KR101173468B1 - 엔터로박터속 균주 ｅｓ392 ｋａｃｃ 91568ｐ 및 이에 의한 수소 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 수소를 생산하는 신규의 미생물 및 이에 의한 수소 생산 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 수소를 생산하는 신규의 혐기성 균주 및 상기 균주의 수소 생산에 영향을 미치는 배지 조성 및 배양 조건을 최적화하여 수소를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 엔터로박터 속 ES392 KACC 91568P와 온도 25 ~ 40℃ 및 pH 6 ~ 8에서, 배지의 탄소원으로 0.1% 내지 4%(w/v)의 수크로스, 글루코스, 프럭토스, 질소원으로 0.1% 내지 0.5%(w/v)의 펩톤, 트립톤, 또는 효모 추출물을 사용하고, 0.1 mM 내지 50 mM 인산칼륨을 이용하여 ES392 균주를 배양하여 수소를 생산하는 방법을 제공한다. 또한 유기성 폐기물을 첨가하여 수소를 생산하는 방법을 제공한다.

Description

엔터로박터속 균주 ＥＳ392 ＫＡＣＣ 91568Ｐ 및 이에 의한 수소 생산 방법{Enterobacter sp．ES392 KACC 91568P and method of producing hydrogen by using the same}

본 발명은 수소를 생산하는 신규의 미생물 및 이에 의한 수소 생산 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 수소를 생산하는 신규의 혐기성 균주 및 상기 균주의 수소 생산에 영향을 미치는 배지 조성 및 배양 조건을 최적화하여 수소를 생산하는 방법에 관한 것이다.

전 세계적으로 에너지 문제에 대한 관심도가 높아지면서 대체 에너지에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그 중에 미래 에너지로 크게 각광받고 있는 수소 에너지는 고효율, 고부가가치, 환경 친화적이라는 장점을 지니고 있다. 기존의 수소 생산방법은 물의 전기분해나 탄화수소의 열분해 등의 공정상에 많은 에너지가 소비되는 단점을 가지고 있어, 현재는 미생물을 이용한 수소생산 연구가 활발히 진행되고 있다.

현재 수소생산을 위한 생물학적인 방법으로는 조류의 광합성을 이용하는 방법과 혐기성 세균의 유기물 발효를 이용하는 방법이 있다. 이 중 혐기성 세균에 의한 방법은 태양광 유무에 관련 없이 지속적이며, 소규모로 수소생산이 가능하다는 이점을 가지고 있다. 또한 발효 산물로 생산되는 다양한 유기산은 수소생산의 기질로 이용되어 혐기발효와 광합성 배양을 계속적으로 진행하거나, 해당 미생물을 동시 배양할 때 유기물로부터 수소생산을 최대화할 수 있다. 혐기성 세균에 의한 수소 생산은 환경조건의 대사경로에 따른 변화에 민감하게 반응하는데, 특히 탄소원의 종류나 pH 등의 환경요인이 크게 지배하는 것으로 알려져 있다. 현재, 가장 잘 알려진 혐기발효 수소생성 박테리아로는 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum), 클로스트리디움 파스테우리아눔(Clostridium pasteurianum), 클렙시엘 라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae ), 클로스트리디움 클루이베리(Clostridium kluyveri) 및 엔터로박터 에어로제네스(Enterobacter aerogenes) 등이 있고 이들을 이용한 수소생산 연구가 활발히 진행되고 있다.

미생물을 이용한 수소생산의 경우에 혐기성 대사과정을 통한 혐기성 세균과 광합성 세균을 이용하는 방법이 알려져 있다. 이러한 미생물의 수소생산에 관한 연구는 인공기질을 이용한 연구로부터 현재는 하수슬러지, 식품제조폐수, 음식폐기물에 이르기까지 다양하며 대상물질이 점점 확대되고 있는 실정이다. 국내에서 수집 가능한 유기성 폐자원은 연간 하수슬러지 226만 ton(수도권 지역), 농산 집하장 폐기물 약 400천 ton (수도권 지역), 음식쓰레기 550만 ton, 축산 분뇨 7118만 ton등이다. 전 세계적으로 발생하는 유기성 폐자원 양을 수소에너지로 환산한다면 약 22억 ton의 바이오에너지 개발이 가능하여 전 세계 연간 에너지 소비의 약 30% 가량의 충당이 가능하다.

