CN106190924B - 一株高产4-甲基苯酚的酪丁酸梭菌 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株高产4‑甲基苯酚的酪丁酸梭菌，属于微生物技术领域。本发明的酪丁酸梭菌，已于2016年5月10日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.12431。本发明筛选得到的高产PC的酪丁酸梭菌CGMCC NO.12431，一方面能够更好地解析微生物产PC的代谢途径，为降低发酵食品(比如白酒)中的PC提供一定的理论依据，另一方面为生物清洁生产PC提供一定的可能。

Description

一株高产4-甲基苯酚的酪丁酸梭菌
技术领域
本发明涉及一株高产4-甲基苯酚的酪丁酸梭菌，属于微生物技术领域。
背景技术
4-甲基苯酚(p-cresol，PC)，是一种化工原料，主要用于作为制造抗氧剂2，6-二叔丁基对甲酚和橡胶防老剂的原料，也是生产医药TMP和染料可利西丁磺酸的重要基础原料，还可以用于制备下游产品4-甲基苯甲醚、乙酸对甲酚酯、苯乙酸对甲酚酯等。目前，PC的主要合成方法是采用化学合成法，然而，化学合成法存在安全性低、不够节能环保等问题。
在生物方面，PC主要是作为微生物代谢产物或其它代谢过程中的副产物被研究。早在上世纪七十年代，Sideny R.elsdend等人就已检测到PC是Clostridium difficile(难辨梭菌)和Clostridium scatologenes(粪味梭菌)的代谢产物。徐岩团队检测窖泥中的可挥发性组分后，应用现代分离及风味研究技术，确认产生窖泥臭的化合物是PC。虽然已经确定浓香型白酒中窖泥臭风味主要来源于PC。但浓香型白酒酿造微生物体系复杂，且窖泥厌氧微生物需要较为严苛的分离及培养条件。因此关于PC的微生物来源及代谢途径的研究还是一片空白。
目前，已发现两条微生物代谢产PC的途径。酪氨酸通过转氨作用生成对羟基苯乙酸，对羟基苯乙酸在对羟基苯乙酸脱羧酶(HPAD)的作用下脱羧形成PC，且PC可以抑制其它菌的生长。PC产生的另一条途径与H2的制备密切相关。
如果能筛选到一些高产PC的菌株，一方面能够更好地解析微生物产PC的代谢途径，为降低发酵食品(比如白酒)中的PC提供一定的理论依据，另一方面为生物清洁生产PC提供一定的可能。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的第一个目的是提供一株高产PC的酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)RQA1。
所述酪丁酸梭菌Clostridium tyrobutyricum RQA1，已于2016年5月10日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.12431。
所述Clostridium tyrobutyricum RQA1是从浓香型白酒窖泥中筛选得到的。
所述Clostridium tyrobutyricum RQA1具有如下特性：
(1)PC产量受硫酸亚铁的影响，添加硫酸亚铁后PC浓度可提高83％，PC产量达0.13mg/L；
(2)添加20mL·L-1乙醇能够使PC产量提高40％；
(3)仅产生较少的乙酸、己酸、辛酸等酸类物质，几乎不产脂类、醇类物质，风味物质产量很低、对风味贡献小；
(4)在混菌发酵制备窖泥并用于白酒生产的过程中，可被其他强化接种的同属菌株所竞争掉，而不会对白酒总体风味产生不良影响；
(5)专性厌氧，菌落为圆形，细胞为杆状(约1.5*4.5)，近端生芽孢，有鞭毛，最适温度37℃，最适生产pH 6；能利用或能产生葡萄糖、甘露糖、木糖，不能利用或者不能产生乳糖、鼠李糖、山梨糖、纤维二糖。
本发明的第二个目的是提供所述酪丁酸梭菌的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用，是用于发酵生产PC。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵生产具体是：将所述酪丁酸梭菌接种于含有硫酸亚铁或乙醇的培养基中，进行厌氧培养。
在本发明的一种实施方式中，所述硫酸亚铁的浓度为2g·L-1。
在本发明的一种实施方式中，所述乙醇的浓度为20mL·L-1。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基中还含有(g·L-1)：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏3，葡萄糖5，氯化钠5，醋酸钠3，硫酸镁0.2，硫酸铵0.5，磷酸氢二钾1，磷酸二氢钾0.5。
在本发明的一种实施方式中，所述应用，是用于发酵产酸。
在本发明的一种实施方式中，所述酸为丁酸。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵产酸的具体条件是：将菌株按照0.1％接种量接种于培养基中，在37℃的厌氧培养箱中培养3天。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵产酸用的培养基为RCM培养基。
