CN103509832B - 一种以高浓度磷酸二氢钾为缓冲盐的发酵生产γ-氨基丁酸的方法 - Google Patents
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Abstract
一种以高浓度磷酸二氢钾为缓冲盐的发酵生产γ-氨基丁酸的方法，属于微生物发酵工程领域。本发明以一株产γ-氨基丁酸的乳酸乳球菌（ Lactococcus lactis SYFS1.009）为菌种，在含高浓度的磷酸二氢钾培养基中培养，其成份为：葡萄糖10~40g/L，酵母膏20~50g/L，磷酸二氢钾20~50g/L，谷氨酸钠5~20g/L，MgSO40~3g/L，MnSO4?H2O0~3g/L，吐温-80 0~5mL/L。在此培养基的基础上，流加氨水或氢氧化钠调控发酵液pH，并在发酵过程中添加一定量的葡萄糖和谷氨酸钠，培养40~60h即可得含高浓度γ-氨基丁酸的发酵液。本发明所用培养基及方法安全可靠、生产周期短，以磷酸二氢钾为缓冲盐及流加氨水或氢氧化钠调节发酵液pH，可有效缓解乳酸对乳酸乳球菌的抑制作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种以高浓度磷酸二氢钾为缓冲盐的发酵生产γ-氨基丁酸的方法，属于微生物发酵工程领域。
背景技术
γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，简称GABA）是一种天然存在的、非蛋白质组成氨基酸，主要存在于哺乳动物脑、脊髓中。GABA具有提高脑活力、降血压和胆固醇、安定精神、防止肥胖、改善肝肾机能等作用，因而它在功能性食品领域具有广泛的应用前景。
目前，GABA的生产方法主要有化学合成法和生物法两种。化学合成法虽然纯度较高，但成本较高，得率较低，并且在生产工艺中涉及到危险溶剂，很难在食品工厂中实现。生物合成法主要利用酶催化将GABA前提物转化合成，是一种既安全，成本又低的方法。生物方法又分为植物富集和微生物发酵两种，植物富集提取法是以植物为原料，经富集、提取、分离、提纯制得，虽然操作简便，但GABA含量较低，成本仍较高。而微生物发酵法生产条件温和，设备要求简单，安全性好，尤以乳酸菌生产安全性最佳，且产生的GABA不易被降解，因此微生物发酵生产GABA在功能性食品开发中具有巨大优势和潜力。
在乳酸菌发酵生产GABA领域，因乳酸菌消耗50%以上摄入的葡萄糖产生乳酸，当发酵液中乳酸量达到一定浓度时，乳酸就会对乳酸菌生长和GABA产物合成产生强烈的抑制作用。缓冲盐法是向乳酸菌的培养基中加入缓冲盐，以中和和控制发酵液中的酸度。选择一组或一种合适的缓冲盐，提高培养基的缓冲能力，控制其pH的变化幅度，对细胞的积累及产物的合成有较大调节作用。磷酸二氢钾作为一种常用的缓冲盐，在乳酸菌培养基中常有添加，但如本发明中磷酸二氢钾的添加量达到20~50
g/L，这种超高浓度的缓冲盐添加量且最终取得比初始条件下高出3倍以上的菌体量和GABA含量的情况，在乳酸乳球菌产GABA领域迄今为止未见有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法，通过简单易行、适于常规应用的操作，以高浓度磷酸二氢钾为缓冲盐，克服乳酸对乳酸乳球菌菌体量和GABA产量的抑制作用，提高γ-氨基丁酸的产量。
本发明的技术方案：一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法，以乳酸乳球菌（Lactococcus lactis ）SYFS1.009为出发菌株，以高浓度磷酸二氢钾为缓冲盐，使用专门的培养基，其主要成分及含量如下：葡萄糖10~40 g/L，酵母膏20~50 g/L，磷酸二氢钾20~50 g/L，谷氨酸钠5~20 g/L，MgSO4
0~3 g/L，MnSO4•H2O 0~3 g/L，吐温-80
0~5 mL/L，以纯水配制；取经常规活化后的菌种，以1%~5%的接种量接种于此培养基中，起始pH控制在6.5~7.5，25~35℃静置培养，发酵过程中待发酵液pH降至4.5~5.5时，流加氨水或氢氧化钠溶液维持pH在4.5~5.5，当底物量不足时添加所需底物，在发酵24~48
h后，添加谷氨酸钠使其在发酵液中浓度维持在5~15 g/L，添加葡萄糖使其在发酵液中浓度维持在5~20 g/L，总计培养40~60h，得高含γ-氨基丁酸的发酵液。