본 발명의 주된 목적은 본 발명은 수소를 생산하는 신규의 미생물 균주로 엔터로박터속 ES392 균주를 제공하는 것이다. 또한, 상기 균주의 수소 생산에 영향을 미치는 배지 조성 및 배양 조건을 최적화하여 수소를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수소를 생산하는 신규의 미생물 균주로 엔터로박터속 ES392 균주를 제공한다. 또한, 상기 균주의 수소 생산에 영향을 미치는 배지 조성 및 배양 조건을 최적화하여 수소를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명은 높은 성장속도와 높은 수소생산속도를 갖는 신규한 미생물인 엔터로박터 속 ES392 KACC 91568P 및 이에 의한 유기성 폐기물을 이용한 수소생성 방법을 제공함으로서 수소생산 공정에서 생산효율성 향상을 이룰 수 있으며, 혐기발효공정을 통해 시간적?공간적인 제약 없이 안정적이면서 대량으로 수소를 생산할 수 있으므로 본 발명의 방법을 이용하여 생성된 수소는 청정에너지원으로 직접 사용될 수 있을 뿐만 아니라 연료전지, 화학공업의 원료, 환원제 등으로 사용될 수 있으며, 나아가 녹색발전 산업의 발달에 기여할 것으로 판단된다.

도 1은 균주 분리 및 수소생산에 사용된 반응기 형태를 나타낸다.
(1. 반응기, 2. 가스 조절기, 3. 가스 생산량 측정기, 4. 자석 교반기, 5. 액체 샘플).
도 2는 엔터로박터 속 ES392의 투과전자현미경 사진 (x 40,000)을 나타낸다.
도 3은 엔터로박터 속 세균 중에서 16s rDNA를 바탕으로 한 ES392 균주의 계통학적 위치를 나타낸다.
도 4는 온도 변화에 따른 균체 성장 및 수소생산량을 나타내는 그래프이다.
(기호: ●, 균체 성장; ■, 수소생산량).
도 5는 pH 변화에 따른 균체 성장 및 수소생산량을 나타내는 그래프이다.
(기호: ●, 균체 성장; ■, 수소생산량).
도 6는 탄소원과 질소원의 종류 및 농도에 따른 균체 성장 및 수소생산 변화를 나타내는 그래프이다. (기호: □, 균체 성장; ■, 수소생산량).
도 7은 인산염의 농도에 따른 균체 성장과 수소생산의 영향을 나타내는 그래프이다. (기호: ●, 균체 성장; ■, 수소생산량).
도 8은 인공 합성 배지의 최적의 조건 하에서 배양시간에 따른 pH, 균체 성장, 수소생산량의 변화를 나타내는 그래프이다. (기호: ●, 균체 성장; ■, 수소생산량; ▲, pH).
도 9는 엔터로박터속 ES392 균주의 당밀 및 과일 폐기물로부터의 수소생산량 변화를 내타내는 그래프이다.
도 10은 엔터로박터속 ES392균주의 당밀 및 과일 폐기물로부터 수소생산에 따른 pH 변화를 나타내는 그래프이다.
도 11은 엔터로박터속 ES392 균주의 당밀로부터 수소생산에 대한 FeSO₄ 농도의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 12는 엔터로박터속 ES392 균주의 메론 폐액으로부터 수소생산에 대한 FeSO₄ 농도의 효과를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 수소를 생산하는 신규의 미생물 균주인 엔터로박터속 ES392 KACC 91568P 균주를 제공한다.

본 발명의 엔터로박터속 ES392는 부산 소재 대학교 연못에서 담수시료를 채취하여 균 분리원으로 사용한 것으로서, 형태학적 분석의 결과 길이 1.2 μm의 간균이고, 편모가 없으며, 포자를 형성하지 않는 통성혐기성 균이며, 16S rDNA 염기서열 분석을 위해 BLAST 프로그램과 Clustal W(1.6.6 Version) 프로그램을 이용하여 상동성을 분석한 결과 엔터로박터속(Enterobacter sp.)의 유연균으로 분류되었으며, 계통도를 작성한 결과(도 3), 기존의 엔터로박터속 균주 중에 일치하는 것이 없어 계통도 상에 새로운 균주로 분류되어 최종적으로 엔터로박터속 ES392로 동정되었다. 본 발명의 엔터로박터속 ES392 균주는 국립농업과학원 농업유전자원센터에 2010년 7월 5일에 기탁번호 KACC 91568P로 기탁되었다.

한편, 본 발명의 ES392 균주의 생화학적 특성은 하기 표 1와 같다.

ES392 균주의 생화학적 특성

최적 온도	35 ℃
최적 pH	7.5
베타-갈락토시다제	+
아르기닌 디하이드롤라제	-
라이신 디카르복실라제	+
오르니틴 디카르복실라제	+
시트레이트 이용	-
H2S 생산	-
우레아제	-
트립토판 디아미나제	-
인돌 생산	-
아세토인 생산	-
젤라티나제	-
글루코스	+
만니톨	+
이노시톨	+
솔비톨	+
람노즈	+
수크로스	+
멜리비오스	+
아미그달린	+
아라비노스	+

+ : 양성 반응, - : 음성 반응

또한, 본 발명은 상기 균주의 수소 생산에 영향을 미치는 배지 조성 및 배양 조건을 최적화하여 수소를 생산하는 방법을 제공한다.

