CN105316257B - 一种解木糖赖氨酸芽孢杆菌及其制备α-酮酸的方法 - Google Patents
一种解木糖赖氨酸芽孢杆菌及其制备α-酮酸的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种解木糖赖氨酸芽孢杆菌及其制备α‑酮酸的方法。本发明公开的菌株为解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XX‑2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No:M2015520。以解木聚糖类赖氨酸芽孢杆菌XX2全细胞为生物催化剂，利用其中的L‑氨基酸氧化酶在空气存在下将L‑氨基酸氧化脱氨为相应的α‑酮酸、氨气及过氧化氢，并利用细胞中共表达的过氧化氢酶原位分解产生的过氧化氢。本发明的方法克服了化学合成法和发酵法制备α‑酮酸的不足，具有反应条件温、环境友好、成本低廉、产物谱宽广等优点，适合α‑酮酸的工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种解木糖赖氨酸芽孢杆菌及应用该菌株转化L-氨基酸制备α-酮酸的方法。
背景技术
生物体内，α-酮酸既是糖代谢的中间体，也参与必需氨基酸的生物合成。α-酮酸是一类双官能团化合物，是有机合成、药物合成及生物合成的关键中间体，广泛用于生物医药、食品、化妆品、饲料等领域。如由4种α-酮酸钙盐(α-酮异己酸钙、α-酮异戊酸钙、α-酮-β-甲基戊酸钙、苯丙酮酸钙)、1种羟基酸钙盐(消旋羟蛋氨酸钙)、5种L-氨基酸(L-赖氨酸醋酸盐、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-组氨酸、L-酪氨酸)组成的复方α-酮酸片(开同)用于预防和治疗因慢性肾功能不全而造成蛋白质代谢失调引起的损害。丙酮酸钙作为膳食补充剂，具有加速脂肪消耗、减轻体重、增强人体耐力等功效，对心脏也有特殊的保护作用。L-精氨酸-α-酮戊二酸盐(AKG)作为功能性护肝药物和营养强化剂，能维持肝脏的正常功能，促进肌肉的快速增长和恢复。α-酮异己酸(KIC)是支链氨基酸的中间代谢产物，能够抑制胰高血糖素分泌并促进胰岛素分泌，具有促进肌肉蛋白合成、防止肌肉分解的双重作用。α-丁酮酸、α-酮异戊酸等是食品风味物质。在功能性护肤化妆品中，α-酮酸能起到很好的保湿、防皱、防缩、抗老化和抗过敏作用。
α-酮酸的制备方法主要有化学合成法和生物技术法。化学合成法主要包括双羰基化法及海因法。双羰基化法以卤代烃和一氧化碳为原料，八羰基二钴和零价钯的络合物为催化剂，在氢氧化钙存在下，一步合成α-酮酸。该法操作简便，产物易分离，产品收率和纯度高，缺点是使用昂贵的催化剂，不适合规模化生产。海因法以醛、酮和海因为原料得到亚烃基海因，然后水解为α-酮酸，缺点是海因价格昂贵。化学法合成α-酮酸普遍存在原料复杂、成本高、环境污染大，杂质多等缺点，很难被生物医药、食品、化妆品等工业所接受。
生物技术法包括发酵法和生物转化法。发酵法以糖质原料如葡萄糖或其它碳源为发酵前体，利用中心代谢途径加强α-酮酸合成途径的通量，阻断其他分支代谢以及α-酮酸向氨基酸代谢的酶途径，保证α-酮酸的大量累积。发酵法制备丙酮酸已经实现工业化。利用谷氨酸棒杆菌发酵制备α-酮戊二酸，目前达到的最高产量为47.2g/L，发酵时间32h(CN102391977A)。同样，利用谷氨酸棒杆菌发 酵制备α-酮异戊酸，产量达到25.7g/L(Krause F S,Blombach BM,Eikmanns B.App Environ Microbiol,2010,76(24)：8053-8061.)。发酵法制备α-酮酸具有条件温和、工艺简单、环境友好等特点，但也存在生产周期长，产量低，杂酸多，提取和精制工艺复杂等缺点。
生物转化法以L-氨基酸脱氨酶或L-氨基酸氧化酶为生物催化剂，发酵生产的廉价的天然L-氨基酸为原料制备α-酮酸。L-氨基酸脱氨酶法主要集中于α-酮戊二酸的制备。刘龙等(Liu L,Hossain GS,Shin HD et al.J Biotechnol,2013,164:97-104.)利用奇异变形杆菌(Proteus vulgaris)L-氨基酸脱氨酶催化L-谷氨酸脱氨生成α-酮戊二酸，产量为12.6g/L。陈坚等(CN 103911400A)通过易错PCR或定点饱和突变改造奇异变形杆菌L-氨基酸脱氨酶基因并表达在枯草芽孢杆菌中，以重组菌全细胞转化L-谷氨酸制备α-酮戊二酸，转化率为85.2％。敲除sucA后的表达L-氨基酸脱氨酶重组枯草芽孢杆菌转化L-谷氨酸钠，其α-酮戊二酸的产量可达12.2g/L，而以未敲除sucA的重组枯草芽孢杆菌为生物催化剂，其α-酮戊二酸的产量为8.6g/L(CN 103937842A)。中国专利申请(CN 103789247A)公开了异源表达L-氨基酸脱氨酶的重组菌细胞转化L-亮氨酸制备α-酮异己酸的方法，L-亮氨酸转化率为97.5％，α-酮异己酸产量为12.7g/L。尽管L-氨基酸脱氨酶能够特异地催化L-氨基酸脱氨，无过氧化氢生成，避免了过氧化氢催化α-酮酸进一步脱羧，但高浓度L-氨基酸和产物α-酮酸对L-氨基酸脱氨酶有显著的抑制作用，α-酮酸的生产强度不高，很难实现工业化。
