CN109337840B - 纳米氧化锰产生菌及利用该菌株制备纳米氧化锰的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了纳米氧化锰产生菌及利用该菌株制备纳米氧化锰的方法，涉及纳米生物材料领域，基于利用传统物理、化学方法制备纳米氧化锰容易对环境造成危害、操作复杂、生产的纳米氧化锰粒径分布不均匀的问题而提出的，本发明从高锰酸钾生产企业厂区土壤中分离筛选出一株芽孢杆菌cas8，利用芽孢杆菌cas8合成纳米氧化锰，本发明的有益效果在于：对设备要求低，工艺简单，成本低，产物纯度高，环境友好，克服了传统物理、化学方法制备纳米氧化锰易引入杂质，能耗高，产物粒径分布不均匀的缺点。

Description

纳米氧化锰产生菌及利用该菌株制备纳米氧化锰的方法
技术领域
本发明涉及纳米生物材料领域，具体涉及一种纳米氧化锰产生菌及利用该菌株制备纳米氧化锰的方法。
背景技术
纳米锰氧化物以其出色的阳离子交换能力、分子吸附能力以及优异的电学、磁性等特性，在分子筛、离子交换器、磁性材料、高效催化剂、二次电池电极材料、硫化处理剂、电化学电容器、选择性吸附剂和纳米复合材料方面具有广泛的潜在应用价值。
目前，国内外报道的纳米锰氧化物的制备方法可分为物理方法和化学方法，主要包括水热法、溶胶-凝胶法、微乳法、模板法、前驱物法等。水热法制备的纳米氧化锰产物纯度高，晶型和分散性好，但对原料纯度和反应物配比要求苛刻。溶胶-凝胶法合成的材料具有多孔状结构，比表面积大，但实验步骤多、不可控因素多，工业化推广存在一定难度。模板法原理简单，易操作，但所制备的产物纯度不高，对模板溶剂选择要求高。为了拓宽锰氧化物的应用范围，研制操作简便，对设备要求不高，产物纯度高的纳米锰氧化物新制备方法，成了科研工作者和企业研发人员的研究热点。
发明内容
本发明解决的技术问题在于利用传统物理、化学方法制备纳米氧化锰容易对环境造成危害、操作复杂、生产的纳米氧化锰粒径分布不均匀。
本发明是采用以下技术方案解决上述技术问题的：
本发明提供一株纳米氧化锰产生菌，分类命名：芽孢杆菌cas8(Bacillus.sp)，保藏编号：CCTCC M 2018423，保藏日期：2018年7月2日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。
本发明还提供利用纳米氧化锰产生菌制备纳米氧化锰的方法，包括以下步骤：
(1)菌株芽孢杆菌cas8(Bacillus.sp)的培养：挑取芽孢杆菌cas8(Bacillus.sp)单菌落至YEP培养基中进行恒温振荡培养；
(2)诱导剂的添加：向步骤(1)的培养产物中，加入诱导剂，使诱导剂终浓度为1-3mg/L，继续恒温振荡培养；
(3)高锰酸钾的添加：向步骤(2)的培养产物中，添加KMnO4溶液，调节KMnO4终浓度为0.8-1.6wt％，继续恒温振荡培养；
(4)纳米氧化锰的分离提取：取步骤(3)中的培养液离心，弃去上清液，收集菌体沉淀，沉淀重悬于TE缓冲液中，加入溶菌酶至终浓度为5-10mg/mL，37℃水浴20-30min，水浴完成后，利用超声波破碎仪破碎残留菌体，离心收集上清液，随后高速离心，收集沉淀，重溶于TE缓冲液中，即为纳米氧化锰初提物；
(5)纳米氧化锰的纯化：向纳米氧化锰初提物中加入蛋白酶，调节蛋白酶终浓度为2-5mg/mL，37℃水浴30-60min后，低速离心收集上清液，将上清液进行高速离心，收集沉淀，重溶于超纯水中。
优选的，所述步骤(1)中挑取芽孢杆菌cas8(Bacillus.sp)单菌落至含有100mLYEP培养基的锥形瓶中，培养条件为28℃恒温、150-200r/min振荡培养1-2d，培养至菌群数量达到107-108CFU/mL。
优选的，所述步骤(2)中诱导剂为2,4-二硝基苯酚、芹菜素硬脂酸酯、十二烷基磺基甜菜碱、吐温60中的一种或多种。