하나의 바람직한 구체 예로서, 본 발명의 상기 균주는 다음 배지 조성으로 생장된다.

ES392 균주를 위한 인공합성배지 조성

성분	농도(/L)
효모 추출물	5 g
에탄올	0.5 mL
다이소듐 석시네이트	1 g
(0.1%) 페릭 시트레이트 용액	5 mL
K2HPO4	0.5 g
MgSO4	0.4 g
NaCl	0.4 g
NH4Cl	0.4 g
미량 원소 용액	0.1 mL
CaCl2ㆍ2H2O	0.05 g
(0.1%) 레사주린(Resazurin)	1 mL
*글루코스	2%
	(pH 7.5)

^*별도로 오토클레이브됨

상기 배지 조성에서, 미량원소(trace element)는 종류에 따라 차이가 있으나 미생물이 정상적으로 생장하는 데 반드시 필수불가결한 원소를 말하는 것으로, 본 발명에서는 ZnSO₄?7H₂O 0.1 g, MnCl₂?4H₂O 0.03 g, CoCl₂?6H₂O 0.02 g, CuCl₂?2H₂O 0.01 g, NiCl₂?6H₂O 0.02 g, Na₂MoO₄?2H₂O 0.03 g/L를 포함하는 미량 원소 용액을 사용하였다.

배지의 탄소원은 글루코스, 수크로스, 또는 프럭토스일 수 있으며, 질소원은 효모 추출물, 트립톤, 및 펩톤으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 본 발명에 있어서, 수소 생산 효율을 고려할 때, 탄소원의 농도는 0.1% 내지 4% 이하가 바람직하며, 4%(w/v)의 탄소원 농도가 가장 바람직하다. 또한, 배지의 탄소원은 수소 생산 효율 면에서 바람직하게는 글루코스, 보다 더 바람직하게는 프럭토스, 가장 바람직하게는 수크로스가 이용된다. 수소 생산 효율 면에서 배지의 질소원은 0.1%(w/v) 내지 0.5%가 바람직하며, 0.5%가 가장 바람직하다. 수소 생산 효율면에서 질소원으로서는 바람직하게는 펩톤, 더욱 바람직하게는 트립톤, 가장 바람직하게는 효모 추출물이 이용된다. 탄소원과 질소원을 사용하지 않은 배지에서는 수소 생산이 거의 없는 것으로 나타나, 탄소원과 질소원이 균주의 성장에 중요한 영향을 미치는 것을 알 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 균주의 배양은 pH 6~8, 온도 25~40℃, 및 100~200 rpm으로 수행하는 것이 바람직하다. 상기 배양조건은 혐기배양시에 사용되는 배양조건을 토대로 설정한 것이며, 일반적인 혐기성 균주의 배양조건인 인큐베이터(37℃, 160 rpm)에서 혐기, 암반응 조건에서의 배양을 포함한다. 수소 생산 효율을 고려할 경우, 상기 균주의 배양은 pH 7.5 및 35 ℃에서 이루어지는 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 균주의 배양과 수소 생산을 위해서는, pH 완충제인 인산칼륨을 0~300 mM 농도로 사용하는 것이 바람직하다. 배지에서 인산염의 농도가 증가됨에 따라 수소생산이 증가하였으며, 50 mM 인산칼륨 농도에서 최대의 수소생산이 나타났다. 하지만, 그 이상의 농도에서는 수소생산에 저해 현상이 나타났다. 인산염은 비교적 미생물에게 유독하지 않고 중성 근처의 생리적으로 중요한 범위에서 완충작용을 하는 유일한 무기질로 알려진다. 하지만, 인산염은 높은 농도에서는 성장을 저해하므로 배지에 사용될 수 있는 완충제의 양은 특정생물체의 내성에 의해 제한될 수 있음을 알 수 있다.

본 발명에 있어서, 인공 합성배지에서 엔터로박터속 ES392를 이용한 수소생산의 최적의 조건은 온도 35℃, pH 7.5, 탄소원으로 수크로스, 질소원으로 효모 추출물을 사용하고, 50 mM 인산칼륨을 이용하는 것이며, 이 경우 수소 생산량은 3481 mL/L을 나타내어 기존의 공지의 수소생산 균주들에 비해 월등한 수소 생산 효율을 나타낸다.

본 발명의 다른 하나의 바람직한 구체예로서, 본 발명의 상기 균주는 다음의 배지 조성으로 생장된다.

