CN106190905A - 利用枯草芽孢杆菌生物合成纳米硒的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种利用枯草芽孢杆菌生物合成纳米硒的方法及其应用。本发明从土壤中分离得到一株可耐受较高浓度亚硒酸钠的枯草芽孢杆菌S12，利用菌株S12合成生物纳米硒，对生物纳米硒进行分离纯化，大量制备生物纳米硒，并在肥料、饲料、富硒功能食品加工、保健品及医药产品中应用。采用生物发酵工艺制备纳米硒，具有环境友好，产率高，安全高效等特点，生产获得的生物纳米硒用于富硒肥料、富硒饲料，施肥或饲喂后，作物、瓜果、蔬菜、肉蛋奶富硒效果显著。
Description
技术领域
本发明涉及微生物学及生物纳米硒制备技术领域，具体地说，涉及一种利用枯草芽孢杆菌生物合成纳米硒的方法及其应用。
背景技术
硒(Selenium)元素是动物和人类所必须的一种微量元素，与人体内多种代谢途径相关。人体缺硒会造成多种疾病，如肌肉萎缩、心血管、骨骼或免疫系统疾病，并增加患癌风险，而硒过量也会对人体造成严重毒害。人体对硒有比较窄的适应范围，中国营养学会及FAO/WHO/IAEA联合专家委员会确定人体摄入量适宜范围为60-250μg/d，安全剂量为400μg/d，中毒剂量为800μg/d。由于我国版图存在一条天然的缺硒带，硒分布极不均衡，缺硒地区人群每日硒摄入量严重不足，安全高效补硒对我国缺硒地区人群来说已刻不容缓。
自然界中硒具有多种形态，负二价的硒化物包括硒化氢(H2Se)、金属硒化物、甲基硒和硒代氨基酸等；四价硒主要有SeO2、H2SeO3和SeO3 2-几种形态；六价硒主要有H2SeO4和SeO4 2-。在工业生产中，灰色单质硒可通过氧化负二价形态的硒和还原四价、六价形态的硒制得。近年来，人们通过化学、物理的方法制备出红色纳米硒，也发现多种微生物(真菌、细菌、放线菌)可以转化六价及四价无机硒盐为红色纳米硒。
研究发现，大鼠口服亚硒酸钠的半致死量约为7mg/kg，硒甲基半胱氨酸的半致死量约为15mg/kg，硒代蛋氨酸的半致死量约为26mg/kg，而化学合成的纳米硒的半致死量约为105mg/kg。由于纳米硒与硒代蛋氨酸在血液、肝脏、肾脏等器官中的生物活性无明显差异，且纳米硒在抑制肿瘤方面效果显著且优于硒代蛋氨酸，因此，纳米硒具有相对于无机及有机硒更为安全有效的补硒优势。
生物纳米硒是通过微生物转化还原无机硒并经过分离纯化得到的单质态纳米硒。生物纳米硒自身低毒、生物活性高、比表面积大、安全高效等特点，更优于其他硒源。由于生物纳米硒在人体补硒方面的优势显著，以及微生物转化具有安全高效环保等特点，现已有许多关于微生物转化纳米硒的研究报导。但是已有报道都未进行后期工厂化生产及应用的研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用枯草芽孢杆菌生物合成纳米硒的方法及其应用。
为了实现本发明目的，本发明从土壤中分离得到一株可耐受较高浓度亚硒酸钠的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S12，菌株S12现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC No.11741，保藏日期2015年11月26日。
本发明还提供含有所述枯草芽孢杆菌S12的复合微生物菌剂。
本发明还提供利用所述枯草芽孢杆菌S12生物合成纳米硒的方法，所述方法是向发酵培养基中添加六价和/或四价无机硒盐，发酵培养枯草芽孢杆菌S12，并从发酵产物中分离纯化纳米硒。所述发酵产物包括发酵液经离心所得菌体沉淀，菌悬液以及菌体裂解液。
所述发酵培养基中六价和/或四价无机硒盐的浓度为0.001-70mM，优选1-20mM。更优选所述发酵培养基中添加浓度为5mM的亚硒酸钠。
