CN109402007B - 生物纳米硒产生菌及利用该菌株制备生物纳米硒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了生物纳米硒产生菌及利用该菌株制备生物纳米硒的方法，涉及纳米生物材料领域，基于利用传统物理‑化学方法制备纳米硒容易对环境造成危害，生产的纳米硒理化性质不稳定，生物纳米硒产生菌对亚硒酸钠的耐受性不高，使其应用受到限制的问题而提出的，本发明从富硒农业土壤中分离筛选出一株可耐受较高浓度亚硒酸钠的芽孢杆菌Se8，利用芽孢杆菌Se8合成生物纳米硒，本发明的有益效果在于：对设备要求低，工艺简单，成本低，产物纯度高，环境友好，克服了传统物理、化学方法制备纳米硒易引入杂质，能耗高，产物粒径分布不均匀的缺点。

Description

生物纳米硒产生菌及利用该菌株制备生物纳米硒的方法
技术领域
本发明涉及纳米生物材料领域，具体涉及一种生物纳米硒产生菌及利用该菌株制备生物纳米硒的方法。
背景技术
硒是人和动物必需的微量元素之一，与机体的抗氧化能力、免疫功能、抗病毒、抗癌作用等有着重要关系。与无机硒和有机硒相比，红色纳米硒具有毒性低、生物活性高等特征，在动物生产、医药及保健品方面有着广泛的应用。同时，纳米硒兼具纳米材料的光电子特性以及多种抗生物活性，因此在生物传感器制备，太阳能电池、整流器、静电复印等等方面也具有广阔的应用前景。目前纳米硒的合成主要通过化学反应，结晶技术，反向胶束法等技术生成。但这些技术会受到高温、高压、催化剂等条件限制，而且容易对环境造成危害，生产的纳米硒在没有保护剂存在的条件下，容易团聚，理化性质不稳定，常温下就容易失去生物活性，而转变成灰黑色晶型的单质硒。因此，生产上亟需一种清洁，无毒，环保的方法来生产稳定的纳米硒。
微生物在硒的自然界中的循环发挥着重要作用。已发现许多细菌，如大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、红螺菌(RhodospirillumMolisch)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)等可将氧化态硒还原为无毒、高效的红色纳米硒，而且合成的生物纳米硒性质稳定，活性高，故利用细菌合成生物纳米硒，是硒的高效生物转化方式，也是降低硒环境风险的解决方式之一。但是，目前报道和应用的细菌，对亚硒酸钠的耐受性普遍不高(最大硒耐受浓度≤100mM)，导致其应用于实际生产中时受到一定限制。因此，筛选可以耐受更高浓度亚硒酸钠的微生物，并利用该微生物生产生物纳米硒，对于推进生物纳米硒合成产业的发展，具有重要意义。
发明内容
本发明解决的技术问题在于利用传统物理、化学方法制备生物纳米硒容易对环境造成危害，生产的纳米硒理化性质不稳定，生物纳米硒产生菌对亚硒酸钠的耐受性不高，使其应用受到限制。
本发明是采用以下技术方案解决上述技术问题的：
本发明提供一株生物纳米硒产生菌，分类命名：芽孢杆菌Se8(Bacillus.sp)，保藏编号： CCTCC M 2018422，保藏日期：2018年7月2日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。
本发明还提供利用生物纳米硒产生菌制备生物纳米硒的方法，包括以下步骤：
(1)芽孢杆菌Se8(Bacillus.sp)的培养：挑取芽孢杆菌Se8(Bacillus.sp)单菌落至 YEP培养基中进行恒温振荡培养；
(2)诱导剂的添加：向步骤(1)的培养产物中，加入诱导剂，使诱导剂终浓度为 1-3mg/L，继续恒温振荡培养；
(3)亚硒酸钠的添加：向步骤(2)的培养产物中，添加浓度为5mol/L的Na2SeO3溶液，调节Na2SeO3终浓度为0.1-0.5mol/L，继续恒温振荡培养；