ES392 균주를 위한 유기성 폐기물을 첨가한 배지 조성

성분	농도(/L)
효모 추출물	2 g
에탄올	0.5 mL
다이소듐 석시네이트	1 g
(0.1%) 페릭 시트레이트 용액	5 mL
K2HPO4	8.7 g
MgSO4	0.4 g
NaCl	0.4 g
NH4Cl	0.4 g
미량 원소 용액	0.1 mL
CaCl2ㆍ2H2O	0.05 g /l
(0.1%) 레사주린(Resazurin)	1 mL
유기성 폐기물	5~16%(v/v)
	(pH 7.5)

또한, 유기성 폐기물을 이용한 엔터로박터 속 ES392균주의 수소생산 실험에서 5%(v/v) 당밀, 0.1%(w/v) FeSO₄, 20mM sodium formate를 첨가할 경우 최종수소 생산량이 5386 mL/L로 나타나, 기존의 수크로스를 탄소원으로 첨가한 인공합성 배지를 사용했을 때의 수소 생산량(3481 mL/L) 보다도 약 1.5배 증가하였다. 따라서 유기성 폐기물을 이용할 경우, 수소생산 원가도 절감하고 수소생산량도 증가시킬 수 있는 것으로 나타났다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

실시예 1: 균주의 분리

자연계에서 수소생산 균주를 분리하기 위해 부산 소재 대학교 연못에서 담수시료를 채취하여 균 분리원으로 사용하였다. 균주 분리 및 수소생산에 사용된 인공합성배지는 상기 표 2과 같으며, (0.1%) 레사주린 (1 mL/L)를 첨가하였다. 질소를 채운 혐기성 챔버에서 균주 분리용 시료를 상기 배지 50 mL이 든 l25 mL 혈청 바틀(serum bottle)에 5% (v/v)를 접종하여 혐기적 조건으로 35℃에서 수 일간 진탕 배양했으며 이 현탁액 1% (v/v)를 다시 새로운 배지에 주입하여 배양하였다. 이와 같은 방법으로 2회 계대배양한 후 평판 배지에 도말하여 생성된 콜로니를 순수분리 하여 선별하였다. 순수분리된 균들은 다시 2%의 글루코스가 첨가된 액체 배지에 접종해서 혐기적 조건에서 배양하여 균체 성장과 발생된 수소가스를 분석해서 최종적으로 우수한 단일 균주 ES392를 선별하였다. 균체농도는 일정 시간 간격으로 채취한 발효액을 분광광도계 (OPTIZEN 2120UV-Plus)를 사용하여 660 nm에서 흡광도를 측정하였다. 배양액의 pH는 pH 미터 (Mettler, Toledo)를 사용하여 실온에서 측정하였다.

실시예 2: 균주의 배양

분리된 균주 ES392는 2주마다 계대 배양하여 4℃에서 보관하였으며, 탄소원으로 사용된 글루코스, 수크로스, 프럭토스는 각각 멸균 후 따로 첨가하였다. 균주배양은 배지 내 용존산소량을 최소화하기 위해 질소가스로 퍼징된 혐기성 챔버에서 실시하였다. 전배양은 배지 50 mL에 분리된 ES392 균주를 접종하여 35℃, 120 rpm에서 1일간 혐기적으로 배양시켰으며, 본배양은 도 1과 같은 실험 장치로서 1 L 혈청 바틀(serum bottle)에 배지를 800 mL 첨가한 후 전배양액 1% (v/v)를 접종하여 35℃, 120rpm에서 배양하였다. pH는 7.5로 맞추었으며, 배양 중 pH는 조절하지 않았다.

실시예 3: 균주의 동정

분리균주 ES392의 형태는 투과전자현미경(JEM 1200EX-Ⅱ electron microscope, JEOL)을 이용하여 관찰하였다. 투과전자현미경 촬영을 위하여 고체배지에 배양한 균체를 pH 7.0의 0.1M 인산염 완충 염수(PBS)을 사용하여 세척하였다. 균체에 2.5% 글루타르알데히드 용액을 첨가하여 1시간 방치한 후 원심분리하고 PBS로 균체를 세척하여 단백질을 고정하였다. 그 다음 50%, 70%, 80%, 90% 및 100% 알코올을 사용하여 단계적으로 사용할 균체를 탈수하였다. 건조과정을 거쳐 40,000배로 확대 촬영하였다. 그 결과, 분리균주의 고체 배지 상에서 콜로니의 형태는 원형에 가까우며, 색깔은 노란색이었으며, 표면은 볼록하고 매끄러운 상태였으며, 도 2의 전자현미경 사진에서 제시된 것과 같이 길이 1.2 μm의 간균이고, 편모가 없으며, 포자를 형성하지 않았다.