本发明提供的利用枯草芽孢杆菌S12生物合成纳米硒的方法，包括以下步骤：
S1、菌种活化
用PD培养基对菌株进行活化培养，PD培养基配方为：葡萄糖8g/L，酵母膏10g/L，KH2PO4 2.0g/L，MgSO4﹒7H2O 0.3g/L，琼脂18g/L，pH 7.0-7.2；将菌株S12接种于PD培养基斜面上，28℃培养36小时；
S2、种子液的制备
种子培养用AW液体培养基，AW液体培养基配方为：酵母膏10g/L，玉米浆4g/L，KH2PO4 1g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4﹒7H2O 0.25g/L，(NH4)2SO4 0.5g/L，pH 7.0-7.2；将活化好的菌株S12用无菌生理盐水配制成108CFU/mL的菌悬液，以1％的接种量接种于AW液体培养基中，28℃摇床震荡培养，转速为150rpm，培养时间为24h；
S3、发酵罐发酵
发酵培养采用SD发酵培养基，SD发酵培养基配方为：蛋白胨10g/L，葡萄糖5g/L，KH2PO4 2g/L，Mg2SO4﹒7H2O 1g/L，Na2SeO3 5mM，pH 7.0-7.2；控制培养基体积为发酵罐体积的70％，将种子液按照2.5％的接种量接入发酵罐，控制发酵温度为28℃，搅拌速度为260rpm，通气量为1：0.3-0.6(发酵液体积：每分钟通气量体积)，罐压1.4-1.8F/cm2，发酵96-108小时。纳米硒产量可达3mM；
S4、从发酵产物中分离纯化纳米硒。
从发酵产物中分离纯化生物纳米硒的方法如下：
方案I：
发酵液下罐，4000-8000rpm离心20-30min收集菌体及纳米硒。将收集的红色沉淀用无菌生理盐水4000-8000rpm离心20-30min清洗2-3遍，并用发酵液1/10体积的水(优选纯净水)重悬沉淀，浓缩纳米硒浓度为发酵浓度的10倍，达到30mM。所得菌悬液经冷冻干燥，即得纳米硒干粉。
方案II：
a、发酵液下罐，将发酵液转移至大烧杯中，置于碎冰上。利用超声波细胞破碎仪破碎细胞，设置变幅杆为Φ10，占空比40-50％，功率500-600W，频率20KHz，启停间隔3-8s，破碎25-45min(优选30min)。
b、菌体裂解液于4000-8000rpm离心10-25min使纳米硒沉淀，无菌生理盐水4000-8000rpm离心20-30min清洗2-3遍；重悬于1/2原体积的无菌水(优选无菌纯净水)中，纳米硒的浓度浓缩至60mM，得到纳米硒悬液。
c、转移生物纳米硒悬液至萃取塔中，按照发酵液0.25-0.5倍体积的量加入正己烷萃取3-5次，收集下层水相，4000-6000rpm离心10-25min，所得沉淀用无菌生理盐水清洗2-3遍，4000-6000rpm离心10-15min清洗2-3遍；冷冻干燥，即得纳米硒干粉。
d、获得高纯度、分散性较好生物纳米硒悬液，透射电子显微镜观察结果见图5。
冷冻干燥与生物纳米硒制备：将方案I中制备的生物纳米硒，用液氮冷冻10min，放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，冷冻干燥参数为压强20-100Pa，加热板温度为20-35℃，样品厚度为10-25mm；干燥时间在48-72小时，生物纳米硒干粉A。
将方案II中制备的生物纳米硒，用液氮冷冻10min，放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，冷冻干燥参数为压强20-65Pa，加热板温度为20-25℃，样品厚度为10-14mm；干燥时间在36-48小时，纯生物纳米硒干粉B。
本发明还提供由所述枯草芽孢杆菌S12发酵制备的生物纳米硒。
本发明进一步提供由所述枯草芽孢杆菌S12生物合成的纳米硒在制备食品、保健品、药品、畜禽饲料以及农用肥料中的应用。