(4)生物纳米硒的分离提取：取步骤(3)中的培养液离心，弃去上清液，收集菌体沉淀，沉淀重悬于TE缓冲液中，加入溶菌酶至终浓度为5-10mg/mL，37℃水浴20-30min，水浴完成后，利用超声波破碎仪破碎残留菌体，离心收集上清液，随后高速离心，收集沉淀，重溶于TE缓冲液中，即为生物纳米硒初提物。
优选的，所述步骤(1)中挑取芽孢杆菌Se8(Bacillus.sp)单菌落至含有100mLYEP培养基的锥形瓶中，培养条件为28℃恒温振荡培养1-2d，150-200r/min，培养至菌群数量达到 107-108CFU/mL。
优选的，所述步骤(2)中诱导剂为谷胱甘肽、生物素、曲拉通-100、芹菜素硬脂酸酯、鼠李糖脂中的一种或多种。
优选的，所述步骤(2)中的培养条件为28℃恒温振荡培养6-12h，150-200r/min，至菌群数量达到108-109CFU/mL。
优选的，所述步骤(3)中的培养条件为28℃恒温振荡培养，150-200r/min，培养2-4d，至培养基颜色由无色变为红色，视为培养完成。
优选的，所述步骤(4)中第一次离心的转速为8000-10000r/min，离心时间为5min。
优选的，所述步骤(4)中第二次离心的转速为3000-5000r/min，离心时间为5-10min。
优选的，所述步骤(4)中高速离心的转速为20000-30000r/min，离心时间为10-20min。
优选的，所述TE缓冲液的pH值为8，所述超声波破碎仪的破碎功率为80-100w，超声5s停10s，超声时间为20-30min。
本发明的有益效果在于：
本发明分离筛选的芽孢杆菌Se8(Bacillus.sp)能耐受较高浓度的亚硒酸钠，本发明方法对设备要求低，工艺简单，成本低，产物纯度高，环境友好，克服了传统物理-化学方法制备生物纳米硒易引入杂质，能耗高，产物粒径分布不均匀的缺点，具有广阔的推广价值。
附图说明
图1为本发明实施例1中芽孢杆菌Se8(Bacillus.sp)菌株在不含亚硒酸钠和含有1mmol/L 亚硒酸钠的培养平板上的生长情况；其中A为不含亚硒酸钠的培养平板，B为含有1mmol/L 亚硒酸钠的培养平板；
图2为芽孢杆菌Se8(Bacillus.sp)在含不同浓度亚硒酸钠的培养基生长状态图。
图3为本发明实施例2中激光粒度仪测定芽孢杆菌Se8(Bacillus.sp)生成的红色单质硒的粒径及分布图；
图4为本发明实施例2制备的纳米硒扫描电镜图；
图5为本发明实施例2制备的纳米硒借助扫描电镜的X-射线能谱分析图；
芽孢杆菌Bacillus.sp Se8，保藏日期：2018年7月2日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号：CCTCC M 2018422。
具体实施方式
为使对本发明的结构特征及所达成的功效有更进一步的了解与认识，用以较佳的实施例对本发明进行详细的说明。
实施例1
生物纳米硒产生菌的分离纯化，包括以下步骤：
a.从富硒农业生产基地田块采集土壤，过200目筛，取0.1-0.2g土壤，放入盛有90mL无菌水的三角瓶(底部盛有灭菌玻璃珠)，150-200rpm震荡1h，制成土壤悬液；
b.制备含Na2SeO3溶液的NB培养基：其中NB培养基由蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化钠5g，琼脂粉12g，纯水1000mL制成，121℃灭菌30min，每升NB培养基中加入摩尔浓度为 1.0-5.0mol/L的Na2SeO3溶液，调节Na2SeO3终浓度为0.1-1mol/L，倒平板，冷却；