本发明的第三个目的是提供一种发酵食品中异味物质PC的控制方法，所述方法是将不产或者低产PC的菌株接种到发酵食品的生产过程中，通过不产或者低产PC的菌株竞争性替代原发酵食品生产体系中的产PC的菌株，进而控制发酵食品中的异味物质PC。
所述产PC的菌株，是指保藏编号为CGMCC NO.12431的酪丁酸梭菌。
在本发明的一种实施方式中，所述食品为白酒，不产或者低产PC的菌株是接种到窖泥中。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是将不产或者低产PC的菌株接种到窖泥中，通过不产或者低产PC的菌株竞争性替代原窖泥体系中的产PC的菌株CGMCC NO.12431，进而控制白酒中的异味物质PC。
在本发明的一种实施方式中，所述不产或者低产PC的菌株为Lactobacillusacidipiscis JGn2，Clostridium sporogenes JGn4和/或Clostridium butyricum JGn6。
本发明的第四个目的是提供一种提高所述酪丁酸梭菌产PC的方法，是在发酵的培养基中添加硫酸亚铁或乙醇。
在本发明的一种实施方式中，所述硫酸亚铁的浓度为2g·L-1，所述乙醇的浓度为20mL·L-1。
本发明的有益效果：
(1)本发明筛选到高产PC的酪丁酸梭菌，一方面能够更好地解析微生物产PC的代谢途径，为降低发酵食品(比如白酒)中的PC提供一定的理论依据，另一方面为生物清洁生产PC提供一定的可能。
(2)本发明的Clostridium tyrobutyricum RQA1，PC产量达0.13mg/L；仅产生较少的乙酸、己酸、辛酸等酸类物质，几乎不产脂类、醇类物质，风味物质产量很低、对风味贡献小；在混菌发酵制备窖泥并用于白酒生产的过程中，可被其他强化接种的同属菌株所竞争掉，而不会对白酒总体风味产生不良影响。
生物材料保藏
Clostridium tyrobutyricum，分类学命名为酪丁酸梭菌Clostridiumtyrobutyricum RQA1，已于2016年5月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.12431，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
Lactobacillus acidipiscis JGn2，分类学命名为Lactobacillus acidipiscis，已于2016年5月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.12432，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
Clostridium sporogenes JGn4，分类学命名为生孢梭菌Clostridiumsporogenes，已于2016年5月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.12433，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
Clostridium butyricum JGn6，分类学命名为丁酸梭菌Clostridium butyricum，已于2016年5月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.12434，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
图1：Fe2+和乙醇浓度对单菌PC产量的影响。
具体实施方式
实施例1：窖泥中产PC菌株的筛选
(1)菌株分离：将5g新鲜窖泥悬于100mL 0.9％NaCl溶液，在固体培养基涂布后，放于厌氧培养箱37℃静置培养3天；划线得到单菌落后挑选单菌落于12mL液体培养基中，每块平板挑选3个平行，在37℃的厌氧培养箱中培养3天。
(2)菌株培养后发酵液风味的检测：发酵液经8000r·min-1离心10min后取上清液8mL，加3g氯化钠饱和后，经顶空微萃取-气相色谱-质谱联用(HS-SPME-GC-MS)技术测定其中的可挥发性风味。
GC-MS条件：
萃取条件：DVB/CAR/PBDS萃取头萃取45min，萃取温度为45℃。
GC条件：进样口温度250℃，载气He，流速2mL·min-1，不分流进样，色谱柱为CP-Wax(60m×0.25m mi.d.×0.25μm,J&W Scientific)。检测时的升温程序为：50℃恒温2min，以6℃·min-1的速度升温至230℃，保持15min。
MS条件：EI电离源，电子能量70eV，离子源温度230℃，扫描范围35.00～350amu。质谱分析用数据库来源于NIST05a.L(Agilent公司)。