优选的，所述步骤(2)中的培养条件为28℃恒温、150-200r/min振荡培养6-12h，至菌群数量达到108-109CFU/mL。
优选的，所述步骤(3)中的培养条件为28℃恒温、150-200r/min振荡2-4d，至培养基颜色由红色变为灰色，视为培养完成。
优选的，所述步骤(4)中第一次离心的转速为8000-10000r/min，离心时间为5min，第二次离心的转速为5000-8000r/min，离心时间为5-10min，高速离心的转速为20000-30000r/min，离心时间为10-20min。
优选的，所述步骤(4)中TE缓冲液的pH值为8，所述超声波破碎仪的破碎功率为80-100w，超声5s停10s，超声时间为20-30min。
优选的，所述步骤(5)中蛋白酶为蛋白酶K、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、羧肽酶、中性蛋白酶中的一种或多种。
优选的，所述步骤(5)中低速离心的转速为5000-6000r/min，离心时间为10-20min，高速离心的转速为20000-30000r/min，离心时间为10-20min。
本发明的有益效果在于：本发明的生物纳米氧化锰制备方法对设备要求低，工艺简单，成本低，产物纯度高，环境友好，克服了传统物理、化学方法制备纳米氧化锰易引入杂质，能耗高，产物粒径分布不均匀等缺点，具有广阔的推广价值。
附图说明
图1为本发明实施例2中芽孢杆菌cas8(Bacillus.sp)菌株在含高锰酸钾的YEP液体培养基的生长情况；其中图左锥形瓶中为未接种芽孢杆菌cas8(Bacillus.sp)空白YEP培养基，图右锥形瓶中为接种芽孢杆菌cas8(Bacillus.sp)并培养48h的YEP培养基；
图2为本发明实施例2中接种芽孢杆菌cas8(Bacillus.sp)并培养48h后菌体沉淀和上清中锰含量；
图3为本发明实施例2中激光粒度仪测定生成的纳米氧化锰粒径及分布图；
图4为本发明实施例2中X射线光电子能谱技术测定生成的纳米锰颗粒中锰离子的存在状态图；
图5为本发明实施例2中添加诱导剂和未添加诱导剂时菌体生成的纳米氧化锰含量的结果图；
芽孢杆菌Bacillus.sp cas8，保藏日期：2018年7月2日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号：CCTCC M 2018423。
具体实施方式
为使对本发明的结构特征及所达成的功效有更进一步的了解与认识，用以较佳的实施例对本发明进行详细的说明。
实施例1
纳米氧化锰产生菌的分离筛选，包括以下步骤：
a.从高锰酸钾生产企业厂区采集土壤，过200目筛，取0.1-0.2g土壤，放入盛有90mL无菌水的三角瓶(底部盛有灭菌玻璃珠)，150-200rpm震荡1h，制成土壤悬液；
b.制备含KMnO4溶液的NB培养基：其中NB培养基由蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化钠5g，琼脂粉12g，纯水1000mL制成，121℃灭菌30min，每升NB培养基中加入摩尔浓度为0.02-0.04mol/L的KMnO4溶液，调节KMnO4终浓度为0.4-1.6wt％，倒平板，冷却；
c.吸取1mL土壤悬液，采用灭菌水梯度稀释101-109倍，分别吸取各稀释度土悬液0.1mL，均匀涂布于KMnO4终浓度为0.4-1.6wt％的NB培养基固体平板，28℃恒温培养2-3d；
d.待平板上长出单菌落后，挑取单菌落至KMnO4终浓度为0.4-1.6wt％的NB培养基固体平板，划线培养。重复此步骤，连续划线纯化3-4次，直至获得纯菌；
e.获得的纯菌，送交生工生物工程(上海)股份有限公司鉴定，命名为Bacillus.spcas8。
实施例2
利用菌株芽孢杆菌cas8(Bacillus.sp)制备纳米氧化锰的方法，包括以下步骤：
