CN109825459B

CN109825459B - 一株偶联产氢的异化铁还原细菌

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Publication number: CN109825459B
Application number: CN201910249017.3A
Authority: CN
Inventors: 刘洪艳; 李凯强
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2019-03-29
Filing date: 2019-03-29
Publication date: 2021-09-14
Anticipated expiration: 2039-03-29
Also published as: CN109825459A

Abstract

本发明涉及微生物领域，特别是涉及一种能够同时产氢又异化铁还原的丁酸梭菌。所述丁酸梭菌具体为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)LQ25，保藏编号：CGMCC NO.16862。该菌株同时具有异化铁还原及厌氧发酵产氢能力。菌株能够利用可溶性Fe(III)与不可溶性Fe(III)作为电子受体进行异化铁还原；能够利用蔗糖，葡萄糖和丙酮酸钠等进行厌氧发酵产氢；在Fe(III)为电子受体，葡萄糖等为电子供体的氧化还原培养体系中，菌株LQ25具有同时异化铁还原与厌氧发酵产氢的性质，而且产氢量在异化铁还原的偶联产氢过程中明显提高。菌株LQ25的发酵产氢与异化铁还原性质偶联关系紧密，这为研究发酵型异化铁还原菌提供了新的选择。

Description

一株偶联产氢的异化铁还原细菌

技术领域：

本发明涉及微生物领域，特别是涉及一种能够同时产氢又异化铁还原的细菌。

背景技术：

微生物异化铁还原是一种以Fe(III)为电子受体，并将Fe(III)还原成Fe(II)的微生物代谢过程，是自然界中Fe(III)还原的主要途径。自Lovley等首次从沉积物中分离到异化铁还原菌Geobacter metallireducens GS-15(Anaerobic production of magnetiteby a dissimilatory iron-reducing microorganism[J].Nature,1987,330(6145):252-254)，研究人员陆续从不同厌氧环境中，分离出多株异化铁还原细菌(权海荣,李杰,王亚娥,等.两株铁还原菌的分离鉴定及特性研究[J].广东化工,2016,43(18):18-20.)。

微生物异化铁还原过程涉及多种元素的价态变化，可驱动重金属解毒与固定，在重金属污染物去除过程中具有非常重要的意义。此外，一些铁还原菌能将有机物的厌氧发酵过程与异化Fe(III)还原过程相耦联(游萍,贾蓉,乔莎莎,等.碳源浓度对微生物发酵产氢及铁还原特征的影响[J].农业环境科学学报,2015,(04):722-727.)，分解剧毒有机物，产生新型能源。

氢能作为环保型能源，以高效、清洁、可再生等优点受到人们青睐，氢能开发和利用已成为全世界能源战略的焦点之一(Logan B E,Rabaey K.Conversion of wastes intobioelectricity and chemicals by using microbial electrochemicaltechnologies.Science,2012,337(6095):686-690.)。在能源短缺和环境污染的背景下，生物制氢的重要性不言而喻。

微生物异化铁还原过程偶联厌氧发酵产氢，能够达到环境污染治理与新型能源开发的双重目的。Liu等将产氢细菌BH18进行了转座子突变，通过突变菌株的筛选，获得一株既产氢又异化铁还原突变菌株(Microbial Fe(III)reduction and hydrogen productionby a transposon-mutagenized strain of Pantoea agglomerans BH18.Energy,2015,81:691-695.)。张月超等从黄河三角洲滨海湿地分离得到了一株细菌Clostridiumbifermentans EZ-1(张月超,肖雷雷,王欧美,等.异化铁还原梭菌Clostridiumbifermentans EZ-1产氢与电化学特性[J].微生物学报,2018.58(4):524-537)。该菌株同时具有产氢、产电和异化铁能力，拓宽多功能微生物种质资源。

但现有技术中兼具产氢和异化铁还原的细菌同时产氢和异化铁还原的能力均有待提高。

发明内容:

海洋沉积物因其特殊的厌氧环境有利于铁氧化物的累积富集，而成为铁还原微生物的重要生境。本发明以海洋沉积物为材料，筛选一株厌氧梭菌。该菌株同时具有异化Fe(III)性质和发酵产氢能力。

所述菌株具体为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)LQ25，该菌株已于2018年12月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号：CGMCCNO.16862。

菌株LQ25为革兰氏阳性菌，固体培养基中菌落形态呈圆形、乳白色、边缘整齐、表面光滑、微凸起；电子显微镜下，菌株LQ25的形态呈梭杆状。

菌株LQ25具有异化铁还原能力：当Fe(III)为可溶性形式，即电子受体为柠檬酸铁(20mmol/L)时，累积产生Fe(II)浓度为6.13mmol/L；当Fe(III)为不可溶性形式，即电子受体为氢氧化铁(20mmol/L)时；累积产生Fe(II)浓度为2.45mmol/L。

菌株LQ25具有厌氧发酵产氢能力：菌株LQ25能分别利用蔗糖、葡糖糖和丙酮酸钠为碳源进行厌氧发酵产氢，其中菌株利用葡萄糖为碳源产氢量最高，达到0.76mol H₂/mol葡萄糖；其次是蔗糖，产氢量为0.65mol H₂/mol蔗糖；菌株LQ25利用丙酮酸钠的产氢量是0.50mol H₂/mol丙酮酸钠。

菌株LQ25分离自海底淤泥，通过设置不同NaCl浓度：4‰、30‰、40‰、50‰和60‰，分析菌株在不同盐度下发酵产氢性质。结果表明，菌株能够在设定NaCl浓度范围进行生长与产氢，其中，淡水条件，即NaCl浓度为4‰，菌株利用葡萄糖为碳源产氢量最高，达到0.91mol H₂/mol葡萄糖；海水培养条件下，即NaCl浓度为30‰，菌株产氢量是0.76mol H₂/mol葡萄糖。当NaCl浓度提高至60‰，菌株仍能产氢，产氢量是0.26mol H₂/mol葡萄糖。可见，菌株LQ25在淡水和海水条件下都能够利用葡萄糖发酵产氢，在淡水条件下的产氢能力更高。

菌株LQ25具有偶联异化铁还原和产氢的能力：

在以可溶性Fe(III)为电子受体，不同碳源为电子供体的氧化还原培养体系中，菌株LQ25利用葡萄糖为碳源进行异化铁还原与厌氧发酵时，体系累积Fe(II)浓度达到6.13mmol/L，菌株累积产氢量为1.78mol H₂/mol葡萄糖；菌株LQ25利用蔗糖为碳源时，累积Fe(II)浓度达到5.77mmol/L，产氢量为1.32mol H₂/mol蔗糖；菌株LQ25利用丙酮酸钠为碳源时，累积Fe(II)浓度是4.86mmol/L，产氢量为1.25mol H₂/mol丙酮酸钠。

在以不可溶性Fe(III)为电子受体，不同碳源为电子供体的氧化还原培养体系中，菌株LQ25能够利用葡萄糖为碳源进行异化铁还原与厌氧发酵，体系累积Fe(II)浓度达到2.45mmol/L，菌株累积产氢量为1.01mol H₂/mol葡萄糖；菌株LQ25利用蔗糖为碳源时，累积Fe(II)浓度2.02mmol/L，产氢量为0.96mol H₂/mol蔗糖；菌株LQ25利用丙酮酸钠为碳源时，累积Fe(II)浓度是1.53mmol/L，产氢量为0.90mol H₂/mol丙酮酸钠。

本发明还提供菌株LQ25的应用，包括在异化铁还原、产氢、以及异化铁还原偶联产氢中的应用；

采用菌株LQ25异化铁还原或异化铁还原偶联产氢的方法如下：

将菌株LQ25按1-5％的接种量接入以蔗糖、葡萄糖或丙酮酸钠为碳源的发酵培养基中，同时添加10-50mmol/L Fe(III)作为电子受体，25-35℃，100-150r/min，厌氧培养36-72h，进行异化铁还原和/或产氢；