(3)菌株16S rRNA鉴定：发酵液离心后得到细胞沉淀，提取基因组，测定保守区域16S rRNA序列鉴定种属，PCR用的引物序列为27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。
按照上述方法，得到了产PC含量较高的菌株C.tyrobutyricum JGn11和C.tyrobutyricum RQA1，以及不产菌株JGn2、JGn4和低产PC的JGn6(0.01mg·L-1)。
其中Clostridium tyrobutyricum RQA1，已于2016年5月10日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.12431。
Lactobacillus acidipiscis JGn2，保藏编号为CGMCC NO.12432；Clostridiumsporogenes JGn4保藏编号为CGMCC NO.12433；Clostridium butyricum JGn6保藏编号为CGMCC NO.12434。
实施例2：Clostridium tyrobutyricum RQA1产PC实验
选择从窖泥中筛选得到的Staphylococcus aureus JGn8、C.tyrobutyricumJGn11、C.tyrobutyricum RQA1三株菌研究Fe2+和乙醇浓度对PC产生的影响。
对照组是采用RCM培养基，实验组所用培养基是在RCM培养基中添加2g·L-1硫酸亚铁或20mL·L-1乙醇的培养基。在培养基中接入0.2mL活化的JGn8、JGn11或者本发明的Clostridium tyrobutyricum RQA1菌体后，于37℃厌氧培养箱中培养3天，检测发酵液中PC含量。
其中，RCM培养基即为强化梭菌培养基(g·L-1)：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏3，葡萄糖5，氯化钠5，醋酸钠3，硫酸镁0.2，硫酸铵0.5，磷酸氢二钾1，磷酸二氢钾0.5。
结果如图1所示，Staphylococcus aureus JGn8在对照组与实验组都不产生PC，C.tyrobutyricum JGn11与C.tyrobutyricum RQA1对照组与实验组均可产生PC。Staphylococcus aureus JGn8不产PC并非受Fe2+和乙醇浓度的限制。对照组中C.tyrobutyricum JGn11发酵液中PC含量略高于RQA1。添加一定浓度的Fe2+乙醇后，PC浓度有升高趋势。培养基中添加2g·L-1硫酸亚铁后，C.tyrobutyricum JGn11发酵液中PC浓度提高了50％，C.tyrobutyricum RQA1提高了83％(达到0.13mg/L)。培养基中添加20mL·L-1乙醇后，C.tyrobutyricum JGn11发酵液中PC浓度提高了83％，C.tyrobutyricum RQA1仅提高了40％。Fe2+和乙醇对C.tyrobutyricum JGn11和C.tyrobutyricum RQA1产PC能力的影响效果存在较大差异。
实施例3：Clostridium tyrobutyricum RQA1的生理生化特性
Clostridium tyrobutyricum RQA1的生理生化特性如表1所示。
表1 菌株的生理生化特性
注：a芽孢位置端生(T)或近端生(ST)；ND：不确定；+：表示微生物能利用该碳源或能产生该代谢物；-：表示微生物不能利用该碳源或能产生该代谢物。
实施例4：Clostridium tyrobutyricum RQA1产风味物质测定
将上述菌株按照0.1％接种量接种于RCM培养基中，在37℃的厌氧培养箱中培养3天。 菌株培养后发酵液风味的检测：发酵液经8000r·min-1离心10min后取上清液8mL，加3g氯化钠饱和后，经顶空微萃取-气相色谱-质谱联用(HS-SPME-GC-MS)技术测定其中的可挥发性风味。
结果如表2所示，Clostridium tyrobutyricum RQA1产的主要风味物质为酸类，除丁酸外，其他酸类物质如乙酸、己酸、辛酸的产量较低，而且产的醇类、脂类物质极低或不产。由此可见，该菌株风味物质产量低、对风味贡献小。
表2 风味物质含量(单位mg/L)
实施例5：控制白酒中的异味物质PC
将不产PC的CGMCC NO.12432、CGMCC NO.12433和低产PC的CGMCC NO.12434活化后，各按照0.1％的接种量与含有Clostridium tyrobutyricum RQA1的窖泥混菌悬浮液接种于己酸菌培养基中，培养窖泥1天，并每隔3天再次强化接种不产/低产PC菌液(即CGMCCNO.12432、CGMCC NO.12433、CGMCC NO.12434的混合菌液，各0.1％)接两次，得到强化后窖泥混菌微生物。随后，在新的己酸菌培养基中发酵培养强化后窖泥混菌微生物9天，得到强化后的样品。
