CN1683544A - 一种生物合成γ-氨基丁酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物合成γ-氨基丁酸的方法,其特征在于,保藏编号为:CGMCC NO.1306的短乳杆菌(Lactobacillus brevis),经琼脂斜面培养基活化后,转接于GYP种子培养基或MRS种子培养基,培养10~30小时后,以0.5%~5%的接种量接种于GYP或MRS发酵培养基中,在25℃~35℃下静置培养48h~120h,即得含菌体的发酵液,菌体离心分离收集;离心后的菌体再以灭过菌的去离子水洗涤,取0.25~2g湿菌体,悬浮于15~50mL的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲体系中,L-谷氨酸钠含量为5mM~60mM,反应1~10小时,反应液离心即得含γ-氨基丁酸的溶液。本发明生产成本低、反应条件温和、环境污染小、方法简单、易于操作,生产效率高,并且产品纯度较高,减轻了后续分离纯化工艺。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物合成γ-氨基丁酸的方法。
背景技术
γ-氨基丁酸(简称GABA)是一种具有重要生理活性的非蛋白质氨基酸,是中枢神经系统重要的神经递质。大量文献报道,GABA具有降血压和胆固醇、降低神经元活性,防止神经细胞过热,不仅具有安神和抗除抑郁作用,而且还能增强脑功能和长期记忆、增加生长激素分泌、防止肥胖、健肝利肾、改善更年期综合症等功能。随着对GABA生理活性的不断深入研究,最新研究发现的γ-氨基丁酸的生理功能越来越多。GABA也越来越多地受到了更多的关注,GABA在生物体内虽然广泛存在,但无论动、植物中,含量却都很低,分离很困难,需要对其进行合成制备。对于它的合成制备方法主要有化学合成法和生物合成方法。与化学合成方法相比,生物法合成GABA是利用生物体内的谷氨酸脱羧酶作为催化剂,以L-谷氨酸钠(L-MSG)为底物,将L-谷氨酸钠(L-MSG)α-脱羧,产生γ-氨基丁酸和CO2,主要优点在于合成条件温和,不需要昂贵的原材料,环境污染小,能耗小。采用生物法合成GABA的关键之一就是筛选出具有高谷氨酸脱羧酶活力的优良菌株。有文献报道,GABA的生物合成通常采用大肠杆菌作为生产菌株,但是用大肠杆菌作为生产菌株存在食品安全卫生方面的隐患,本实验室筛选到一株具有高效生物合成GABA能力的乳酸菌株。本文报道了一种生物合成GABA的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种生物合成γ-氨基丁酸的方法。
保藏编号为:CGMCC NO.1306的短乳杆菌(Lactobacillus brevis),经琼脂斜面培养基活化后,转接于GYP种子培养基或MRS种子培养基,培养10~30小时后,以0.5%~5%的接种量接种于GYP或MRS发酵培养基中,在25℃~35℃下静置培养48h~120h,即得含菌体的发酵液,菌体离心分离收集;离心后的菌体再以灭过菌的去离子水洗涤,取0.25~2g湿菌体,悬浮于15~50mL的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲体系中,L-谷氨酸钠含量为5mM~60mM,反应1~10小时,反应液离心即得含γ-氨基丁酸的溶液。
保藏编号为:CGMCC NO.1306的短乳杆菌(Lactobacillus brevis),在发酵时产乳酸,显微镜观察成对或成链状出现,不运动,无孢子,菌落小,表面光滑;属于革兰氏阳性菌株,兼性厌氧。
本发明采用短乳杆菌作为菌种,菌体生长达到稳定期,收集菌体,采用全细胞催化,以L-谷氨酸钠(L-MSG)为底物,以柠檬酸—磷酸氢二钠为缓冲体系,无其它碳氮源等其它培养基成分,利用乳酸菌体内含有高活性谷氨酸脱羧酶,将L-谷氨酸钠(L-MSG)α-脱羧,产生γ-氨基丁酸,GABA产量达到1~6g/L。本方法的优点在于生产成本低、反应条件温和、环境污染小、方法简单、易于操作,周期短、生产效率高,并且产品纯度较高,减轻了后续分离纯化工艺。
具体实施方式
A.菌株
本实验室筛选。
B.培养基
1000mL琼脂斜面保藏培养基:葡萄糖10g,酵母膏10g,蛋白胨5g,乙酸钠2g,MgSO4·7H2O 20mg,MnSO4·4H2O 1mg,NaCl 1mg,FeSO4·7H2O 1mg,琼脂15g,pH6.8。
1000mL GYP种子培养基:葡萄糖10g,酵母膏10g,蛋白胨5g,乙酸钠2g,MgSO4·7H2O 20mg,MnSO4·4H2O 1mg,NaCl 1mg,FeSO4·7H2O 1mg,pH6.6-7.0。
1000mL GYP发酵培养基:葡萄糖10g,酵母膏10g,蛋白胨5g,乙酸钠2g,MgSO4·7H2O 20mg,MnSO4·4H2O 1mg,NaCl 1mg,FeSO4·7H2O 1mg,一水合L-谷氨酸钠10g,pH6.6-7.0。
1000mL MRS种子培养基:牛肉膏10g,酵母膏5g,蛋白胨10g,K2HPO42g,柠檬酸铵2g,葡萄糖20g,吐温-80 1mL,醋酸钠5g,无机盐溶液5mL(MgSO4·7H2O,11.5%;MnSO4·2H2O,2.4%),pH6.6。
1000mL MRS发酵培养基:牛肉膏10g,酵母膏5g,蛋白胨10g,K2HPO42g,柠檬酸铵2g,葡萄糖20g,吐温-80 1mL,醋酸钠5g,无机盐溶液5mL(MgSO4·7H2O,11.5%;MnSO4·2H2O,2.4%),一水合L-谷氨酸钠10g,pH6.6。