采用菌株LQ25产氢的方法如下：

将菌株LQ25按1-5％的接种量接入以蔗糖、葡萄糖或丙酮酸钠为碳源的发酵培养基中，无氧条件下，25-35℃，100-150r/min，培养36-72h。

优选地，所述碳源为葡糖糖；

所述Fe(III)为可溶性或非可溶性；

优选地，所述Fe(III)为可溶性柠檬酸铁；

优选地，所述异化铁还原或异化铁还原偶联产氢发酵培养基组成为(g/L):葡糖糖20，胰蛋白胨1，NaCl 4-60，K₂HPO₄ 1.5，柠檬酸铁20mmol/L；

更优选地，NaCl浓度为4-30g/L，更优选地NaCl浓度为4g/L；

优选地，所述产氢的发酵培养基组成为(g/L):葡糖糖20，胰蛋白胨1，NaCl 4-60，K₂HPO₄1.5；

更优选地，NaCl浓度为4-30g/L，更优选地NaCl浓度为4g/L。

有益效果：

本发明提供一株革兰氏阳性细菌LQ25，该菌株同时具有异化铁还原及厌氧发酵产氢能力。菌株能够利用可溶性Fe(III)与不可溶性Fe(III)作为电子受体进行异化铁还原。通过设置不同碳源，结果表明菌株LQ25能够利用蔗糖，葡萄糖和丙酮酸钠等进行厌氧发酵产氢过程。在Fe(III)为电子受体，葡萄糖等为电子供体的氧化还原培养体系中，菌株LQ25具有同时异化铁还原与厌氧发酵产氢的性质，而且产氢量在异化铁还原的偶联产氢过程中明显提高。菌株LQ25在无铁、不可溶Fe(III)与可溶性Fe(III)作为电子受体的三种培养条件下，菌株利用葡萄糖厌氧发酵的产氢量分别是0.76mol H₂/mol葡萄糖，1.01mol H₂/mol葡萄糖和1.78mol H₂/mol葡萄糖。菌株LQ25的发酵产氢与异化铁还原性质偶联关系紧密，这为研究发酵型异化铁还原菌提供了新的选择。

附图说明：

图1菌落形态图；

图2电子显微镜下菌株LQ25菌体形态图；

图3菌株LQ25异化铁还原性质

其中，图a为以不溶性Fe(III)为电子受体，图b为以可溶性Fe(III)为电子受体；

图4菌株LQ25利用不同碳源厌氧发酵产氢性质；

图5 NaCl浓度对菌株LQ25发酵产氢的影响；

图6菌株LQ25异化铁还原与产氢过程的偶联

其中，图a碳源为葡萄糖，图b碳源为蔗糖，图c碳源为丙酮酸钠；

图7 NaCl浓度对菌株LQ25异化铁还原与产氢耦联的影响

其中，图a电子受体为氢氧化铁，图b电子受体为柠檬酸铁。

具体实施方式：

下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

下面结合具体实施例对本发明技术方案做进一步说明。

实施例1.菌株Clostridium butyricum LQ25的筛选及鉴定

本发明筛选菌株所用泥样取自于天津海域的海底污泥。

(1)初筛

分离培养基(g/L):葡萄糖20，胰蛋白胨1，NaCl 30，K₂HPO₄ 1.5，Fe(OH)₃按体积百分比2％加入。

取10g污泥于80℃，10min进行热休克预处理，将污泥加入含100mL分离培养基的血清瓶中，充氮气5min，密封瓶口，于恒温摇床中30℃、120rpm培养48h。厌氧培养液按梯度稀释后，采用三层平板法分离，即在第一层固体培养基划线，再倒入琼脂作为隔离氧气覆盖，待第二层固体冷却凝固，最后倒入一层灭菌固体石蜡，作为第三层平板，保证厌氧环境，30℃培养48h，平板长出菌落时，挑取第一层平板有透明圈(或颜色变淡)且第三层石蜡发生鼓起的单菌落(图1)。