균의 성장특성 및 최적성장온도와 최적 pH를 Yoshihiko 등의 방법을 이용하여 조사한 결과, 분리 균주는 4.0 내지 8.0의 pH와 25 내지 40 ℃ 온도에서 생육하였다. API 20E Kit를 이용하여 조사한 생리학적 특징은 상기 표 1와 같이 글루코스, 만니톨, 이노시톨, 솔비톨, 람노스, 수크로스, 멜리비오스, 아미그달린, 아라비노스 등을 이용하였으며, H₂S, 인돌, 아세토인 등은 생성하지 않았다.

또한, 16S rDNA 염기서열을 Pavlova 등의 방법에 따라 분석하고 BLAST 프로그램을 이용하여 상동성을 분석한 결과 98%의 신뢰도로 엔터로박터 속으로 동정 되었고, 생화학적 성질이 엔터로박터 속의 유연균과 일치하였다. 서열 번호 1에 나타난 바와 같은 16S rDNA 염기서열에 근거하여 Clustal w 프로그램으로 계통도(phylogenetic tree)를 작성한 결과, 기존의 엔터로박터 속 균주 중에 일치하는 것은 없었고, 계통도 상에 새로운 균주로 분류되어 최종적으로 본 균주를 엔터로박터 속 ES392로 명명하였다.

실시예 4: ES392 균주의 수소 생산에 대한 배양 조건의 영향 실험

ES392 균주의 수소 생산에 대한 배양 조건의 영향을 조사하기 위하여 다양한 온도, pH, 탄소원, 질소원, 인산염 농도, 배양 시간에서 수소 생산을 조사하였다.

생산되는 수소 양의 분석을 위해서는, 배양 중 발생되는 가스를 바이럴(Viral)에 포집하여, 바이럴의 상부 공간(head space) 가스를 가스가 새지 않는 시린지(gas tight syringe)로 100 μl 취하여 가스 크로마토그래피 (GC)로 분석하였다. 사용된 컬럼은 (6ft x 1/2in) 유리로 분자체 5A (80/100 mesh; Alltech, Deerfield, USA)를 충진 물질로 사용하였으며, 열 전도성 검출기 (TCD)로 분석하였다. 수소분석의 조건은 컬럼 온도 80℃, 인젝터 온도 90℃, 검출기 온도 120℃ 이었으며, 캐리어 기체는 아르곤으로 유량은 35 ㎖/min으로 유지하였다.

(1) 수소 생산에 대한 온도의 영향

초기 배양배지의 온도를 25~45℃까지 변화시켜 ES392 균주의 수소생산에 미치는 영향을 살펴 본바, 초기 25℃에서 35℃까지 온도가 상승함에 따라 수소 생산이 계속적으로 증가하여 35℃에서 최적이었으며, 45℃ 이상의 온도에서는 수소생산이 일어나지 않았다. 이것은 ES392 균주가 중온성 미생물로 45℃ 이상의 온도에서는 균체성장이 저해되기 때문인 것으로 생각된다. 따라서 수소생산이 가장 높은 35℃의 온도가 최적 배양온도임을 알아냈으며 온도에 의한 수소생산 변화를 도 4에 나타내었다.

(2) 수소 생산에 대한 pH 의 영향

배양배지의 초기 pH가 균체성장 및 수소생산에 미치는 영향을 조사하기 위해 pH 6부터 9까지의 조건에서 배양하고 균체성장과 수소생산량을 조사하였다(도 5). 도 5에 나타난 바와 같이 pH 6에서 9까지 균체성장은 비슷한 결과를 나타냈지만 pH 9에서는 수소생산량이 감소하였다. 한편 pH 7.5에서 수소생산량과 균체성장이 가장 높았기 때문에, pH 7.5를 본 균주의 수소생산을 위한 최적 pH로 선정하였다.

(3) 수소 생산에 대한 탄소원의 영향

혐기성 균주의 수소생산능은 배지 조성에 크게 영향을 받는데 탄소원과 질소원의 종류에 따라 수소생산량이 달라진다. ES392 균주의 수소생산에 대한 탄소원의 영향을 조사하기 위하여 각각 다른 농도의 글루코스, 수크로스, 프럭토스를 첨가하여 균체 성장과 수소의 생산량을 검토하였다. 그 결과, 모두 4%(w/v) 농도의 수크로스, 프럭토스, 글루코스에서 각각 1337, 1272, 1082 mL/L의 최대 수소생산량을 얻을 수 있었고, 균체 성장도 수크로스, 프럭토스, 글루코스 순으로 높았다(도 6). 또한 탄소원의 농도는 4%(w/v)까지는 수소생산량이 증가하였으나 그 이상의 농도에서는 거의 변화가 없었다.