C.制备工艺
此菌株经琼脂斜面培养基活化后,转接于GYP种子培养基或MRS种子培养基,培养10~30小时后,以0.5%~5%的接种量接种GYP或MRS发酵培养基,在30℃下静置培养48h~120h,即得含菌体的发酵液,菌体通过离心(8000r/min,5min)收集。离心后的菌体再以灭过菌的去离子水洗涤,取0.25~2g湿菌体,悬浮于25mL的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲体系中,L-谷氨酸钠含量为5mM-100mM,反应1~10小时,反应液离心即得含γ-氨基丁酸的溶液。
该菌株经琼脂斜面培养基活化后,转接于GYP种子培养基或MRS种子培养基,培养10~30小时后,以0.5%~5%的接种量接种GYP或MRS发酵培养基,在30℃下静置培养48h~120h,即得含菌体的发酵液,菌体通过离心(8000r/min,5min)收集。离心后的菌体再以灭过菌的去离子水洗涤,取0.25~2g湿菌体,悬浮于25mL的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲体系中,L-谷氨酸钠含量为5mM-100mM,反应1~10小时,反应液离心即得含γ-氨基丁酸的溶液。
实施例1
此菌株经琼脂斜面培养基活化后,转接于GYP种子培养基,培养时间为24小时,将种子培养液以1%的接种量接种于GYP发酵培养基中,发酵培养基内加1%的一水合L-谷氨酸钠,发酵培养基的装液量为200mL/500mL,静置培养60小时,即得含菌体的发酵液,菌体通过离心(8000r/min,5min)收集。离心后的菌体再以灭过菌的去离子水洗涤,取0.5g湿菌体,悬浮于25mL的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲体系中,L-谷氨酸钠含量为10mM,反应1小时,反应液离心经高效液相色谱分析得,γ-氨基丁酸含量约1g/L。
实施例2
此菌株经琼脂斜面培养基活化后,转接于GYP种子培养基,培养时间为24小时,将种子培养液以1%的接种量接种于GYP发酵培养基中,发酵培养基内加1%的一水合L-谷氨酸钠,发酵培养基的装液量为200mL/500mL,静置培养60小时,即得含菌体的发酵液,菌体通过离心(8000r/min,5min)收集。离心后的菌体再以灭过菌的去离子水洗涤,取0.5g湿菌体,悬浮于25mL的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲体系中,L-谷氨酸钠含量为20mM,反应2小时,反应液离心经高效液相色谱分析得,γ-氨基丁酸含量约2g/L。
实施例3
此菌株经琼脂斜面培养基活化后,转接于GYP种子培养基,培养时间为24小时,将种子培养液以1%的接种量接种于GYP发酵培养基中,发酵培养基内加1%的一水合L-谷氨酸钠,发酵培养基的装液量为200mL/500mL,静置培养60小时,即得含菌体的发酵液,菌体通过离心(8000r/min,5min)收集。离心后的菌体再以灭过菌的去离子水洗涤,取0.5g湿菌体,悬浮于25mL的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲体系中,L-谷氨酸钠含量为40mM,反应3小时,反应液离心经高效液相色谱分析得,γ-氨基丁酸含量约4g/L。
实施例4
此菌株经琼脂斜面培养基活化后,转接于GYP种子培养基,培养时间为24小时,将种子培养液以1%的接种量接种于GYP发酵培养基中,发酵培养基内加1%的一水合L-谷氨酸钠,发酵培养基的装液量为200mL/500mL,静置培养60小时,即得含菌体的发酵液,菌体通过离心(8000r/min,5min)收集。离心后的菌体再以灭过菌的去离子水洗涤,取0.5g湿菌体,悬浮于25mL的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲体系中,L-谷氨酸钠含量为60mM,反应5小时,反应液离心经高效液相色谱分析得,γ-氨基丁酸含量约6g/L。
Claims (2)
1.一种生物合成γ-氨基丁酸的方法,其特征在于,保藏编号为:CGMCCNO.1306的短乳杆菌(Lactobacillus brevis),经琼脂斜面培养基活化后,转接于GYP种子培养基或MRS种子培养基,培养10~30小时后,以0.5%~5%的接种量接种于GYP或MRS发酵培养基中,在25℃~35℃下静置培养48h~120h,即得含菌体的发酵液,菌体离心分离收集;离心后的菌体再以灭过菌的去离子水洗涤,取0.25~2g湿菌体,悬浮于15~50mL的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲体系中,L-谷氨酸钠含量为5mM~60mM,反应1~10小时,反应液离心即得含γ-氨基丁酸的溶液。
2.根据权利要求1所述的一种生物合成γ-氨基丁酸的方法,其特征在于,所述保藏编号为:CGMCC NO.1306的短乳杆菌(Lactobacillus brevis),在发酵时产乳酸,显微镜观察成对或成链状出现,不运动,无孢子,菌落小,表面光滑;属于革兰氏阳性菌株,兼性厌氧。
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