出发菌株乳酸乳球菌（Lactococcus lactis ）SYFS1.009已在下列文献中公开：江波，许时婴，许建军，一种食品功能因子γ-氨基丁酸的制备方法，发明专利，申请号02113140.6，公开号CN1392262A。 许建军， 江波， 许时婴，Lactococcus lactis 谷氨酸脱羧酶的分离纯化及部分酶学性质，无锡轻工学报，2004（3）。傅元欣，张涛，江波，沐万孟. 乳酸菌细胞转化法生产γ-氨基丁酸的研究 【J】.食品工业科技 2008. （9）166-168。
作为优选，所述的培养基中MgSO4为0.6
g/L。
作为优选，所述的培养基中MnSO4•H2O为0.1 g/L。
作为优选，所述的培养基中吐温-80为0.5 ml/L。
作为优选，所述的接种量为1%。
作为优选，所述的最佳初始pH为6.8-7.0
作为优选，所述的培养温度为30℃。
作为优选，所述的培养过程中pH最优控制为维持pH 5.0。
本发明的有益效果：由于采用了上述方案，所述的培养基安全可靠、缓冲能力强，相比于化学合成法不添加任何有毒物质。发酵过程中操作简单，很大程度减弱了乳酸对乳酸乳球菌生长和GABA生产的影响，通过增加乳酸乳球菌单位菌体量，使GABA产量得到较大的提高。
具体实施方式
1、培养基配制方法：
① 分别称取各组分，用蒸馏水溶解，其中葡萄糖单独溶解；
② 葡萄糖115 ℃单独灭菌20分钟，其他组分装入发酵罐121 ℃灭菌20分钟；
③ 接种前通过无菌操作将葡萄糖加入发酵罐中，搅拌混匀，将初始pH调至6.8-7.0，即得。
2、发酵培养基主要成分的确定
2.1 葡萄糖浓度的确定
将不同葡萄糖浓度的发酵培养基（酵母膏40 g/L，磷酸二氢钾40 g/L，谷氨酸钠10 g/L ，MgSO4 0.6 g/L，MnSO4•H2O 0.1 g/L，吐温-80
0.5 ml/L）起始pH控制在6.8~7.0，然后按1%的接种量接入常规方法活化两代后的种子液，在装液量为100 mL的250 mL的三角瓶中30℃静置培养14 h后测定OD值，培养36 h后测定GABA含量。表1表明此培养基中最适的葡萄糖浓度为30
g/L。
表1.葡萄糖浓度对乳酸乳球菌菌体浓度和GABA产量的影响
2.2 酵母膏浓度的确定
将不同酵母膏浓度的发酵培养基（葡萄糖 30 g/L，磷酸二氢钾40 g/L，谷氨酸钠10 g/L ，MgSO4 0.6 g/L，MnSO4•H2O 0.1 g/L，吐温-80
0.5 mL/L）起始pH控制在6.8~7.0，然后按1%的接种量接入常规方法活化两代后的种子液，在装液量为100 mL的250 mL的三角瓶中30℃静置培养14 h后测定OD值，培养36 h后测定GABA含量。表2结果表明乳酸乳球菌在此培养基中最适的酵母膏浓度为40 g/L。
表2.酵母膏浓度对乳酸乳球菌菌体浓度和GABA产量的影响
2.3 磷酸二氢钾浓度的研究
将不同磷酸二氢钾浓度的发酵培养基（葡萄糖 30 g/L，酵母膏 40 g/L，谷氨酸钠10g/L ，MgSO4 0.6 g/L，MnSO4•H2O 0.1g/L，吐温-80
0.5 mL/L）起始pH控制在6.8~7.0，然后按1%的接种量接入常规方法活化两代后的种子液，在装液量为100 mL的250 mL的三角瓶中30℃静置培养14 h后测定OD值，培养36 h后测定GABA含量。表3结果表明当磷酸二氢钾浓度为40 g/L时，OD值和GABA含量都达到最高。
表3.磷酸二氢钾浓度对乳酸乳球菌菌体浓度和GABA产量的影响
2.4 谷氨酸钠浓度的确定
将不同谷氨酸钠浓度的发酵培养基（葡萄糖 30 g/L，酵母膏40 g/L，磷酸二氢钾40 g/L，MgSO4 0.6 g/L，MnSO4•H2O 0.1g/L，吐温-80
0.5 mL/L）起始pH控制在6.8~7.0，然后按1%的接种量接入常规方法活化两代后的种子液，在装液量为100 mL的250 mL的三角瓶中30℃静置培养14 h后测定OD值，培养36 h后测定GABA含量。表4结果表明乳酸乳球菌在此培养基中最适的谷氨酸钠浓度为10g/L。
表4.谷氨酸钠浓度对乳酸乳球菌菌体浓度和GABA产量的影响
| 谷氨酸钠浓度（g/L） | 5 | 10 | 15 | 20 |
| 菌体OD值 | 5.445 | 5.5 | 5.40 | 4.96 |