(4) 수소 생산에 대한 질소원의 영향

본 균주의 수소생산을 위한 질소원을 알아보기 위하여 효모 추출물, 트립톤, 펩톤을 각각 0.5%(w/v)씩 첨가하여 수소생산에 미치는 영향을 조사하였다. 이때 탄소원은 4%(w/v) 수크로스를 사용하였다. 효모 추출물, 트립톤, 펩톤을 첨가하였을 때 각각 1337, 910 및 442 mL/L의 수소생산량을 얻을 수 있었다(도 6). 따라서 효모 추출물을 첨가한 배지가 수소 생산에 가장 효율적이었다. 또한 효모 추출물의 농도를 0.1%(w/v)에서 2%(w/v)까지 달리하여 수소생산량을 측정한 결과 0.5%까지는 수소생산량이 증가하였으나 그 이상의 농도에서는 거의 변화가 없었다

(5) 수소 생산에 대한 인산염 농도의 영향

pH 완충제인 인산염(phosphate)을 0~300 mM 농도로 첨가하고 pH 7.5로 설정한 배지에서 수소생산의 최적 조건을 조사하였다. 인산염의 농도가 증가됨에 따라 수소생산이 증가하였으며, 50 mM 인산염 농도에서 최대의 수소생산량(3481mL/L)을 나타내어 첨가하지 않은 것에 비해 약 2.6배 정도 수소 생산량이 증가하였다(도 7). 그러나, 50 mM 이상의 농도에서는 수소생산이 저해되는 현상이 나타났다.

(6) 최적조건에서 배양시간에 따른 수소 생산 변화

이상의 실험 결과로부터 ES392 균주의 수소 생산을 위한 최적 조건이 하기 표 4과 같이 확인되었다. ES392 균주를 최적조건 하에서 배양하여 배양시간에 따른 수소 생산의 결과를 도 8에 나타내었다. 배지의 pH는 수소생산이 증가함에 따라 상대적으로 감소하여 36시간 후에는 pH 4.8을 나타내었다. 대수증식기인 6시간부터 수소생산량이 급격히 증가하여 정지기에 접어든 18시간째에 이르러 수소생산이 정지하였고 최대 수소생산량은 3481 mL/L을 나타내었다. 이와 같이 엔터로박터 속 ES392 균주의 수소생산량은 기존 보고된 엔터로박터 에어로제네스 (431 mL/L)와 엔터로박터 클로아캐(Enterobacter cloacae ) YJ-1 (1920 mL/L)의 수소생산량 보다 매우 높은 것으로 나타나서, 본 발명에서 분리한 미생물은 생물학적 수소생산을 위한 균주로 매우 적합한 것으로 판명되었다.

엔터로박터 속 ES392의 인공합성배지의 수소생산 최적 조건

미생물	최적 온도	초기 pH	인산염 완충액 농도	탄소원	질소원
엔터로박터 속 ES392	35℃	7.5	50 mM	4% 수크로스	0.5% 효모 추출물

실시예 5: ES392 균주의 수소 생산에 대한 유기성 폐기물 첨가 배지 실험

(1) 재료 및 방법

1) 균주배양

수소생산배지의 조성은 1 liter당 yeast extract 2 g, ethanol 0.5 mL, disodium succinate 1 g, (0.1%) ferric citrate solution 5 mL, K₂HPO₄ 8.7g, MgSO₄ 0.4g, NaCl 0.4g, NH₄Cl 0.4g, trace element solution 0.1 mL(ZnSO₄7H₂O 0.1g, MnCl₂ 4H₂O 0.03g, CoCl₂6H₂O 0.02g, CuCl₂2H₂O 0.01g, NiCl₂6H₂O 0.02g, Na₂MoO₄2H₂O 0.03g/l), CaCl2ㆍ2H2O 0.05g, 0.1% Resazurin, pH7.5이다. 여기에 최종적으로 유기성 폐기물을 5~16%(v/v) 되게 첨가하였다. 균주의 접종은 배지 내 용존산소량을 최소화하기 위해 이르곤 가스를 채운 혐기성 chamber에서 실시하였다. 전배양은 50 mL의 배지가 든 l25 mL serum 병에 분리된 ES392 균주를 접종하고 35℃, 120 rpm에서 2일간 혐기적으로 배양시켰다. 본배양은 1 L serum 병에 배지를 500 mL 첨가한 후 전배양액 1% (v/v)를 접종하여 전배양과 같은 조건에서 배양하였다.

2) 유기성 폐기물의 조제

실험에 사용된 당밀은 최종농도 50%(v/v)가 되게 증류수로 희석하고 5 M의 H₂SO₄로 pH 3.5가 되게 조정하여 60℃에서 2시간 방치한 후 10 M NaOH를 넣어 pH 6.0로 조정하여 -20℃에 보관 후 사용하였다. 조제된 당밀 희석액은 수소생산배지에 최종농도 5%(v/v)가 되게 첨가하였다. 실험에 사용된 과일 폐기물은 메론, 수박, 사과, 배이고, 과일폐기물을 종류별로 믹서기로 분쇄시킨 후, 발생되는 분리액을 수소생산배지에 최종농도 16%(v/v)가 되게 첨가하였다.