发酵后样品分别进行GC-MS检测和MiSeq基因组16S rDNA测序，以观察强化后窖泥微生物风味代谢以及菌群结构变化情况。对照样品(改造前样品)，即为不添加本发明的CGMCC NO.12432、CGMCC NO.12433、CGMCC NO.12434的按照上述方法得到的样品。表3为改造前后PC含量以及微生物结构变化。
表3结果显示，CGMCC NO.12433、CGMCC NO.12434可通过接种强化的方式替代部分原有发酵体系中的Clostridium tyrobutyricum RQA1，强化后的窖泥具有窖泥微生物自稳态系统，然而PC含量却降低了73.3％，显著降低了窖泥臭。
表3 功能菌株强化前后PC含量以及微生物结构变化
对强化前后的窖泥的主要酸类进行检测，结果如表4所示。结果显示，强化后的窖泥的主要有机酸己酸提高到了4倍，丁酸含量提高到了3.42倍。
表4 改造前后窖泥主要有机酸浓度比较
将本方法得到的窖泥用于白酒酿造，并比较了窖泥改造前后的窖池产酒的主要风味物质，如表5所示，酯含量增加了50％左右，酸含量增加了44倍左右。
表5 改造前后窖池中产酒主要风味物质浓度比较
本发明的Clostridium tyrobutyricum RQA1，高产PC，而风味物质产量低、对发酵产品的风味贡献小，在发酵食品生产过程中可以被其他菌株所替代而不会导致食品的有益风味物质的丧失。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一株酪丁酸梭菌，其特征在于，所述酪丁酸梭菌已于2016年5月10日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.12431。
2.根据权利要求1所述的酪丁酸梭菌，其特征在于，所述酪丁酸梭菌具有如下特性：
(1)4-甲基苯酚(PC)产量受硫酸亚铁的影响，添加硫酸亚铁后PC浓度可提高83％，PC产量达0.13mg/L；
(2)添加20mL·L-1乙醇能够使PC产量提高40％；
(3)仅产生较少的酸类物质，风味物质产量很低、对风味贡献小；
(4)在混菌发酵制备窖泥并用于白酒生产的过程中，能够被其他强化接种的同属菌株所竞争掉，而不会对白酒总体风味产生不良影响；
(5)专性厌氧，菌落为圆形，细胞为杆状，近端生芽孢，有鞭毛，最适温度37℃，最适生产pH 6；能利用或能产生葡萄糖、甘露糖、木糖，不能利用或者不能产生乳糖、鼠李糖、山梨糖、纤维二糖。
3.权利要求1所述酪丁酸梭菌的应用。
4.一种生产PC的方法，其特征在于，所述方法是以权利要求1所述的酪丁酸梭菌为生产菌株发酵生产PC。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵生产具体是：将权利要求1所述的酪丁酸梭菌接种于含有硫酸亚铁或乙醇的培养基中，进行厌氧培养。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述硫酸亚铁的浓度为2g·L-1。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述乙醇的浓度为20mL·L-1。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述培养基中，按g·L-1计还含有：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏3，葡萄糖5，氯化钠5，醋酸钠3，硫酸镁0.2，硫酸铵0.5，磷酸氢二钾1，磷酸二氢钾0.5。
9.一种发酵食品中异味物质PC的控制方法，其特征在于，所述方法是将不产或者低产PC的菌株接种到发酵食品的生产过程中，通过不产或者低产PC的菌株竞争性替代原发酵食品生产体系中的产PC的菌株，进而控制发酵食品中的异味物质PC；所述产PC的菌株是指保藏编号为CGMCC NO.12431的酪丁酸梭菌；所述不产或者低产PC的菌株是指保藏编号为CGMCC NO.12432、CGMCC NO.12433和CGMCC NO.12434的菌株。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述发酵食品为白酒；所述方法是将不产或者低产PC的菌株接种到窖泥中，通过不产或者低产PC的菌株竞争性替代原窖泥体系中的产PC的菌株CGMCC NO.12431，进而控制白酒中的异味物质PC。
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The analysis of para-cresol production and tolerance in Clostridium difficile 027 and 012 strains;Lisa F Dawson et al;《BMC Microbiology》;20111231;第11卷(第86期);第1-10页 *

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CN106190924A (zh) 2016-12-07

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