| GABA含量（g/L） | 2.37 | 2.91 | 2.42 | 1.75 |
实施例1：取常规方法活化两代后的乳酸乳球菌，以1%的接种量接种于特定培养基（葡萄糖30 g/L，酵母膏40
g/L，磷酸二氢钾20 g/L，谷氨酸钠10
g/L ，MgSO4 0.6 g/L，MnSO4•H2O
0.1 g/L，吐温-80 0.5 mL/L，起始pH控制在6.8~7.0）的发酵罐中。培养温度为30 ℃，转速为50 r/min，不通气培养，待发酵液pH自然降至5.0时，流加氨水或氢氧化钠溶液维持pH为5.0±0.5，24~48 h时向发酵液中添加谷氨酸钠浓缩液使维持5~15 g/L，整个发酵过程中添加葡萄糖使其发酵液浓度维持在5~20
g/L左右，培养40~60 h即得高含γ-氨基丁酸的乳酸菌发酵液。培养48h后，发酵液中γ-氨基丁酸含量为4.18g/L。
实施例2：取常规方法活化两代后的乳酸乳球菌，以1%的接种量接种于特定培养基（葡萄糖30 g/L，酵母膏40
g/L，磷酸二氢钾30 g/L，谷氨酸钠10
g/L， MgSO4 0.6 g/L，MnSO4•H2O
0.1 g/L，吐温-80 0.5 mL/L，起始pH控制在6.8~7.0）的发酵罐中。培养温度为30 ℃，转速为50 r/min，不通气培养，待发酵液pH自然降至5.0时，流加氨水或氢氧化钠溶液维持pH为5.0±0.5，24~48 h时向发酵液中添加谷氨酸钠浓缩液使维持5~15 g/L，整个发酵过程中添加葡萄糖使其发酵液浓度维持在5~20
g/L左右，培养40~60 h即得高含γ-氨基丁酸的乳酸菌发酵液。培养48h后，发酵液中γ-氨基丁酸含量为5.12g/L。
实施例3：取常规方法活化两代后的乳酸乳球菌，以1%的接种量接种于特定培养基（葡萄糖30 g/L，酵母膏40
g/L，磷酸二氢钾40 g/L，谷氨酸钠10
g/L， MgSO4 0.6 g/L，MnSO4•H2O
0.1 g/L，吐温-80 0.5 mL/L，起始pH控制在6.8~7.0）的发酵罐中。培养温度为30 ℃，转速为50 r/min，不通气培养，待发酵液pH自然降至5.0时，流加氨水或氢氧化钠溶液维持pH为5.0±0.5，24~48 h时向发酵液中添加谷氨酸钠浓缩液使维持5~15 g/L，整个发酵过程中添加葡萄糖使其发酵液浓度维持在5~20
g/L左右，培养40~60 h即得高含γ-氨基丁酸的乳酸菌发酵液。培养48h后，发酵液中γ-氨基丁酸含量为6.15g/L。
实施例4：取常规方法活化两代后的乳酸乳球菌，以1%的接种量接种于特定培养基（葡萄糖30 g/L，酵母膏40
g/L，磷酸二氢钾50 g/L，谷氨酸钠10
g/L，MgSO4 0.6 g/L，MnSO4•H2O
0.1 g/L，吐温-80 0.5 mL/L，起始pH控制在6.8~7.0）的发酵罐中。培养温度为30 ℃，转速为50 r/min，不通气培养，待发酵液pH自然降至5.0时，流加氨水或氢氧化钠溶液维持pH为5.0±0.5，24~48 h时向发酵液中添加谷氨酸钠浓缩液使维持5~15 g/L，整个发酵过程中添加葡萄糖使其发酵液浓度维持在5~20
g/L左右，培养40~60 h即得高含γ-氨基丁酸的乳酸菌发酵液。培养48h后，发酵液中γ-氨基丁酸含量为5.43g/L。
Claims (1)
1.一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于以乳酸乳球菌（Lactococcus lactis ）SYFS1.009为出发菌株，以高浓度磷酸二氢钾为缓冲盐，使用专门的培养基：葡萄糖10~40
g/L，酵母膏20~50 g/L，磷酸二氢钾20~50 g/L，谷氨酸钠5~20 g/L，MgSO4 0.6 g/L，MnSO4•H2O 0.1 g/L，吐温-80
0.5 mL/L，以纯水配制；取经常规活化后的菌种，以1%~5%的接种量接种于此培养基中，起始pH控制在6.5~7.5，25~35℃静置培养，发酵过程中待发酵液pH降至4.5~5.5时，流加氨水或氢氧化钠溶液维持pH在4.5~5.5，在发酵24~48 h后，添加谷氨酸钠使其在发酵液中浓度维持在5~15 g/L，添加葡萄糖使其在发酵液中浓度维持在5~20 g/L，总计培养40~60h，得高含γ-氨基丁酸的发酵液。
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