3) 가스분석

배양 중 발생되는 전체가스는 acetic acid buffer (pH 3.0)를 담은 gas collector에 포집하였고, 수소함량은 head space 가스를 gas tight syringe로 100 μl 취하여 gas chromatography (Shimadzu, Japan)로 분석하였다. 사용된 column은 (6ft x 1/2in) glass로 molecular sieve 5A (80/100 marh; Alltech, Deerfield, USA)를 충진 물질로 사용하였으며, thermal conductivity detector (TCD)로 분석하였다. 수소분석의 조건은 column 온도 80℃, injector 온도 90℃, detector 온도 120℃ 이었으며, carrier gas는 argon을 이용하고 flow rate는 35 mL/min으로 유지하였다.

4) 기타 분석

배지 중의 환원당 정량은 배양액을 13,000rpm에서 20분간 원심분리하고, 상등액 200㎕와 DNS 시약 200㎕를 혼합한 후 3분간 끓이고 이 혼합물을 냉각수로 5분 냉각시킨 후 SDW (Sterilized distilled water) 600㎕를 첨가하여 550nm에서 흡광도를 측정하였다. 환원당 농도는 표준곡선에 준하여 정량하였다. 배양액 중의 균체농도는 일정 시간 간격으로 채취한 배양액을 UV-visible spectrophotometer (OPTIZEN 2120UVPlus, Korea)를 사용하여 파장 660 nm에서 흡광도를 측정하였다. 배양액의 pH는 pH meter (Mettler Toledo, USA)를 사용하여 실온에서 측정하였다.

(2) 결과

1) 각종 유기성 폐기물로부터 수소생산

본 실험에서 사용된 농산 폐기물은 사탕수수 당밀과 메론, 배, 수박, 사과로 농산물 도매시장에서 다량 수거하여 물리적으로 전처리한 후 환원당을 분석하였다. 당밀은 환원당이 154.85 ㎍/㎕으로 가장 높았고 당밀>사과>배>메론>수박의 순서로 환원당이 높았다(표 5). 이들 유기성 폐기물은 높은 환원당을 가지고 있어 수소생산에 높은 이용가치를 갖는다. 도 9는 엔터로박터속 ES392 세균에 의한 각종 농산 폐기물로부터 생산된 수소를 나타내었다. 당밀을 이용하였을 때 수소생산은 27시간 만에 수소생산이 최고치에 도달하여 총 2500 mL/L으로 가장 많은 양의 수소가 생산되었다. 과일 폐기물 중에서는 메론 폐기물이 가장 많은 양의 수소가 생산되어 2185 mL/L의 수소생산량을 나타내었고, 배(1518 mL/L), 수박(990 mL/L), 사과(515 mL/L)의 순으로 높은 수소 생산량을 나타내었다. 이 결과에서 수박을 제외하면 수소생산량은 사용된 환원당량과 비례한다는 것을 확인하였다 (표 5). 따라서 사용된 환원당 비율이 높은 당밀과 메론 폐액에서 수소 생산량이 높은 것으로 나타났다. 도 10에서 당밀과 메론, 배, 사과 폐액의 pH는 발효가 진행되는 동안 점차 낮아져 수소 생산이 정지 되었을 때 pH 4.8~5.2를 유지하였고, 수박 폐액에서는 pH가 크게 감소하지 않아 pH 6.1을 유지하였다. 수소 발효 중에는 젖산, 부티르산, 아세트산 등의 유기산이 생성되고 이것은 배양액의 pH 저하를 유도하므로 세포성장에 저해를 가져오는 것으로 알려져 있다.

시료	당밀	메론	배	수박	사과
초기 환원당 (㎍/㎕)	154.85	57.42	100.94	37.57	134.58
잔존 환원당 (㎍/㎕)	12.06	10.26	37.854	9.27	56.16
사용된 환원당(%)	92%	82%	63%	75%	58%

2) 금속이온의 영향

금속이온은 균체생육의 필수적인 cofactor로서 균의 성장을 가속화시키고 대사산물을 향상시키지만 부적절한 금속이온의 농도에서는 균의 성장을 변화시켜 대사산물의 저하를 야기 시킨다. 본 실험에서는 수소생산량이 가장 높은 당밀과 메론 폐액을 이용하여 금속이온의 영향을 조사하였다. 도 11은 당밀을 사용한 배지에 FeSO₄ 농도를 0~5.0 g/L의 농도범위로 첨가시켜 수소생산에 미치는 영향을 조사하였다. 무첨가 조건에서 최종수소생산량은 42시간까지 총 2500 mL/L이였고 FeSO₄의 농도가 증가함에 따라 수소생산량은 급격히 증가하여 1.0 g/L의 FeSO₄ 농도에서는 42시간 만에 5016 mL/L의 수소 생산량을 나타내어 FeSO₄의 무첨가 조건 보다 약 2배 많은 양의 수소를 생산하였다. 그러나 2.5와 5.0 g/L의 FeSO₄ 농도에서는 수소 생산량이 다시 감소하였다.