本发明还提供由所述生物纳米硒制备的富硒功能食品、富硒保健品和硒药片以及富硒肥料、富硒饲料。其中，生物纳米硒所占含量分别为10-2500μg/kg，10-500mg/kg，50-800mg/kg，50-800μg/kg和0.2-10g/L。
在本发明的一个具体实施方式中，将生物纳米硒干粉A和B分别悬浮于纯净水中，配制成含硒量为100g/L的母液；在搅拌器中加入1/99体积比例的母液与纯净水，充分搅拌均匀，配制成1g/L的富硒肥料，分别为富硒肥料A和富硒肥料B。
在本发明的另一个具体实施方式中，将以下原料按照所示比例称取，玉米粉55.5％、粗蛋白19.5％、四号粉7.0％、麸皮3.0％、豆粕21.0％、鱼粉3.0％、玉米蛋白粉5.0％、酵母粉2.0％、磷酸氢钙1.2％和石粉1.0％，食盐0.3％。称取好的原料投入混合机，并分别将生物纳米硒干粉A和B按照100-500μg/kg比例与原料混合均匀，利用装料机分别将富硒饲料A与B以10kg每包装入包装袋，配制成富硒饲料A和富硒饲料B，封口储存。
在本发明的又一个具体实施方式中，将小米面粉、植物油、纯净水按照55％、10％、35％的重量比例投入混合机，并将生物纳米硒干粉B按照40-200μg/kg的比例加入到混合机中与原料混合均匀备用。开机30min，使机器预热，待螺杆部位温度稳定在120-150℃后，将预混料均匀的加入到膨化机中挤压膨化。待模口挤压力达到3.0-10Mpa，调质器与膨化腔蒸汽压力分别稳定在0.20-0.25Mpa和0.50-0.60Mpa时，开始挤出膨化产品，并设置高速切刀转速为500-800rpm，可根据产品的需要调整模口型号和切刀转速控制产品形状。膨化产品水分含量一般在6.5％～8％左右，可将其在80～90℃的烘箱中烘干20-30min，使其水分含量控制在4-5％左右。干燥后的膨化产品进行抽样检测硒含量，将合格产品进行真空充氮气软包装。
在本发明的再一个具体实施方式中，将生物纳米硒干粉B与淀粉按照100-250mg/kg的比例混合均匀，加入润湿剂，在制粒机中将原料制成微粒，在80～90℃干燥箱中干燥，使其水分控制在1.0％左右，将微粒在整粒机中除去团结块状不合格微粒并将微粒过80目网筛，合格微粒在混合机中与润滑剂混合均匀，混合机转速20rpm，混合时间20-30min。在自动加样机中将原料微粒填充到胶囊壳中，控制每粒胶囊重0.3-0.6g。正式生产后抽检平均片重，并取样作含量测定。半成品胶囊装瓶，每瓶100粒，封口包装入库，即得富硒保健品。
将生物纳米硒干粉B与植物蛋白粉按照100-250mg/kg的比例混合均匀，再将粘合剂加入到混匀的干粉中，在混合机中搅拌均匀。粘合剂HPMC浓度为5％，粘合剂与干粉质量比例为15％，混合机转速20rpm，混合时间20-30min。混匀后的原料要求握之成团，触之则散。将原料投入压片机中开车压片，压片机压力70KN，片重0.4g。
片剂成品置于80～90℃干燥箱中干燥，使其水分含量控制在1.0％左右。正式生产后抽检平均片重，并取样作含量测定。合格半成品药片装瓶，每瓶100粒，封口包装入库，即得生物纳米硒药片。
本发明利用枯草芽孢杆菌S12合成生物纳米硒，对生物纳米硒进行分离纯化，大量制备生物纳米硒，并在肥料、饲料、富硒功能食品加工、保健品及医药产品中应用。采用生物发酵工艺制备纳米硒，具有环境友好，产率高，安全高效等特点，生产获得的生物纳米硒用于富硒肥料、富硒饲料，施肥或饲喂后，作物、瓜果、蔬菜、肉蛋奶富硒效果显著。
附图说明
图1为本发明实施例1中菌株S12的系统进化树，A为16S rDNA基因进化树，B为gyrA基因进化树。
图2为本发明实施例2中菌株S12对不同亚硒酸钠浓度的耐受性。
图3为本发明实施例3中菌株S12在不同亚硒酸钠浓度下的硒产量(A)及对应浓度下的转化率(B)。
图4为本发明实施例4中添加5mM亚硒酸钠时枯草芽孢杆菌S12透射电子显微镜(TEM)照片(A)和生物纳米硒能谱(EDX)分析图(B是对A图中箭头所指颗粒进行分析)。