L-氨基酸氧化酶立体特异地催化L-氨基酸氧化脱氨形成α-酮酸并伴随过氧化氢产生。L-氨基酸氧化酶/过氧化氢酶组合体系能够有效实现过氧化氢的原位清除，累积高浓度α-酮酸。夏仕文等(ZL 201210045591.5)以粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis CGMCC1.1799)的通透细胞转化L-丙氨酸制备丙酮酸，产量为64.0g/L，收率91％。刘立明等(CN102994467A)以链霉菌(Streptomyces ghanaensis FMME067)发酵产生的胞外L-谷氨酸氧化酶转化L-谷氨酸钠制备α-酮戊二酸，α-酮戊二酸产量为14.5g/L。以不透明红球菌(Rhodococcus opacus DSM43250)野生细胞转化L-谷氨酸钠，采用分批补料策略制备α-酮戊二酸，转化率90％，α-酮戊二酸产量达到16.8g/L(CN 103352058A)。重组产生的不透明红球菌DSM43250 L-氨基酸氧化酶转化10g/L L-谷氨酸钠为5.3g/Lα-酮戊二酸，转化率53％(CN103555642A)。范文超等(CN 104131041A)构建了谷氨酸消旋酶基因工程菌和D-氨基酸氧化酶基因工程菌。利用两个基因工程菌的混合菌转化100g/L L-谷氨酸钠，转化率为达到85.5％，α-酮戊二酸产量为85.2g/L。陶荣盛 等(CN 104109698 A)利用固定化重组L-谷氨酸氧化酶/过氧化氢酶体系转化L-谷氨酸钠，转化率为90.7％，α-酮戊二酸产量为110g/L。
L-氨基酸氧化酶法目前只局限于制备少数几个α-酮酸丙酮酸、α-酮戊二酸等，而且需要采用来源于不同菌株的L-氨基酸氧化酶。获得底物特异性宽广的适用于多个α-酮酸制备的产L-氨基酸氧化酶菌株，对于L-氨基酸氧化酶法生产α-酮酸具有重要价值。
发明内容
本发明的目的是公开一株解木聚糖赖氨酸芽孢杆菌，分类并命名为解木聚糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XX-2。该菌于2015年9月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心地址为：中国湖北省武汉市武汉大学，保藏号为CCTCC No:M2015520。本发明同时提供利用该菌的全细胞转化L-氨基酸制备α-酮酸的方法。
本发明的解木糖赖氨酸芽孢杆菌在制备α-酮酸中的应用。其中解木糖赖氨酸芽孢杆菌制备α-酮酸的方法为：在产酶培养基中培养解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2细胞，离心收集菌体，磷酸盐缓冲液洗涤菌体，得到湿菌体；将湿菌体悬浮在磷酸盐缓冲液中制备菌悬液；再向菌悬液中加入底物L-氨基酸，经生物转化后获得产物α-酮酸。
本发明的解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2是通过以下程序从土壤中筛选获得的。
(1)富集：从不同地区采集的20个土样经自然风干并碾碎，分别取5g碎土样加入到含50ml无菌水的锥形瓶中，30℃下摇床振荡(200转/分)20min，静置，取1ml上清液梯度稀释，然后将50μl稀释液涂布于装载固体培养基的培养皿上，30℃下培养3天。用于富集的固体培养基为：蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、氯化钠5g/L、琼脂15g/L，pH7.2。
(2)筛选：分别挑取步骤(1)中固体培养基上生长出的单菌落，接种到含5ml无菌液体培养基中，30℃下摇床振荡(200转/分)培养24h。取1ml菌液，采用2,4-二硝基苯肼检测丙酮酸。阳性菌株接种至步骤(1)中的固体培养基上，30℃下培养1天，然后接种至5ml无菌液体培养基中，30℃下摇床振荡(200转/分)培养48h获得预培养液。预培养液接种至50ml液体培养基中，30℃下摇床振荡(200转/分)培养48h，离心、生理盐水洗涤2次，重新悬浮在生理盐水中，以L-丙氨酸为底物，采用2,4-二硝基苯肼法检测L-氨基酸氧化酶活性，对活性最高的菌株进一步鉴定。用于筛选的液体培养基为：蛋白胨10g/L、牛肉膏 3g/L、磷酸二氢钾2g/L、磷酸氢二钠1g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钠5g/L、L-丙氨酸10g/L，pH7.2。通过筛选、鉴定得到本发明的解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2。