(2)复筛

挑取的单菌落接到厌氧螺口管(内含发酵管)中，30℃培养24h。铁还原能力的初步判断是通过分离培养基颜色的变化，选取培养基颜色变浅的菌株，测定液体培养基中Fe(II)浓度。产气情况是利用发酵管内气泡进行判断，如果观察到发酵管内有气泡，就表明该菌株有产气行为，气泡大小则可以判定菌株的产气能力。选取液体培养基中Fe(II)浓度高同时内含发酵管有气泡的菌株，将它们分别接种固体培养基，在三层平板中进行培养和再分离，重复此过程3～5次，筛选一株同时产氢与异化铁还原细菌，命名为LQ25。

(3)菌株LQ25的鉴定：

肉眼观察菌落形态呈圆形、乳白色、边缘整齐、表面光滑、微凸起；

光学显微镜下观察菌株革兰氏染色呈阳性；

电子显微镜观察菌株LQ25的形态呈现梭杆状(图2)。16SrDNA测序鉴定，测定16SrDNA序列长度为1441bp，在NCBI数据库中该基因序列进行Blast同源比对分析，结果表明该菌株与梭菌属细菌具有99％以上的同源性，确定菌株LQ25属于丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)。

实施例2.菌株LQ25异化铁还原能力

(1)以不溶性Fe(III)为电子受体

Fe(III)以人工合成Fe(OH)₃形式添加至培养基中(培养基(g/L):胰蛋白胨1，NaCl30，K₂HPO₄ 1.5)，葡萄糖(20g/L)为电子供体，Fe(OH)₃(20mmol/L)为电子受体，菌株LQ25接种量为1％，30℃，120r/min进行厌氧培养60h，测定菌株细胞蛋白质浓度，以表示菌株细胞生长；测定培养液累积Fe(II)浓度，以分析菌株异化铁还原能力。

结果表明：培养时间24h时，培养液中开始累积产生Fe(II)，培养过程中，菌株细胞累积蛋白质浓度与培养液累积Fe(II)浓度逐步提高。在培养60h时，蛋白质浓度是118mg/L，累积Fe(II)浓度为2.45mmol/L(图3a)。表明菌株LQ25能够还原不可溶性Fe(OH)₃中Fe(III)，具备还原不可溶性Fe(III)的能力。

(2)以可溶性Fe(III)为电子受体

将步骤(1)中的Fe(OH)₃替换为柠檬酸铁(20mmol/L)，其他条件不变；

结果表明：柠檬酸铁为电子受体时，菌株LQ25在培养时间12h时进入细胞对数生长期并开始累积Fe(II)。培养至60h时，菌株细胞累积蛋白质浓度是215mg/L，累积Fe(II)浓度为6.13mmol/L(图3b)。以柠檬酸铁为电子受体时，体系累积Fe(II)浓度较高，表明菌株LQ25更容易利用可溶性Fe(III)进行异化铁还原。

实施例3.菌株LQ25厌氧发酵产氢

通过设置不同碳源：蔗糖，葡萄糖，丙酮酸钠，乳酸钠，乙酸钠，甲酸钠。以葡萄糖(20g/L)为固定含碳量标准，其它碳源按等摩尔碳换算。培养基其它成分相同：胰蛋白胨1g/L，NaCl 30g/L，K₂HPO₄ 1.5g/L。菌株LQ25按相同接种比例1％分别培养于含不同碳源的培养基中。充氮气5min，保证血清瓶内无氧培养环境，30℃，120r/min厌氧培养60h，分析菌株LQ25利用不同碳源厌氧发酵产氢性质。

结果表明，菌株LQ25能够利用蔗糖，葡萄糖和丙酮酸钠进行生长及发酵产氢，而对于碳源，乳酸钠，乙酸钠和甲酸钠，菌株几乎不能利用。菌株LQ25利用蔗糖，葡萄糖和丙酮酸钠产生的氢气量分别为0.65mol H₂/mol碳源，0.76mol H₂/mol碳源和0.50mol H₂/mol碳源。菌株LQ25利用葡萄糖为碳源时产氢量最高。在以乳酸钠，乙酸钠和甲酸钠为碳源的培养条件中，菌株LQ25不能利用这些碳源进行发酵产氢，而且菌株利用这些碳源进行生长的状况不够活跃，细胞蛋白质浓度测定值比较低(图4)。