도 12는 메론 폐액을 사용한 배지에 FeSO₄농도를 0.01~5.0 g/L의 농도범위로 첨가시켜 수소생산에 미치는 영향을 조사하였다. 무첨가 조건에서 최종수소생산량은 42시간까지 총 2185 mL/L이였고 FeSO₄의 농도가 증가함에 따라 수소생산량은 서서히 증가하여 1.0 g/L의 FeSO₄ 농도에서는 최종수소생산량이 3043 mL/L을 나타내어 FeSO₄의 무첨가보다 약 1.5배 많은 양의 수소를 생산하였다. Fe2+ 이온은 hydrogenase를 작동하는 Fe-S와 non Fe-S protein들의 발현에 관여하고 대사 변화를 유도하여 수소 생산에 영향을 미치는 것으로 추측된다. 이와 같이 엔터로박터속 ES392균주는 당밀배지에서 1.0 g/L의 FeSO₄ 농도를 첨가할 경우 수소 생산량이 2배나 증가하는 것을 확인하였다.

3) Formate의 영향

대장균의 수소 생산 메커니즘은 glucose의 소비 과정에서 생산되는 formate의 분해와 밀접한 관련이 있다. E. aerogenes도 또한 glucose로부터 formate를 생산하고 다시 분해한다. 이런 사실은 수소생산이 해당과정(glycolysis) 동안 형성되는 nicotinamide adenin dinucleotide (NADH)의 재산화(reoxidation)에 의해 수소 생산이 향상 될 수 있음을 나타내었다(Tanisho et al. Biohydrogen 2, 131-140). 본 실험에서는 당밀과 1.0 g/L의 FeSO₄를 첨가한 배지에 20 mM sodium formate를 첨가하고 2가지 다른 pH 조건(7.0과 6.2)에서 생산되는 수소량을 조사하였다. 그 결과 표 6에서와 같이 엔터로박터속 ES392균주는 개시 pH가 7.0일 경우 5386 mL/L의 수소량을 나타내어 formate 첨가에 따라 약 370 mL/L의 수소 생산량이 증가하였다. 개시 pH가 6.2일 경우는 오히려 수소 생량이 감소 하였다. 이 결과에서 첨가된 formate는 NADH의 양적 증가에 기여하고 이로 인해 수소 생산량이 향상되는 것으로 추측된다. 또한 배지중의 pH는 7.0에서 시작하는 것이 수소 생산에 유리한 것으로 나타났다.

배지의 개시 pH	배지의 최종 pH	수소 생산량 (mL/L)
6.2	5.08	4316
7.0	5.20	5386

(3) 결론

유기성 폐기물을 이용한 엔터로박터속 ES392균주의 수소생산 실험에서 5%(v/v) 당밀, 0.1%(w/v) FeSO4, 20 mM sodium formate를 첨가할 경우 최종수소 생산량이 5386 mL/L로 나타나, 기존의 수크로스를 탄소원으로 첨가한 인공합성 배지를 사용했을 때의 수소 생산량(3481 mL/L) 보다도 약 1.5배 증가하였다. 따라서 유기성 폐기물을 이용할 경우, 수소생산 원가도 절감하고 수소생산량도 증가시킬 수 있는 것으로 나타났다.

국립농업과학원 농업유전자원센터 KACC91568 20100705

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6. 유기성 폐기물, 0.01 ~ 5.0 g/L FeSO_4, 및 1.0~30.0mM 소듐 포메이트(sodium formate)를 포함하는 배지에서 엔터로박터속 ES392(수탁번호: KACC 91568P)를 배양하는 단계;를 포함하는 수소 생산 방법.
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11. 제6항에 있어서, 상기 유기성 폐기물은 당밀,사과,배,메론 및 수박의 유기성 폐기물로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 수소 생산 방법.
12. 삭제
13. 제11항에 있어서, 상기 유기성 폐기물은 16%(v/v)로 수소 생산 배지에 첨가되는 것을 특징으로 하는, 수소 생산 방법.
14. 제6항에 있어서, 상기 배양은 pH 6~8에서 이루어지는 것을 특징으로 하는, 수소 생산 방법.

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