a.芽孢杆菌cas8(Bacillus.sp)的培养：采用YEP培养基，其中YEP培养基由胰蛋白胨20g，酵母膏15g，氯化钠10g，纯水1000mL制成，挑取芽孢杆菌cas8(Bacillus.sp)单菌落至含100mLYEP培养基的锥形瓶中，28℃恒温振荡培养1d，150r/min，至菌群数量达到107CFU/mL；
b.诱导剂的添加：向菌群数量达到107CFU/mL的培养基中，加入诱导剂2,4-二硝基苯酚，使得诱导剂终浓度为1mg/L，继续28℃恒温振荡培养6h，150r/min，至菌群数量达到108CFU/mL；
c.高锰酸钾的添加：待芽孢杆菌cas8(Bacillus.sp)菌群数量达到108CFU/mL时，向100mL培养基中添加12.6mL，0.04mol/L的KMnO4溶液，调节KMnO4终浓度为0.8wt％，继续28℃恒温、150r/min振荡培养2d，如图1所示，培养基颜色由红色变为灰色，培养基内高锰酸钾全部被还原，视为培养完成；
d.纳米氧化锰的分离提取：芽孢杆菌芽孢杆菌cas8(Bacillus.sp)培养完成后，取培养液置于离心管内，8000r/min离心5min，弃去上清液，收集菌体沉淀，沉淀重悬于pH值为8.0的TE缓冲液中，加入溶菌酶至终浓度为5mg/mL，37℃水浴20min，水浴完成后，利用超声波破碎仪破碎残留菌体，其中超声波破碎仪的破碎功率为80w，超声5s停10s，超声时间为20min，随后，5000r/min离心5min，收集上清液，置于干净离心管内，20000r/min高速离心10min，收集沉淀，重溶于pH值为8.0的TE缓冲液中，即为纳米氧化锰初提物；
e.纳米氧化锰的纯化：向纳米氧化锰初提物中加入蛋白酶K，至终浓度为2mg/mL，37℃水浴30min，去除纳米氧化锰表面残留的蛋白后，5000r/min低速离心10min，沉淀为残留蛋白，舍弃，收集上清，20000r/min高速离心10min，收集沉淀，重溶于超纯水中，即为高纯度纳米氧化锰。
对照组：其他条件不变，不添加诱导剂；
实验结果：如图2所示，芽孢杆菌cas8(Bacillus.sp)培养48h后的菌体和上清液中的纳米氧化锰含量进行测定，可以看出纳米氧化锰存在于菌体沉淀中，其上清液中不含有纳米氧化锰；
如图3所示，所得到的纳米氧化锰颗粒，利用纳米激光粒度仪测量，粒径范围为20-50nm；如图4所示，采用X射线光电子能谱技术，锰离子的存在状态为正二价，表明制备的氧化锰纳米粒子为一氧化锰；
如图5所示，本实施例2与对照组相比，可以明显看出，在芽孢杆菌cas8(Bacillus.sp)的培养过程中添加诱导剂能刺激菌体还原高锰酸钾，提高菌体中生成的纳米氧化锰的含量；
这里需要说明的是，纳米氧化锰含量测定方法、X射线光电子能谱的测定方法为现有技术。
实施例3
利用菌株芽孢杆菌cas8(Bacillus.sp)制备纳米氧化锰的方法，包括以下步骤：
a.芽孢杆菌cas8(Bacillus.sp)的培养：芽孢杆菌cas8(Bacillus.sp)的培养采用YEP培养基，其中YEP培养基由胰蛋白胨20g，酵母膏15g，氯化钠10g，纯水1000mL制成，挑取芽孢杆菌cas8(Bacillus.sp)单菌落至含100mLYEP培养基的锥形瓶中，28℃恒温、180r/min振荡培养2d，至菌群数量达到108CFU/mL；
b.诱导剂的添加：向菌群数量达到108CFU/mL的培养基中，加入诱导剂芹菜素硬脂酸酯，使得诱导剂终浓度为2mg/L，继续28℃恒温、180r/min振荡培养8h，至菌群数量达到109CFU/mL；
c.高锰酸钾的添加：待芽孢杆菌cas8(Bacillus.sp)菌群数量达到109CFU/ml时，向100mL培养基中添加12.6mL浓度为0.06mol/L的KMnO4溶液，使得KMnO4终浓度为1.2wt％，继续28℃恒温、180r/min振荡培养3d，至培养基颜色由红色变为灰色，培养基内高锰酸钾全部被还原，视为培养完成；