将上述培养基中的NaCl设置为不同浓度：4‰、30‰、40‰、50‰和60‰，培养基其它成分相同：葡萄糖20g/L，胰蛋白胨1g/L，K₂HPO₄ 1.5g/L。菌株LQ25按相同接种比例1％分别培养于含不同NaCl浓度培养基中。充氮气5min，保证血清瓶内无氧培养环境，30℃，120r/min厌氧培养60h，分析菌株LQ25在不同盐度下厌氧发酵产氢性质。

结果表明，菌株能够在设定NaCl浓度范围进行生长与产氢，其中，淡水条件，即NaCl浓度为4‰，菌株利用葡萄糖产氢量是0.91mol H₂/mol葡萄糖；海水培养条件下，即NaCl浓度为30‰，菌株产氢量是0.76mol H₂/mol葡萄糖。NaCl浓度为40‰，菌株产氢量是0.56molH₂/mol葡萄糖，NaCl浓度为50‰，菌株产氢量是0.34mol H₂/mol葡萄糖，NaCl浓度为60‰，菌株产氢量是0.26mol H₂/mol葡萄糖。菌株在淡水和海水条件下都能够利用葡萄糖发酵产氢，在淡水条件下的产氢能力更高(图5)。

实施例4.菌株LQ25异化铁还原与产氢过程的偶联

(1)葡萄糖、蔗糖和丙酮酸钠为电子供体时，分别设置Fe(OH)₃与柠檬酸铁为电子受体，菌株LQ25在厌氧培养条件进行异化铁还原与发酵产氢。

将菌株LQ25按1％的接种量分别接入以蔗糖、葡萄糖或丙酮酸钠为碳源的发酵培养基中，同时添加20mmol/L Fe(III)作为电子受体，30℃，120r/min，厌氧培养60h，进行异化铁还原和/或产氢；

所述发酵培养基组成为(g/L)：葡萄糖20，胰蛋白胨1，NaCl 30，K₂HPO₄ 1.5，Fe(III)20mmol/L；(蔗糖和丙酮酸钠为电子供体时，添加量与葡萄糖进行等摩尔换算)

柠檬酸铁作为可溶性Fe(III)和氢氧化铁作为不可溶性Fe(III)，即电子受体选取不同形态Fe(III)，浓度均设置为20mmol/L，培养60h，测定产氢量和培养液累积Fe(II)浓度。

结果表明：

葡萄糖为碳源，菌株LQ25利用柠檬酸铁和氢氧化铁为电子受体进行厌氧发酵培养时，菌株LQ25异化铁还原能力存在较明显差别，体系累积Fe(II)浓度分别6.13mmol/L和2.45mmol/L。在异化铁还原培养体系中，菌株仍具有厌氧发酵产氢能力。以葡萄糖为电子供体，柠檬酸铁电子受体时，菌株LQ25厌氧发酵产氢量最高，达到1.78mol H₂/mol。以葡萄糖为电子供体，氢氧化铁电子受体时，菌株LQ25厌氧发酵产氢量是1.01mol H₂/mol。在异化铁还原培养条件下，菌株LQ25能够同时还原Fe(III)与产氢，而且菌株产氢量要明显高于无Fe(III)添加条件下的产氢量(0.76mol H₂/mol)(图6a)。

相同地，碳源是蔗糖，而电子受体分别是柠檬酸铁和氢氧化铁时，菌株LQ25同时具有异化铁还原与产氢能力。体系累积Fe(II)浓度分别是5.77mmol/L和2.02mmol/L，菌株产氢量分别是1.32mol H₂/mol和0.96mol H₂/mol(图6b)。

当碳源是丙酮酸钠，菌株LQ25分别利用柠檬酸铁和氢氧化铁为电子受体同时进行异化铁还原与产氢，体系累积Fe(II)浓度分别是4.86mmol/L和1.53mmol/L，而菌株产氢量分别是1.25mol H₂/mol和0.90mol H₂/mol(图6c)。