c.吸取1mL土壤悬液，采用灭菌水梯度稀释101-109倍，分别吸取各稀释度土悬液0.1mL，均匀涂布于Na2SeO3终浓度为0.1-1mol/L的NB培养基固体平板，28℃恒温培养 2-3d；
d.待平板上长出单菌落后，挑取单菌落至Na2SeO3终浓度为0.1-1mol/L的NB培养基固体平板，划线培养。重复此步骤，连续划线纯化3-4次，直至获得纯菌；图1为芽孢杆菌Se8(Bacillus.sp)菌株在不含亚硒酸钠和含有2mmol/L亚硒酸钠的培养平板上的生长情况；其中A为不含亚硒酸钠的培养平板，B为含有2mmol/L亚硒酸钠的培养平板；
e.获得的纯菌，送交生工生物工程(上海)股份有限公司鉴定，命名为Bacillus.spSe8。
实施例2
利用菌株芽孢杆菌Se8(Bacillus.sp)制备生物纳米硒的方法，包括以下步骤：
a.菌株芽孢杆菌Se8(Bacillus.sp)的培养：芽孢杆菌Se8(Bacillus.sp)的培养采用YEP 培养基，其中YEP培养基由胰蛋白胨20g，酵母膏15g，氯化钠10g，纯水1000mL制成，挑取芽孢杆菌Se8(Bacillus.sp)单菌落至含100mLYEP培养基的锥形瓶中，28℃恒温、150r/min 振荡培养1d，至菌群数量达到107CFU/mL；
b.诱导剂的添加：向菌群数量达到107CFU/mL的培养基中，加入诱导剂谷胱甘肽(GSH)，使得诱导剂终浓度为1mg/L，继续28℃恒温、150r/min振荡培养6h，至菌群数量达到108CFU/mL；
c.亚硒酸钠的添加：待芽孢杆菌Se8(Bacillus.sp)菌群数量达到108CFU/ml时，向100mL 培养基中添加6.4mL浓度为5mol/L的Na2SeO3溶液，使得Na2SeO3终浓度为0.3mol/L，继续28℃恒温、150r/min振荡培养，培养2d，至培养基颜色由无色变为红色，培养基内亚硒酸钠全部被还原，视为培养完成；
d.生物纳米硒的分离提取：芽孢杆菌Se8(Bacillus.sp)培养完成后，取培养液置于离心管内，8000r/min，离心5min，弃去上清液，收集菌体沉淀，沉淀重悬于pH值为8.0的TE缓冲液中，加入溶菌酶至终浓度为5mg/mL，37℃水浴20min，水浴完成后，利用超声波破碎仪破碎残留菌体，其中超声波破碎仪的破碎功率为80w，超声5s停10s，超声时间为20 min，3000r/min，离心5min，收集上清液，置于干净离心管内，20000r/min高速离心10 min，收集沉淀，重溶于pH值为8.0的TE缓冲液中，即为纳米硒初提物。
实验结果：所得到的纳米硒颗粒，利用纳米激光粒度仪测量，如图2所示，粒径范围为 200-500nm，采用扫描电子显微镜及能谱仪(SEM-EDX)，如图3和图4所示，观察到粒径为200-500nm的纳米颗粒，如图5所示，EDX能谱显示出Se的特征峰，表明制备的纳米颗粒为纳米硒颗粒。
这里需要说明的是，纳米激光粒度仪、扫描电子显微镜及能谱仪的测定方法为现有技术。
实施例3
利用菌株芽孢杆菌Se8(Bacillus.sp)制备生物纳米硒的方法，包括以下步骤：
a.菌株芽孢杆菌Se8(Bacillus.sp)的培养：芽孢杆菌Se8(Bacillus.sp)的培养采用YEP 培养基，其中YEP培养基由胰蛋白胨20g，酵母膏15g，氯化钠10g，纯水1000mL制成，挑取Bacillus.sp Se8单菌落至含100mLYEP培养基的锥形瓶中，28℃恒温、180r/min振荡培养2d，至菌群数量达到108CFU/mL；
b.诱导剂的添加：向菌群数量达到108CFU/mL的培养基中，加入诱导剂生物素，使得诱导剂终浓度为2mg/L，继续28℃恒温、180r/min振荡培养8h，至菌群数量达到109CFU/mL；
