CN108300742A - 一种流加底物酶制备γ-氨基丁酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种流加底物酶制备γ‑氨基丁酸的方法，将底物谷氨酸钠加入缓冲溶液中配置谷氨酸钠溶液，经过滤后向菌浆中流加谷氨酸钠溶液，减少了底物的波动，有利于酶促反应的平稳进行；采用溶解了底物的缓冲溶液不断稀释反应体系，使得单位体积的酶含量平稳变化，酶活性持续稳定；本发明的流加底物酶制备γ‑氨基丁酸的方法，采用的缓冲体系缓冲效果好，产率高。

Description

一种流加底物酶制备γ-氨基丁酸的方法
技术领域
本发明属于生物催化领域，具体涉及一种流加底物酶制备γ-氨基丁酸的方法。
背景技术
γ-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid，GABA)，又称氨酪酸，作为神经的主要抑制性传达物质，是自然界中广泛分布的一种氨基酸。如存在于番茄、蜜柑、葡萄、马铃薯、茄子、南瓜等蔬果中，许多经过发酵或发芽的食品和谷类也含有GABA，如泡菜、淹渍物、发芽米等。其具有舒压、改善睡眠、健脑、降血压、美容、减肥等生理功效。
GABA的生产方法有化学合成法、酶法、发酵法等。占据主要产量的化学合成法生产GABA因不符合食品法规，所以该法在未来很有可能被其他方法替代。目前发酵法技术成熟、产品安全性高，其产品认可度越来越高。素有“食品加工工厂”之称的乳酸菌作为高度安全的食用生产菌种越来越得到世界的安全认可，但乳酸菌产谷氨酸脱羧酶(GAD)为胞内酶，这对酶催化反应的要求很高。
发明专利(申请号CN201610285082.8)公布了一种转化法生产γ-氨基丁酸，其方法主要为菌体培养后离心收集，离心后菌体悬浮于醋酸缓冲液中，加入底物L-Glu，于30-40℃下进行转化反应；发明专利(申请号CN201510724879.9)公布了一种连续生产γ-氨基丁酸的方法，其方法主要为大肠杆菌经富集后，放出发酵液用陶瓷膜进行过滤洗涤，得到的菌体进入磷酸二氢钾和磷酸氢二钾反应体系，并分批加入谷氨酸，维持谷氨酸浓度，调节pH、温度、通气比，搅拌下反应。
可见，现有技术的方法多是在含有菌体的缓冲体系中添加底物，存在催化反应平稳性不高、酶活稳定性差、易发生底物抑制、易导致污染等缺点，不利于大规模化工业化生产。
因此，有必要提供一种酶活性稳定、易于大规模生产的γ-氨基丁酸的制备方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种流加底物酶制备γ-氨基丁酸的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明公开了一种流加底物酶制备γ-氨基丁酸的方法，包括如下步骤：
S1.将微生物富集培养结束后得到菌浆；
S2.配制浓度为0.01-0.5mol/L，pH为4.0-7.0的缓冲溶液；
S3.采用所述缓冲溶液溶解底物谷氨酸钠，配制质量分数为1-6％的谷氨酸钠溶液；然后采用膜过滤器对所述谷氨酸钠溶液进行过滤除杂除菌；
S4.不断搅拌下向所述菌浆中连续流加除杂后的谷氨酸钠溶液进行酶促反应得到菌液，控制反应体系中谷氨酸钠浓度为10-45g/L，并采用盐酸调节反应体系的pH值为4.0-7.0；
S5.对所述菌液进行过滤，除去菌体细胞，得到富含γ-氨基丁酸的酶解清液；
S6.将酶解清液经过除杂、纯化以及干燥处理，制得γ-氨基丁酸产品。
优选地，所述步骤S2中缓冲溶液为磷酸氢二钠-柠檬酸。
优选地，所述步骤S3中除杂前谷氨酸钠溶液的质量分数为4-6％。
优选地，所述步骤S3中膜过滤器为PTFE微孔膜过滤器。
优选地，所述步骤S4中酶促反应的温度为28～50℃，搅拌速度为100-200rpm，培养时间为24-40h。
优选地，所述步骤S4中pH值为4.5-5.5。
优选地，所述步骤S5中采用陶瓷膜过滤除去菌体细胞。
具体地，所述γ-氨基丁酸产品为粉剂或晶体。
本发明的有益效果是：
(1)本发明的流加底物酶制备γ-氨基丁酸的方法，将底物溶解于缓冲溶液之后进行过滤处理，减少了杂质对底物的污染；
(2)本发明的流加底物酶制备γ-氨基丁酸的方法，将底物溶解于缓冲溶液之后流加入菌浆中进行酶促反应，减少了底物的波动，有利于酶促反应的平稳进行；