图5为本发明实施例5中枯草芽孢杆菌S12转化生成的纳米硒颗粒纯化后透射电子显微镜(TEM)照片。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1枯草芽孢杆菌S12的分离纯化及鉴定
1.1菌株S12的分离纯化
从土壤中分离得到一株可耐受较高浓度亚硒酸钠的菌株S12。
1.2菌株S12的鉴定
1.2.1 PCR扩增16S rDNA、gyrA基因序列并测序：
将菌株S12接种于LB固体培养基培养24h，取0.2mL灭菌PCR管，加入10μL ddH2O，
无菌牙签挑取单个菌落到PCR管中搅拌混匀。
1.2.2构建PCR反应体系：
16S rDNA：以8F(5’-CGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3’)及1506R(5’-CGGGATCCTACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3’)为引物，PCR扩增获得16S rDNA基因序列。PCR反应体系为：ddH2O，18.5μL；10×Buffer，2.5μL，dNTPMix，2μL；8F，0.5μL；1506R，0.5μL；菌液，0.5μL；rTaq DNA聚合酶，0.5μL；
PCR反应条件为：94℃10min；94℃40s，56℃40s，72℃1min，共30个循环；72℃10min；4℃保存。
gyrA：以p～gyrA～F(5’～CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT～3’)及p～gyrA～R(5’～CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT～3’)为引物，PCR扩增获得gyrA基因序列。PCR反应体系为：ddH2O，18.5μL；10×Buffer，2.5μL；dNTPMix，2μL；p～gyrA～F，0.5μL；p～gyrA～R，0.5μL；菌液，0.5μL；rTaq DNA聚合酶，0.5μL；
PCR反应条件为：95℃5min；94℃1min，55～62℃1min，72℃2min，共30个循环；72℃10min；4℃保存。
将PCR扩增获得的DNA片段进行纯化，并测序，测序结果用DNAMAN软件拼接。将测得的16S rDNA序列(SEQ ID NO:1)、gyrA基因序列(SEQ ID NO:2)，应用BLAST程序与GenBank数据库(http：//www.ncbi.blm.nih.gov/blast.cgi)中已有的细菌的16S rDNA序列、gyrA基因进行相似性比较分析，结果显示16S rDNA序列与Bacillus subtilis PY79的一致性达到99％，gyrA基因与Bacillus subtilis D12-5一致性达到100％，S12菌株16S rDNA进化树见图1A，gyrA基因进化树见图1B。由此确定S12菌株为枯草芽孢杆菌，定名为Bacillussubtilis S12，并保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号：CGMCCNo.11741。
实施例2枯草芽孢杆菌S12对亚硒酸钠的耐受浓度
2.1制备固体LB不同浓度含硒培养基(每升培养基含NaCl 10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，琼脂15g，去离子水1L)，121℃高压灭菌20min；配制1M的亚硒酸钠母液，过滤灭菌，加入亚硒酸钠溶液，使培养基中亚硒酸钠含量分别0mM、10mM、25mM、35mM、55mM、70mM、80mM。