由此可见，菌株LQ25具有同时产氢与异化Fe(III)还原能力，而且产氢量与异化铁还原效率呈正相关的偶联关系。

(2)葡萄糖为电子供体时，分别设置Fe(OH)₃与柠檬酸铁为电子受体，30℃，120r/min，厌氧培养60h，分析1％接种量菌株LQ25在不同NaCl浓度条件进行异化铁还原与发酵产氢。

发酵培养基组成为(g/L)：葡萄糖20，胰蛋白胨1，K₂HPO₄ 1.5，Fe(III)20mmol/L；

柠檬酸铁作为可溶性Fe(III)和氢氧化铁作为不可溶性Fe(III)，即电子受体选取不同形态Fe(III)，浓度均设置为20mmol/L，厌氧培养60h，测定产氢量和培养液累积Fe(II)浓度。

结果表明：氢氧化铁为电子受体进行厌氧发酵培养时，菌株LQ25在不同NaCl浓度下异化铁还原与产氢能力存在差别。淡水条件，即NaCl浓度为4‰，菌株利用葡萄糖产氢量是1.45mol H₂/mol葡萄糖，体系累积Fe(II)浓度3.86mmol/L。海水条件，即NaCl浓度为30‰，菌株利用葡萄糖产氢量是1.01mol H₂/mol葡萄糖，体系累积Fe(II)浓度2.45mmol/L。在海水条件下，继续增加NaCl浓度，菌株仍具有异化铁还原与产氢能力，但相应累积Fe(II)浓度和产氢量都有下降(图7a)。

在异化铁还原培养体系中，葡萄糖为电子供体，柠檬酸铁电子受体，与海水条件相比，菌株LQ25在淡水条件下异化铁还原效率与厌氧发酵产氢量都有提高。淡水条件，即NaCl浓度为4‰，菌株利用葡萄糖产氢量是2.11molH₂/mol葡萄糖，体系累积Fe(II)浓度8.56mmol/L。海水水条件，即NaCl浓度为30‰，菌株利用葡萄糖产氢量是1.78mol H₂/mol葡萄糖，体系累积Fe(II)浓度6.13mmol/L(图7b)。菌株LQ25虽分离自海洋环境，在淡水和海水条件下都能够利用Fe(III)进行异化铁还原，并偶联厌氧发酵产氢过程。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

Claims

1.一株同时具有异化铁还原性质和发酵产氢能力的丁酸梭菌(Clostridium butyricum) LQ25，其特征在于，保藏编号：CGMCC NO.16862。

2.权利要求1所述丁酸梭菌在产氢中的应用。

3.权利要求1所述丁酸梭菌在异化Fe(III)还原中的应用。

4.权利要求1所述丁酸梭菌在异化铁还原偶联产氢中的应用。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，方法如下：

将菌株LQ25按1-5%的接种量接入以蔗糖、葡萄糖或丙酮酸钠为碳源的发酵培养基中，无氧条件下，25-35℃，100-150 r/min，厌氧培养36-72 h。

6.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于，方法如下：

将菌株LQ25按1-5 %的接种量接入以蔗糖、葡萄糖或丙酮酸钠为碳源的发酵培养基中，同时添加10~50 mmol/L Fe(III)作为电子受体，25-35℃，100-150 r/min，厌氧培养36-72h，进行异化铁还原或异化铁还原偶联产氢。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述碳源为葡糖糖。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述碳源为葡糖糖。

9.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基组成为：葡糖糖20 g/L，胰蛋白胨 1 g/L，NaCl 4-60 g/L，K₂HPO₄ 1.5 g/L。

10.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基组成为：葡糖糖20 g/L，胰蛋白胨 1 g/L，NaCl 4-60 g/L，K₂HPO₄ 1.5 g/L，柠檬酸铁 20 mmol/L。

11.如权利要求9或10所述的应用，其特征在于NaCl浓度为4 g/L。