d.纳米氧化锰的分离提取：芽孢杆菌cas8(Bacillus.sp)培养完成后，取培养液置于离心管内，9000r/min离心5min，弃去上清液，收集菌体沉淀，沉淀重悬于pH值为8.0的TE缓冲液中，加入溶菌酶至终浓度为8mg/mL，37℃水浴30min，水浴完成后，利用超声波破碎仪破碎残留菌体，其中超声波破碎仪的破碎功率为90w，超声5s停10s，超声时间为25min，6000r/min离心8min，收集上清液，置于干净离心管内，25000r/min高速离心15min，收集沉淀，重溶于pH值为8.0的TE缓冲液中，即为纳米氧化锰初提物；
e.纳米氧化锰的纯化：向纳米氧化锰初提物中加入木瓜蛋白酶，至终浓度为4mg/mL，37℃水浴30min，去除纳米氧化锰表面残留的蛋白后，6000r/min低速离心10min，舍弃为残留蛋白的沉淀，收集上清液，25000r/min高速离心15min，收集沉淀，重溶于超纯水中，即为高纯度纳米氧化锰。
实验结果：所得到的纳米氧化锰颗粒，利用纳米激光粒度仪测量，粒径范围为30-80nm，采用X射线光电子能谱技术，锰离子的存在状态为正二价，表明制备的氧化锰纳米粒子为一氧化锰。
实施例4
利用菌株芽孢杆菌cas8(Bacillus.sp)制备纳米氧化锰的方法，包括以下步骤：
a.芽孢杆菌cas8(Bacillus.sp)的培养：采用YEP培养基，其中YEP培养基由胰蛋白胨20g，酵母膏15g，氯化钠10g，纯水1000mL制成，挑取芽孢杆菌cas8(Bacillus.sp)单菌落至含100mLYEP培养基的锥形瓶中，28℃恒温振荡培养2d，200r/min，至菌群数量达到108CFU/mL；
b.诱导剂的添加：向菌群数量达到108CFU/mL的培养基中，加入诱导剂十二烷基磺基甜菜碱，使得诱导剂终浓度为3mg/L，继续28℃恒温、200r/min振荡培养12h，至菌群数量达到109CFU/mL；
c.高锰酸钾的添加：待芽孢杆菌cas8(Bacillus.sp)菌群数量达到109CFU/ml时，向100mL培养基中添加12.6mL浓度为0.08mol/L的KMnO4溶液，使得KMnO4终浓度为1.6wt％，继续28℃恒温、200r/min振荡培养4d，至培养基颜色由红色变为灰色，培养基内高锰酸钾全部被还原，视为培养完成；
d.纳米氧化锰的分离提取：芽孢杆菌cas8(Bacillus.sp)培养完成后，取培养液置于离心管内，10000r/min，离心5min，弃去上清液，收集菌体沉淀，沉淀重悬于pH值为8.0的TE缓冲液中，加入溶菌酶至终浓度为10mg/mL，37℃水浴30min，水浴完成后，利用超声波破碎仪破碎残留菌体，其中超声波破碎仪的破碎功率为100w，超声5s停10s，超声时间为30min，8000r/min，离心10min，收集上清液，置于干净离心管内，30000r/min高速离心20min，收集沉淀，重溶于pH值为8.0的TE缓冲液中，即为纳米氧化锰初提物；
e.纳米氧化锰的纯化：向纳米氧化锰初提物中加入胰蛋白酶，至终浓度为5mg/mL，37℃水浴60min，去除纳米氧化锰表面残留的蛋白后，6000r/min低速离心20min，舍弃沉淀，收集上清液，30000r/min高速离心20min，收集沉淀，重溶于超纯水中，即为高纯度纳米氧化锰。
实验结果：所得到的纳米氧化锰颗粒，利用纳米激光粒度仪测量，粒径范围为20-60nm，采用X射线光电子能谱技术，锰离子的存在状态为正二价，表明制备的氧化锰纳米粒子为一氧化锰。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅限于上述实施例，与本发明构思无差异的各种工艺方案均在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一株纳米氧化锰产生菌，其特征在于：所述菌株的名称为芽孢杆菌cas8(Bacillus.sp)，保藏编号为CCTCC NO：M2018423，保藏日期为2018年7月2日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。