采用上述解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2全细胞转化L-氨基酸制备α-酮酸的具体方法如下：
1.菌株培养：
斜面培养基为：3g/L牛肉膏、5g/L酵母膏、5g/L氯化钠、15g/L琼脂，pH6.0。
种子培养基为：3g/L牛肉膏、5g/L酵母膏、5g/L氯化钠，pH6.0。
产酶培养基为：3g/L牛肉膏、5g/L酵母膏、5g/L氯化钠，3g/L L-丙氨酸，pH6.0。
斜面培养：将筛选得到的木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2接种于斜面培养基上，30℃培养48小时；
种子培养：将斜面培养的菌株，无菌条件下用接种环接种于5ml发酵培养基中，30℃下摇床振荡(180转/分)培养48小时，制得种子液；
摇瓶培养：以10％接种量将种子液接入新鲜的产酶培养基中，30℃下摇床振荡(180rpm)培养48小时。
2.菌体收集：步骤(1)中摇瓶培养的菌液在4℃、8000转/分条件下离心5分钟，收集菌体，用磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH8.0)洗涤2次，得到湿菌体。
3.生物氧化实验：步骤(2)中的湿菌体重新悬浮于磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH8.0)中制成细胞浓度为20～50g/L(干重)的菌悬液，加入终浓度为26～160g/L的L-氨基酸，在30℃下，摇床振荡(180转/分)反应24～48小时。反应液离心，分别采用柱前手性衍生-HPLC和2,4-二硝基苯肼法测定L-氨基酸转化率和α-酮酸产率。
柱前手性衍生-HPLC条件为：反应上清液中加入4g/L三乙胺乙腈溶液和2g/L 2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖异硫氰酸酯(GITC)乙腈溶液，30℃下水浴加热20min。离心，采用HPLC测定上清液中的L-氨基酸浓度，根据校正曲线计算转化率。色谱柱：C18柱；流动相：0.1％三氟乙酸水溶液/甲醇(51:49，v/v)，pH 2.5；流速：1.0ml/min；检测波长：254nm；柱温：25℃。
2,4-二硝基苯肼法：反应上清液与1.5mol/L氢氧化钠溶液、2,4-二硝基苯肼溶液按体积比1:1:5混匀，37℃下水浴加热20min，冷却至室温，测定540nm下吸光度。根据α-酮酸校正曲线计算产率。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：1)木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2是 L-氨基酸氧化酶的一个新酶源；2)诱导产生的木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2L-氨基酸氧化酶具有宽广的底物特异性以及底物和产物耐受性，适合从发酵生产的天然L-氨基酸制备多个具有重要应用价值的α-酮酸；3)L-氨基酸氧化酶具有高活性，底物完全转化，副产物少，产物易分离，适合α-酮酸的工业化生产。
具体实施方式
以下所述实施例仅为本发明构思下的基本说明，根据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均属于本发明保护的范围。
实施例1：菌株筛选
(1)从不同地区采集的20个土样经自然风干并碾碎，分别取5g碎土样加入到含50ml无菌水的锥形瓶中，30℃下摇床振荡(200rpm)20min，静置，取1ml上清液梯度稀释，然后将50μl稀释液涂布于装载固体培养基的培养皿上，30℃下培养3天。用于富集的固体培养基为：蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、氯化钠5g/L、琼脂15g/L，pH7.2。
(2)分别挑取步骤(1)中固体培养基上生长出的单菌落，接种到含5ml无菌液体培养基中，30℃下摇床振荡(200rpm)培养24h。取1ml菌液，采用2,4-二硝基苯肼法检测丙酮酸。阳性菌株接种至步骤(1)中的固体培养基上，30℃下培养24h，然后接种至5ml无菌液体培养基中，30℃下摇床振荡(200rpm)培养48h获得预培养液。预培养液接种至50ml液体培养基中，30℃下摇床振荡(200rpm)培养48h，离心、生理盐水洗涤2次，重新悬浮在生理盐水中，以L-丙氨酸为底物，采用2,4-二硝基苯肼检测L-氨基酸氧化酶活性，获得一株对L-丙氨酸具有最高氧化脱氨活性的菌株。用于筛选的液体培养基为：蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、磷酸二氢钾2g/L、磷酸氢二钠1g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钠5g/L、L-丙氨酸10g/L，pH7.2。