2.2将S12菌株挑取单菌落接种于5ml LB液体培养基中摇培8h(150rpm，28℃)取上述菌液，稀释为OD600＝0.8的母液备用；将母液分别稀释至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，分别在含硒平板上滴加2.5μL不同浓度的菌液，每个浓度6个重复，28℃培养48h，观察菌落生长及颜色变化。
结果见图2，从结果可以看出10mM、25mM、35mM亚硒酸钠对枯草芽孢杆菌生长没有明显抑制作用；55mM和70mM亚硒酸钠对枯草芽孢杆菌生长有较明显抑制作用；80mM亚硒酸钠存在时，枯草芽孢杆菌S12不生长，由此得到枯草芽孢杆菌S12对亚硒酸钠耐受浓度为70mM。
实施例3枯草芽孢杆菌S12对亚硒酸钠的转化效率
3.1制备不同浓度含硒液体LB培养基，取5mL分装于试管中，121℃高压灭菌20min；配制1M的亚硒酸钠母液，过滤除菌，加入亚硒酸钠溶液，使培养基中亚硒酸钠含量分别1mM、3mM、5mM、7mM、10mM、15mM、20mM，每个浓度梯度3个重复。
3.2将S12菌株挑取单菌落接种于5ml LB液体培养基中摇培8h(150rpm，28℃)取上述菌液，稀释至OD600＝0.8；将稀释好的菌液按照0.1％接种量接种于LB培养基(含有Na2SeO3)中，摇培48小时。
3.3用蒸馏水配置1M的Na2S溶液(现配现用)；取1ml的菌与纳米硒悬浮液于1.5ml离心管内，12000rprn离心5min，去上清，清洗3次，然后加入1ml的1M Na2S溶液，混匀后充分反应1h，再12000r/min离心2min；然后取上清液在500nm处测定吸光度。每个样品三个重复，每个样品测定3次。
3.4根据纳米硒吸光度标准曲线换算可知样品中纳米硒含量及S12菌株在不同亚硒酸钠浓度下的转化率(图3)。S12菌株在较低浓度下可将亚硒酸钠较大程度地转化为纳米硒，在5mM时S12合成纳米硒的产量达到最高，为2.90mM，对亚硒酸钠的转化率为58.1％。
实施例4生物纳米硒特征分析
4.1活化枯草芽孢杆菌S12，转接0.1％的菌液(OD600＝0.8)于灭菌后的含LB液体培养基的锥形瓶中，加入1M Na2SeO3母液，终浓度为5mM，置于摇床内，28℃，150rpm，培养时间为48h。
4.2将摇培48h后的红色菌液取出，在常温下4000r/min离心10分钟，去上清，用生理盐水重悬浮沉淀，离心冲洗3遍，取约20μL的菌与纳米硒的红色混合液，滴加在碳支持膜铜网上，用滤纸吸去多余水分，晾干，在透射电镜下(TEM,JEM-1230,Japan)观察，并利用能谱分析仪(EDX)对该纳米颗粒进行分析。
结果如图4A及4B所示：透射电镜下，S12细胞膜上可见球形纳米硒颗粒，粒径约150nm左右。通过EDX能谱分析红色箭头所指的纳米颗粒知硒的特定吸收峰分别出现在1.37，11.22和12.49keV处，说明S12菌将亚硒酸钠还原后形成的纳米颗粒是纳米硒。
实施例5生物纳米硒发酵工艺
5.1菌种活化
用PD培养基对菌株进行活化培养，PD培养基配方为：葡萄糖8g/L，酵母膏10g/L，KH2PO4 2.0g/L，MgSO4﹒7H2O 0.3g/L，琼脂18g/L，pH 7.0-7.2；将菌株S12接种于PD培养基斜面上，28℃培养36小时。
5.2种子液的制备
种子培养用AW液体培养基，AW液体培养基配方为：酵母膏10g/L，玉米浆4g/L，KH2PO4 1g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4﹒7H2O 0.25g/L，(NH4)2SO4 0.5g/L，pH 7.0-7.2；将活化好的菌株S12用无菌生理盐水配制成108CFU/mL的菌悬液，以1％的接种量接种于AW液体培养基中，28℃摇床震荡培养，转速为150rpm，培养时间为24h。
5.3发酵罐发酵