c.亚硒酸钠的添加：待芽孢杆菌Se8(Bacillus.sp)菌群数量达到109CFU/ml时，向100mL 培养基中添加8.7mL浓度为5mol/L的Na2SeO3溶液，使得Na2SeO3终浓度为0.4mol/L，继续28℃恒温振荡培养，180r/min，培养3d，至培养基颜色由无色变为红色，培养基内亚硒酸钠全部被还原，视为培养完成；
d.生物纳米硒的分离提取：芽孢杆菌Se8(Bacillus.sp)培养完成后，取培养液置于离心管内，9000r/min，离心5min，弃去上清液，收集菌体沉淀，沉淀重悬于pH值为8.0的TE缓冲液中，加入溶菌酶至终浓度为8mg/mL，37℃水浴30min，水浴完成后，利用超声波破碎仪破碎残留菌体，其中超声波破碎仪的破碎功率为90w，超声5s停10s，超声时间为25min，4000r/min，离心8min，收集上清液，置于干净离心管内，25000r/min高速离心10min，收集沉淀，重溶于pH值为8.0的TE缓冲液中，即为纳米硒初提物。
实验结果：所得到的纳米硒颗粒，利用纳米激光粒度仪测量，粒径范围为200-300nm。采用扫描电子显微镜及能谱仪(SEM-EDX)，观察到粒径为200-300的纳米颗粒，EDX能谱显示出Se的特征峰，表明制备的纳米颗粒为纳米硒颗粒。
实施例4
利用菌株芽孢杆菌Se8(Bacillus.sp)制备生物纳米硒的方法，包括以下步骤：
a.菌株芽孢杆菌Se8(Bacillus.sp)的培养：芽孢杆菌Se8(Bacillus.sp)的培养采用YEP 培养基，其中YEP培养基由胰蛋白胨20g，酵母膏15g，氯化钠10g，纯水1000mL制成，挑取芽孢杆菌Se8(Bacillus.sp)单菌落至含100mLYEP培养基的锥形瓶中，28℃恒温、200r/min 振荡培养2d，至菌群数量达到108CFU/mL；
b.诱导剂的添加：向菌群数量达到108CFU/mL的培养基中，加入诱导剂曲拉通-100，使得诱导剂终浓度为3mg/L，继续28℃恒温、200r/min振荡培养12h，至菌群数量达到109 CFU/mL；
c.亚硒酸钠的添加：待芽孢杆菌Se8(Bacillus.sp)菌群数量达到109CFU/ml时，向100mL 培养基中添加11.1mL浓度为5mol/L的Na2SeO3溶液，使得Na2SeO3终浓度为0.5mol/L，继续28℃恒温、200r/min振荡培养4d，至培养基颜色由无色变为红色，培养基内亚硒酸钠全部被还原，视为培养完成；
d.生物纳米硒的分离提取：芽孢杆菌Se8(Bacillus.sp)培养完成后，取培养液置于离心管内，10000r/min，离心5min，弃去上清液，收集菌体沉淀，沉淀重悬于pH值为8.0的TE 缓冲液中，加入溶菌酶至终浓度为10mg/mL，37℃水浴30min，水浴完成后，利用超声波破碎仪破碎残留菌体，其中超声波破碎仪的破碎功率为100w，超声5s停10s，超声时间为30min，5000r/min，离心10min，收集上清液，置于干净离心管内，30000r/min高速离心20min，收集沉淀，重溶于pH值为8.0的TE缓冲液中，即为纳米硒初提物。
实验结果：所得到的纳米硒颗粒，利用纳米激光粒度仪测量，粒径范围为50-500nm。采用扫描电子显微镜及能谱仪(SEM-EDX)，观察到粒径为50-500的纳米颗粒，EDX能谱显示出Se的特征峰，表明制备的纳米颗粒为纳米硒颗粒。
实施例5
芽孢杆菌Bacillus.sp Se8对亚硒酸钠的耐受浓度的测定：