(3)本发明的流加底物酶制备γ-氨基丁酸的方法，采用溶解了底物的缓冲溶液不断稀释反应体系，使得单位体积的酶含量平稳变化，酶活性持续稳定；
(4)本发明的流加底物酶制备γ-氨基丁酸的方法，实现了对底物浓度的有效控制，保持了底物浓度的稳定性，有效控制了底物抑制作用；
(5)本发明的流加底物酶制备γ-氨基丁酸的方法，采用的缓冲体系缓冲效果好，产率高，并且对酶活性的影响小；
(6)本发明的流加底物酶制备γ-氨基丁酸的方法，可重复性好，适用于大规模工业化生产。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明公开了一种流加底物酶制备γ-氨基丁酸(GABA)的方法，分别采用0.05mol/L、pH＝4.5的柠檬酸-柠檬酸钠、醋酸-醋酸钠以及磷酸氢二钠-柠檬酸三种缓冲溶液溶解底物谷氨酸钠，配制质量分数为4％的谷氨酸钠溶液；然后采用膜过滤器对所述谷氨酸钠溶液进行过滤除杂除菌；将微生物富集培养，结束后通过膜过滤得到菌浆；将菌浆等分为3份，分别转移至三个酶催化反应罐中进行搅拌，控制反应温度为35℃，pH为4.5，调节搅拌转速为100rpm，分别向三个反应罐内连续流加除杂后的三种谷氨酸钠溶液，控制残留谷氨酸钠溶液浓度在10-45g/L之间，各反应36h后，经膜过滤除去菌体，得到酶解清液，再通过高效液相色谱法(HPLC)检测三个反应罐中制备的GABA的含量。将酶解清液经过除杂、纯化、结晶以及干燥处理，制得γ-氨基丁酸晶体，晶体产品中谷氨酸钠残留量对晶体纯度具有显著的影响，重复实验数据如下表：
实施例2
本发明公开了一种流加底物酶制备γ-氨基丁酸(GABA)的方法，采用0.05mol/L、pH＝4.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液溶解底物谷氨酸钠，分别配制质量分数为2％、4％和6％的谷氨酸钠溶液；然后采用膜过滤器对所述谷氨酸钠溶液进行过滤除杂除菌；将微生物富集培养，结束后通过膜过滤得到菌浆；将菌浆等分为3份，分别转移至三个酶催化反应罐中进行搅拌，控制反应温度为35℃，pH为4.5，调节搅拌转速为100rpm，分别向三个反应罐内连续流加除杂后的三种不同质量分数的谷氨酸钠溶液，控制残留谷氨酸钠溶液浓度在10-45g/L之间，各反应36h后，经膜过滤除去菌体，得到酶解清液，再通过高效液相色谱法(HPLC)检测三个反应罐中制备的GABA的含量。重复实验数据如下表：
谷氨酸钠溶液的质量分数(％) 2 4 6
第一次实验-GABA(g/L) 149 163 157
重复实验-GABA(g/L) 139 156 149
实施例3
本发明公开了一种流加底物酶制备γ-氨基丁酸(GABA)的方法，采用0.05mol/L、pH＝4.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液溶解底物谷氨酸钠，配制质量分数为4％的谷氨酸钠溶液；然后采用膜过滤器对所述谷氨酸钠溶液进行过滤除杂除菌；将微生物富集培养，结束后通过膜过滤得到菌浆；将菌浆等分为4份，分别转移至四个酶催化反应罐中进行搅拌，控制反应温度为35℃，控制pH分别为3.5、4.5、5.5、6.5，调节搅拌转速为100rpm，分别向四个反应罐内连续流加除杂后的4％谷氨酸钠溶液，控制残留谷氨酸钠溶液浓度在10-45g/L之间，各反应36h后，经膜过滤除去菌体，得到酶解清液，再通过高效液相色谱法(HPLC)检测四个反应罐中制备的GABA的含量。重复实验数据如下表：
PH值 3.5 4.5 5.5 6.5
第一次实验-GABA(g/L) 129 157 153 146
重复实验-GABA(g/L) 122 156 158 149
实施例4
本发明公开了一种流加底物酶制备γ-氨基丁酸(GABA)的方法，采用0.05mol/L、pH＝4.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液溶解底物谷氨酸钠，配制质量分数为4％的谷氨酸钠溶液；然后采用膜过滤器对所述谷氨酸钠溶液进行过滤除杂除菌；将微生物富集培养，结束后通过膜过滤得到菌浆；转移至酶催化反应罐中进行搅拌，控制反应温度为35℃，pH为4.5，调节搅拌转速为100rpm，向反应罐内连续流加除杂后的4％谷氨酸钠溶液，控制谷氨酸钠残留浓度在10-45g/L之间，反应36h后，经膜过滤除去菌体，得到酶解清液；