发酵培养采用SD发酵培养基，SD发酵培养基配方为：蛋白胨10g/L，葡萄糖5g/L，KH2PO4 2g/L，Mg2SO4﹒7H2O 1g/L，Na2SeO3 5mM，pH 7.0-7.2；控制培养基体积为发酵罐体积的70％，将种子液按照2.5％的接种量接入发酵罐，控制发酵温度为28℃，搅拌速度为260rpm，通气量为1：0.3-0.6，罐压1.4-1.8F/cm2，发酵96-108小时。纳米硒产量达到3mM。
5.4生物纳米硒的分离纯化
(1)纳米硒的收集、清洗与浓缩
发酵液下罐，4000rpm离心20min收集菌体及纳米硒。将收集的红色沉淀用无菌生理盐水离心清洗3遍(4000rpm，20min)，并用发酵液1/10体积的纯净水重悬沉淀，浓缩纳米硒浓度为发酵浓度的10倍，达到30mM。
(2)生物纳米硒的分离纯化
a、发酵液下罐，将发酵液转移至大烧杯中，置于碎冰上。利用超声波细胞破碎仪破碎细胞，设置变幅杆为Φ10，占空比40％，功率500W，频率20KHz，启停间隔3s，破碎30min。
b、4000rpm离心10min使纳米硒沉淀，无菌生理盐水4000rpm离心20min清洗3遍；重悬于1/2原体积的无菌纯净水中，纳米硒的浓度浓缩至60mM。
c、转移生物纳米硒悬液至萃取塔，按照1/4体积的正己烷加入到生物纳米硒悬液中进行萃取3-5次，收集下层水相。
d、获得高纯度、分散性较好生物纳米硒悬液，透射电子显微镜观察结果见图5。
(3)冷冻干燥与生物纳米硒制备
将步骤(1)中制备的生物纳米硒，用液氮冷冻10min，放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，冷冻干燥参数为压强20-100Pa，加热板温度为20-35℃，样品厚度为10-25mm；干燥时间在48-72小时，生物纳米硒干粉A。
将步骤(2)中制备的生物纳米硒，用液氮冷冻10min，放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，冷冻干燥参数为压强20-65Pa，加热板温度为20-25℃，样品厚度为10-14mm；干燥时间在36-48小时，纯生物纳米硒干粉B。
实施例6生物纳米硒在肥料中的应用
将生物纳米硒干粉A和B分别悬浮于纯净水中，配制成含硒量为100g/L的母液；在搅拌器中加入1/99体积比例的母液与纯净水，充分搅拌均匀，配制成1g/L的富硒肥料，分别为富硒肥料A和富硒肥料B。
肥料A在富硒小麦、水稻、玉米等粮食作物，富硒大豆、花生、谷子、红薯等杂粮，在富硒金针菇、香菇、木耳等食用菌中施用，富硒番茄、茄子、黄瓜等黄瓜，富硒苹果、猕猴桃等水果以及富硒茶叶中的用量分别为2L/亩、0.5L/亩、1.5L/吨基质、4L/亩、8L/亩、0.5L/亩，各个作物的硒含量分别为小麦287.2μg/kg、水稻214.4μg/kg、玉米260.1μg/kg、大豆237.1μg/kg、花生238.1μg/kg、谷子225.5μg/kg、红薯60.8μg/kg、金针菇435.5μg/kg、香菇1977.4μg/kg、木耳2853.2μg/kg、番茄97.9μg/kg、茄子76.2μg/kg、黄瓜49.7μg/kg、苹果37.3μg/kg、猕猴桃168.8μg/kg、茶叶3438.6μg/kg。
肥料B在富硒小麦、水稻、玉米等粮食作物，富硒大豆、花生、谷子、红薯等杂粮，富硒金针菇、香菇、木耳等食用菌，富硒番茄、茄子、黄瓜等黄瓜，富硒苹果、猕猴桃等水果，富硒茶叶中的用量分别为2.3L/亩、0.6L/亩、1.7L/吨基质、4.4L/亩、8.6L/亩、0.6L/亩；各个作物的硒含量分别为小麦279.01μg/kg、水稻282.9μg/kg、玉米217.4μg/kg、大豆218.6μg/kg、花生197.6μg/kg、谷子214.3μg/kg、红薯45.3μg/kg、金针菇405.3μg/kg、香菇1887.9μg/kg、木耳2743.4μg/kg、番茄87.9μg/kg、茄子66.1μg/kg、黄瓜42.7μg/kg、苹果39.2μg/kg、猕猴桃138.8μg/kg、茶叶3382.7μg/kg。