2.利用权利要求1所述的纳米氧化锰产生菌制备纳米氧化锰的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)菌株芽孢杆菌cas8的培养：挑取芽孢杆菌cas8单菌落至YEP培养基中进行恒温振荡培养；
(2)诱导剂的添加：向步骤(1)的培养产物中，加入诱导剂，使诱导剂终浓度为1-3mg/L，继续恒温振荡培养；所述诱导剂为2,4-二硝基苯酚、芹菜素硬脂酸酯、十二烷基磺基甜菜碱、吐温60中的一种或多种；
(3)高锰酸钾的添加：向步骤(2)的培养产物中，添加KMnO4溶液，调节KMnO4终浓度为0.8-1.6wt％，继续恒温振荡培养；
(4)纳米氧化锰的分离提取：取步骤(3)中的培养液离心，弃去上清液，收集菌体沉淀，沉淀重悬于TE缓冲液中，加入溶菌酶至终浓度为5-10mg/mL，37℃水浴20-30min，水浴完成后，利用超声波破碎仪破碎残留菌体，离心收集上清液，随后高速离心，收集沉淀，重溶于TE缓冲液中，即为纳米氧化锰初提物；
(5)纳米氧化锰的纯化：向纳米氧化锰初提物中加入蛋白酶，调节蛋白酶终浓度为2-5mg/mL，37℃水浴30-60min后，低速离心收集上清液，将上清液进行高速离心，收集沉淀，重溶于超纯水中。
3.根据权利要求2所述的纳米氧化锰产生菌制备纳米氧化锰的方法，其特征在于：所述步骤(1)中挑取芽孢杆菌cas8单菌落至含有100mLYEP培养基的锥形瓶中，培养条件为28℃恒温、150-200r/min振荡培养1-2d，培养至菌群数量达到107-108CFU/mL。
4.根据权利要求2所述的纳米氧化锰产生菌制备纳米氧化锰的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的培养条件为28℃恒温、150-200r/min振荡培养6-12h，至菌群数量达到108-109CFU/mL。
5.根据权利要求2所述的纳米氧化锰产生菌制备纳米氧化锰的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的培养条件为28℃恒温、150-200r/min振荡培养2-4d，至培养基颜色由红色变为灰色，视为培养完成。
6.根据权利要求2所述的纳米氧化锰产生菌制备纳米氧化锰的方法，其特征在于：所述步骤(4)中第一次离心的转速为8000-10000r/min，离心时间为5min，第二次离心的转速为5000-8000r/min，离心时间为5-10min，高速离心的转速为20000-30000r/min，离心时间为10-20min。
7.根据权利要求2所述的纳米氧化锰产生菌制备纳米氧化锰的方法，其特征在于：所述步骤(4)中TE缓冲液的pH值为8，所述超声波破碎仪的破碎功率为80-100w，超声5s停10s，超声时间为20-30min。
8.根据权利要求2所述的纳米氧化锰产生菌制备纳米氧化锰的方法，其特征在于：所述步骤(5)中蛋白酶为蛋白酶K、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、羧肽酶、中性蛋白酶中的一种或多种。
9.根据权利要求2所述的纳米氧化锰产生菌制备纳米氧化锰的方法，其特征在于：所述步骤(5)中低速离心的转速为5000-6000r/min，离心时间为10-20min，高速离心的转速为20000-30000r/min，离心时间为10-20min。
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