对照试验方法为：在酶催化反应罐中配置一定量0.05mol/L、pH＝4.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，将膜过滤得到的一定量菌浆加入其中进行搅拌，控制反应温度为35℃，pH为4.5，调节搅拌转速为100rpm，分批加入谷氨酸钠底物，控制残留谷氨酸钠浓度在10-45g/L之间，反应36h后，经膜过滤除去菌体，得到酶解清液；再通过高效液相色谱法(HPLC)检测GABA的含量。将酶解清液经过除杂、纯化、结晶以及干燥处理，制得γ-氨基丁酸晶体，通过纯度分析，其差异显著。重复实验数据如下表：
本发明的有益效果是：
(1)本发明的流加底物酶制备γ-氨基丁酸的方法，将底物溶解于缓冲溶液之后进行过滤处理，减少了杂质对底物的污染；
(2)本发明的流加底物酶制备γ-氨基丁酸的方法，将底物溶解于缓冲溶液之后流加入菌浆中进行酶促反应，减少了底物的波动，有利于酶促反应的平稳进行；
(3)本发明的流加底物酶制备γ-氨基丁酸的方法，采用溶解了底物的缓冲溶液不断稀释反应体系，使得单位体积的酶含量平稳变化，酶活性持续稳定；
(4)本发明的流加底物酶制备γ-氨基丁酸的方法，实现了对底物浓度的有效控制，保持了底物浓度的稳定性，有效控制了底物抑制作用；
(5)本发明的流加底物酶制备γ-氨基丁酸的方法，采用的缓冲体系缓冲效果好，产率高，并且对酶活性的影响小；
(6)本发明的流加底物酶制备γ-氨基丁酸的方法，可重复性好，适用于大规模工业化生产。
以上所述是本发明的优选实施方式，应该指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种流加底物酶制备γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.将微生物富集培养结束后得到菌浆；
S2.配制浓度为0.01-0.5mol/L，pH为4.0-7.0的缓冲溶液；
S3.采用所述缓冲溶液溶解底物谷氨酸钠，配制质量分数为1-6％的谷氨酸钠溶液；然后采用膜过滤器对所述谷氨酸钠溶液进行过滤除杂除菌；
S4.不断搅拌下向所述菌浆中连续流加除杂后的谷氨酸钠溶液进行酶促反应得到菌液，控制反应体系中谷氨酸钠浓度为10-45g/L，并采用盐酸调节反应体系的pH值为4.0-7.0；
S5.对所述菌液进行过滤，除去菌体细胞，得到富含γ-氨基丁酸的酶解清液；
S6.将酶解清液经过除杂、纯化、结晶以及干燥处理，制得γ-氨基丁酸产品。
2.根据权利要求1所述的一种流加底物酶制备γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述步骤S2中缓冲溶液为磷酸氢二钠-柠檬酸。
3.根据权利要求1所述的一种流加底物酶制备γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述步骤S3中除杂前谷氨酸钠溶液的质量分数为4-6％。
4.根据权利要求1所述的一种流加底物酶制备γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述步骤S3中膜过滤器为PTFE微孔膜过滤器。
5.根据权利要求1所述的一种流加底物酶制备γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述步骤S4中酶促反应的温度为28～50℃，搅拌速度为100-200rpm，培养时间为24-40h。
6.根据权利要求1、3或5所述的一种流加底物酶制备γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述步骤S4中pH值为4.5-5.5。
7.根据权利要求1所述的一种流加底物酶制备γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述步骤S5中采用陶瓷膜过滤除去菌体细胞。
8.根据权利要求1所述的一种流加底物酶制备γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述步骤S6中γ-氨基丁酸产品为粉剂或晶体。
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