实施例7生物纳米硒在富硒饲料中的应用
将以下原料按照所示比例称取，玉米粉55.5％、粗蛋白19.5％、四号粉7.0％、麸皮3.0％、豆粕21.0％、鱼粉3.0％、玉米蛋白粉5.0％、酵母粉2.0％、磷酸氢钙1.2％和石粉1.0％，食盐0.3％。称取好的原料投入混合机，并分别将生物纳米硒干粉A或B按照50-800μg/kg比例与原料混合均匀，利用装料机分别将富硒饲料A与B以10kg每包装入包装袋，配制成富硒饲料A和富硒饲料B，封口储存。
富硒饲料A饲喂蛋鸡、肉鸡、猪、羊、牛等畜禽后，鸡蛋、鸡肉、猪肉、羊肉、牛肉中的硒含量分别为210-617.43μg/kg、233.45-543.37μg/kg、157.32-397.08μg/kg、167.82-368.59μg/kg、120.45-274.22μg/kg。
富硒饲料B饲喂蛋鸡、肉鸡、猪、羊、牛等畜禽后，鸡蛋、鸡肉、猪肉、羊肉、牛肉中的硒含量分别为198.21-504.38μg/kg、232.72-493.49μg/kg、125.73-326.84μg/kg、132.86-329.11μg/kg、104.52-258.62μg/kg。
实施例8生物纳米硒在富硒功能食品中的应用
将小米面粉、植物油、纯净水按照55％、10％、35％的重量比例投入混合机，并将生物纳米硒干粉A或B按照10-2500μg/kg的比例加入到混合机中与原料混合均匀备用。
开机30min，使机器预热，待螺杆部位温度稳定在120-150℃后，将预混料均匀的加入到膨化机中挤压膨化。待模口挤压力达到3.0-10Mpa，调质器与膨化腔蒸汽压力分别稳定在0.20-0.25Mpa和0.50-0.60Mpa时，开始挤出膨化产品，并设置高速切刀转速为800rpm，可根据产品的需要调整模口型号和切刀转速控制产品形状。
膨化产品水分含量一般在6.5％～8％左右，可将其在80～90℃的烘箱中烘干30min，使其水分含量控制在5％左右。干燥后的膨化产品进行抽样检测硒含量，将合格产品进行真空充氮气软包装。
膨化玉米、荞麦、豆粉的加工工艺与膨化小米工艺相同，以此工艺可加工制得膨化小米、玉米、荞麦、豆粉富硒功能食品。
实施例9生物纳米硒在保健品和药品中的应用
9.1胶囊剂保健品
将生物纳米硒干粉B与淀粉、维生素E和β胡萝卜素混合，每公斤混合物中含有生物纳米硒10-500mg，维生素E 0-22g，β胡萝卜素0-5g，余量用淀粉补足，混合均匀，加入润湿剂，在制粒机中将原料制成微粒，在80～90℃干燥箱中干燥，使其水分控制在1.0％左右，将微粒在整粒机中除去团结块状不合格微粒并将微粒过80目网筛，合格微粒在混合机中与润滑剂混合均匀，混合机转速20-30rpm，混合时间20-30min。
在自动加样机中将原料微粒填充到胶囊壳中，控制每粒胶囊重0.3-0.6g。正式生产后抽检平均片重，并取样作含量测定。半成品胶囊装瓶，每瓶100粒，封口包装入库。
9.2生物纳米硒药片
将生物纳米硒干粉B与淀粉和植物蛋白粉(淀粉和植物蛋白粉的重量比为95：4.9)混合均匀，每kg混合物中含有生物纳米硒干粉B50-800mg，再将粘合剂HPMC加入到上述混合物中，在混合机中搅拌均匀，混合机转速20rpm，混合时间20min。混匀后的原料要求握之成团，触之则散。将原料投入压片机中开车压片，压片机压力70KN，片重0.4-0.6g。
片剂成品置于80～90℃干燥箱中干燥，使其水分含量控制在1.0％左右。正式生产后抽检平均片重，并取样作含量测定。合格半成品药片装瓶，每瓶100粒，封口包装入库。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S12，其保藏编号为CGMCC No.11741。
