞接种量为15％(v/v)，通气比1:1，搅拌转速为150r/min，培养温度37℃，培养时间为2d，发酵液可完全转化为红色(图2B)。将发酵后的菌液于4℃下离心(8000r/min,10min)收集，得到的沉淀则为L11菌体与纳米硒的混合物。混合物中活菌含量为100×10⁸cfu/g，亚硒酸钠转化成纳米硒的效率为98.93％。

然后向混合物中加入溶菌酶，37℃孵育20min后，利用冰浴超声30min破碎菌体，离心(12000r/min,15min)收集上清。将上清转移至新的离心管中，给予普通湿热灭菌法(121℃条件下17psi(1psi＝6.895kPa)处理20min)灭菌处理破坏含有硒颗粒的细菌细胞，离心(36000r/min,15min)并用蒸馏水洗涤3次。洗涤后的样品经10min的超声振荡处理，室温自然干燥，获得纳米硒。

本实施例制备的纳米硒呈球形或近似球形，平均粒径约为100nm，此粒径范围的纳米硒可以被动植物细胞吸收，生物利用率极高。

实施例8

富纳米硒固态菌剂的制备

将实施例5的一级母液接种于添加有3.0mmol/L的亚硒酸钠(Na₂SeO₃)无菌二级母液培养基中，通气比1:1，搅拌转速为150r/min，培养温度37℃，培养时间为2d，至发酵液转化为红色。将发酵液经离心收集菌泥，冷冻干燥成含纳米硒的纯干菌粉；将上述纯干菌粉与无菌玉米淀粉按重量比为1:4的比例混合制成富纳米硒固态菌剂，冻干粉中活菌含量达100×10⁸cfu/g，纳米硒的含量达到8.34×10⁴mg/kg，无机硒的含量仅为2.16mg/kg。

实施例9

将实施例8制备的富纳米硒固态菌剂添加到禽畜常规饲料中，得到添加有富纳米硒枯草芽孢杆菌固态菌剂饲料。按照禽畜常规喂养方式进行投料。本固态菌剂添加与禽畜饲料配方没有特别要求，以搅拌方式混匀在禽畜日常投喂饲料中即可。

本发明实施例中，将实验羊分为对照组和实验组。每组3个平行重复，每个重复选择10头羊。具体操作如下：根据品种、胎次、日龄、体况一致的原则，选择健康的羊(羊种没有特殊要求)进行实验。饲养方式与常规一致，差别仅在于实验组青贮饲料中按照2g/25kg浓度，将实施例8的富纳米硒固态菌剂添加在饲料中。40天后测定对照组和实验组的血清免疫指标(结果见表4)和各组织中的硒含量(结果见表5)。

表4富纳米硒菌剂对羊免疫力的影响

项目	对照组	实验组
			<![CDATA[红细胞数(×10<sup>12</sup>/L)]]>	5.51±0.10	5.57±0.11
<![CDATA[白细胞数(×10<sup>9</sup>/L)]]>	160.13±42.36	8.77±3.09**
			<![CDATA[淋巴细胞数(×10<sup>9</sup>/L)]]>	140.63±35.21	6.43±0.94**
IgG含量(ug/ml)	942.35±83.54	1591.06±41.84**
			SOD活力(U/ml)	270.54±23.79	389.18±11.21**
MDA含(nmol/ml)	170.48±10.56	155.68±11.61**
			T-AOC活力(U/ml)	45.52±2.34	55.14±1.86**
GSH-Px活(U/ml)	800.19±30.55	1155.81±20.76**

注：对照组与实验组对比，*表示差异显著(0.01＜P＜0.05)，**表示差异极显著(P＜0.01)，结果为平均值±标准误表示。

从表4可以看出，实验组的IgG含量、T-AOC(总抗氧化能力)、GSH-Px(谷胱甘肽过氧化物酶)、SOD(超氧化物歧化酶)含量均极显著(P＜0.01)高于对照组，而白细胞与淋巴细胞含量、MDA(丙二醛)含量均极显著(P＜0.01)低于对照组，红细胞含量差异不显著(P＞0.05)。结果显示饲料中添加本发明实施例的富纳米硒菌剂能够显著提高羊的免疫力。

表5富纳米硒菌剂对羊各组织中硒含量的影响

注：对照组与实验组对比，*表示差异显著(0.01＜P＜0.05)，**表示差异极显著(P＜0.01)，结果为平均值±标准误表示。

从表5可以看出，与对照组相比，饲料中添加发明实施例的富纳米硒菌剂的实验组羊颈部肌肉、肝脏及脾脏组织中的硒含量均显著高于对照组(0.01＜P＜0.05)，肺脏中硒含量变化未达到显著水平(P＞0.05)。结果显示饲料中添加本实施例的富纳米硒菌剂能够提高家畜肌肉内有机硒含量。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 武汉轻工大学

<120> 一株来源于青储草料的富硒枯草芽孢杆菌L11及其应用

<130> GG221094112A

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1379

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ggagcttgct ccctgatgtt agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcctgt 60

aagactggga taactccggg aaaccggggc taataccgga tggttgtttg aaccgcatgg 120

ttcaaacata aaaggtggct tcggctacca cttacagatg gacccgcggc gcattagcta 180

gttggtgagg taacggctca ccaaggcaac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg 240

ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc 300

gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt tcggatcgta 360

aagctctgtt gttagggaag aacaagtacc gttcgaatag ggcggtacct tgacggtacc 420

taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc 480

gttgtccgga attattgggc gtaaagggct cgcaggcggt ttcttaagtc tgatgtgaaa 540

gcccccggct caaccgggga gggtcattgg aaactgggga acttgagtgc agaagaggag 600

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Claims (8)

1.枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）L11，于2022年3月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2022309。

2.含权利要求1所述的枯草芽孢杆菌L11的菌剂。

3.利用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌L11制备的富有机硒菌剂，其特征在于，在发酵培养中，使用的培养基中亚硒酸钠的浓度为3.0±1mmol/L。

4.一种利用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌L11生产生物源纳米硒的方法，其特征在于，将枯草芽孢杆菌L11静息细胞接种于含亚硒酸钠的培养基中，进行发酵培养，发酵结束后，向发酵产物中加入溶菌酶，经分离纯化获得纳米硒；其中，所述培养基中亚硒酸钠的浓度为3.0±1mmol/L。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述培养基的配方为：葡萄糖20±2g/L、蛋白胨15±2g/L、氯化钠5±1g/L、牛肉膏0.5±0.1g/L，溶剂为水。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的条件为：通气比为1:（0.8-1.2），搅拌转速为150-200r/min，培养温度为35-40℃，培养时间为4±1d。

7.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌L11、权利要求2所述的菌剂或权利要求3所述的富有机硒菌剂在制备食品、保健品、禽畜饲料中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在制备禽畜饲料中的应用中，禽畜饲料中枯草芽孢杆菌L11的添加量为1-10×10⁵CFU/g；或，禽畜饲料中富有机硒固态冻干菌剂的添加量为1-10g/25kg。

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