制备含不同浓度亚硒酸钠的YEP培养基，培养基中亚硒酸钠含量分别0mM、200mM、220mM、240mM、300mM、320mM、400mM，接种芽孢杆菌Se8(Bacillus.sp)，亚硒酸钠浓度为200-400mM时，菌株芽孢杆菌Se8(Bacillus.sp)均可生长，且其最大耐受浓度为400mM。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅限于上述实施例，与本发明构思无差异的各种工艺方案均在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一株生物纳米硒产生菌，其特征在于：所述生物纳米硒产生菌的名称为芽孢杆菌Se8(Bacillus.sp)，其保藏编号为CCTCC M 2018422，保藏日期为2018年7月2日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。
2.利用权利要求1所述的生物纳米硒产生菌制备生物纳米硒的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)菌株芽孢杆菌Se8的培养：挑取芽孢杆菌Se8单菌落至YEP培养基中进行恒温振荡培养；
(2)诱导剂的添加：向步骤(1)的培养产物中，加入诱导剂，使诱导剂终浓度为1-3mg/L，继续恒温振荡培养；所述诱导剂为谷胱甘肽、生物素或曲拉通-100；
(3)亚硒酸钠的添加：向步骤(2)的培养产物中，添加浓度为5mol/L的Na2SeO3溶液，调节Na2SeO3终浓度为0.2-0.4mol/L，继续恒温振荡培养；
(4)生物纳米硒的分离提取：取步骤(3)中的培养液离心，弃去上清液，收集菌体沉淀，沉淀重悬于TE缓冲液中，加入溶菌酶至终浓度为5-10mg/mL，37℃水浴20-30min，水浴完成后，利用超声波破碎仪破碎残留菌体，离心收集上清液，随后高速离心，收集沉淀，重溶于TE缓冲液中，即为生物纳米硒初提物。
3.根据权利要求2所述的生物纳米硒产生菌制备生物纳米硒的方法，其特征在于：所述步骤(1)中挑取芽孢杆菌Se8单菌落至含有100mLYEP培养基的锥形瓶中，培养条件为28℃恒温振荡培养1-2d，150-200r/min，培养至菌群数量达到107-108CFU/mL。
4.根据权利要求2所述的生物纳米硒产生菌制备生物纳米硒的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的培养条件为28℃恒温振荡培养6-12h，150-200r/min，至菌群数量达到108-109CFU/mL。
5.根据权利要求2所述的生物纳米硒产生菌制备生物纳米硒的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的培养条件为28℃恒温振荡培养，150-200r/min，培养2-4d，至培养基颜色由无色变为红色，视为培养完成。
6.根据权利要求2所述的生物纳米硒产生菌制备生物纳米硒的方法，其特征在于：所述步骤(4)中培养液离心的转速为8000-10000r/min，离心时间为5min。
7.根据权利要求2所述的生物纳米硒产生菌制备生物纳米硒的方法，其特征在于：所述步骤(4)离心收集上清液时的转速为3000-5000r/min，离心时间为5-10min。
8.根据权利要求2所述的生物纳米硒产生菌制备生物纳米硒的方法，其特征在于：高速离心的转速为20000-30000r/min，离心时间为10-20min。
9.根据权利要求2所述的生物纳米硒产生菌制备生物纳米硒的方法，其特征在于：所述TE缓冲液的pH值为8，所述超声波破碎仪的破碎功率为80-100w，超声5s停10s，超声时间为20-30min。
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