2.含有权利要求1所述枯草芽孢杆菌S12的复合微生物菌剂。
3.利用权利要求1所述枯草芽孢杆菌S12生物合成纳米硒的方法，其特征在于，向发酵培养基中添加六价和/或四价无机硒盐，发酵培养枯草芽孢杆菌S12，并从发酵产物中分离纯化纳米硒。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中六价和/或四价无机硒盐的浓度为0.001-70mM，优选1-20mM，更优选所述发酵培养基中添加浓度为5mM的亚硒酸钠。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、菌种活化
用PD培养基对菌株进行活化培养，PD培养基配方为：葡萄糖8g/L，酵母膏10g/L，KH2PO42.0g/L，MgSO4﹒7H2O 0.3g/L，琼脂18g/L，pH 7.0-7.2；将菌株S12接种于PD培养基斜面上，28℃培养36小时；
S2、种子液的制备
种子培养用AW液体培养基，AW液体培养基配方为：酵母膏10g/L，玉米浆4g/L，KH2PO41g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4﹒7H2O 0.25g/L，(NH4)2SO4 0.5g/L，pH 7.0-7.2；将活化好的菌株S12用无菌生理盐水配制成108CFU/mL的菌悬液，以1％的接种量接种于AW液体培养基中，28℃摇床震荡培养，转速为150rpm，培养时间为24h；
S3、发酵罐发酵
发酵培养采用SD发酵培养基，SD发酵培养基配方为：蛋白胨10g/L，葡萄糖5g/L，KH2PO42g/L，Mg2SO4﹒7H2O 1g/L，Na2SeO35mM，pH 7.0-7.2；控制培养基体积为发酵罐体积的70％，将种子液按照2.5％的接种量接入发酵罐，控制发酵温度为28℃，搅拌速度为260rpm，通气量为1：0.3-0.6，罐压1.4-1.8F/cm2，发酵96-108小时；
S4、从发酵产物中分离纯化纳米硒。
6.根据权利要求3-5任一项所述的方法，其特征在于，从发酵产物中分离纯化纳米硒的方法如下：
发酵液下罐，4000-8000rpm离心20-30min收集菌体沉淀，用无菌生理盐水4000-8000rpm离心20-30min清洗2-3遍，并用发酵液1/10体积的水重悬沉淀，所得菌悬液经冷冻干燥，即得纳米硒干粉。
7.根据权利要求3-5任一项所述的方法，其特征在于，从发酵产物中分离纯化纳米硒的方法如下：
a、发酵液下罐，将发酵液进行超声破碎细胞，设置变幅杆为Φ10，占空比40-50％，功率500-600W，频率20KHz，启停间隔3-8s，破碎25-45min，优选30min，得到菌体裂解液；
b、菌体裂解液于4000-8000rpm离心10-25min，所得沉淀用无菌生理盐水4000-8000rpm离心20-30min清洗2-3遍；将沉淀重悬于发酵液1/10体积的水中，得到纳米硒悬液；
c、将纳米硒悬液转移至萃取塔中，按照发酵液0.25-0.5倍体积的量加入正己烷萃取3-5次，收集下层水相，4000-6000rpm离心10-25min，所得沉淀用无菌生理盐水4000-6000rpm离心10-15min清洗2-3遍；冷冻干燥，即得纳米硒干粉。
8.利用权利要求3-7任一项所述方法制备的生物纳米硒。
9.权利要求8所述生物纳米硒在制备食品、保健品、药品、畜禽饲料以及农用肥料中的应用。
10.由权利要求8所述生物纳米硒制备的食品、保健品、药品、畜禽饲料以及农用肥料；其中，生物纳米硒所占含量分别为10-2500μg/kg，10-500mg/kg，50-800mg/kg，50-800μg/kg和0.2-10g/L。
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