实施例2：菌株鉴定
采用16s rDNA对具有最高L-丙氨酸氧化脱氨活性的菌株进行鉴定。该菌株与解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)同源性达100％，将其命名为解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XX-2，16s rDNA序列见附录。
实施例3：菌株培养和菌体收获
斜面培养基为：3g/L牛肉膏、5g/L酵母膏、5g/L氯化钠、15g/L琼脂，pH6.0。
种子培养基为：3g/L牛肉膏、5g/L酵母膏、5g/L氯化钠，pH6.0。
产酶培养基为：3g/L牛肉膏、5g/L酵母膏、5g/L氯化钠，3g/L L-丙氨酸， pH6.0。
斜面培养：将筛选得到的木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2接种于斜面培养基上，30℃下恒温培养48小时；
种子培养：将斜面培养的菌株，无菌条件下用接种环接种于5ml发酵培养基中，30℃下摇床振荡(180rpm)培养48小时，制得种子液；
摇瓶培养：以10％接种量将种子液接入新鲜的发酵培养基中，30℃下摇床振荡(180rpm)培养48小时。
菌体收获：步骤(1)中摇瓶培养的菌液在4℃、8000转/分条件下离心5分钟，收集菌体，用磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH8.0)洗涤2次，得到湿菌体。
实施例4：丙酮酸制备
将实施例3中获得的湿菌体悬浮在1L磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH8.0)中，菌体浓度为50g细胞/L(干重)，再向其中加入160g(1.8mol)L-丙氨酸，30℃下摇床振荡(180转/分)反应48h，利用柱前衍生化-HPLC跟踪反应，直至L-丙氨酸反应完全，然后离心10min(7000转/分)去除细胞。保留上清液，上清液中的丙酮酸浓度采用2,4-二硝基苯肼法测定。反应液中丙酮酸浓度为140g/L，产率71％。
实施例5：α-酮异己酸制备
将实施例3中获得的湿菌体悬浮在1L磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH8.0)中，菌体浓度为20g细胞/L(干重)，再向其中加入26g(0.2mol)L-亮氨酸，30℃下摇床振荡(180转/分)反应24h，利用柱前衍生化-HPLC跟踪反应，直至L-亮氨酸反应完全，然后离心10min(7000转/分)去除细胞，上清液中的α-酮异己酸浓度采用2,4-二硝基苯肼法测定。反应液中α-酮异己酸浓度为24g/L，产率92％。
实施例6：α-酮异戊酸制备
将实施例3中获得的湿菌体悬浮在1L磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH8.0)中，菌体浓度为40g细胞/L(干重)，再向其中加入58g(0.5mol)L-缬氨酸，30℃下摇床振荡(180转/分)反应48h，利用柱前衍生化-HPLC跟踪反应，直至L-缬氨酸反应完全，然后离心10min(7000转/分)去除细胞，上清液中的α-酮异戊酸浓度采用2,4-二硝基苯肼法测定。反应液中α-酮异戊酸浓度为52g/L，产率90％。
实施例7：α-酮-β-甲基戊酸制备
将实施例3中获得的湿菌体悬浮在1L磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH8.0) 中，菌体浓度为30g细胞/L(干重)，再向其中加入34g(0.29mol)L-异亮氨酸，30℃下摇床振荡(180转/分)反应48h，利用柱前衍生化-HPLC法跟踪反应，直至L-异亮氨酸反应完全，然后离心10min(7000转/分)去细胞保留上清液，采用2,4-二硝基苯肼法检测上清液中的α-酮-β-甲基戊酸浓度。反应液中α-酮-β-甲基戊酸浓度为29g/L，产率86％。
实施例8：α-酮戊二酸制备
将实施例3中获得的湿菌体悬浮在1L磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH8.0)中，菌体浓度为50g细胞/L(干重)，再向其中加入100g(0.59mol)L-谷氨酸钠，30℃下摇床振荡(180转/分)反应48h，利用柱前衍生化-HPLC跟踪反应，直至L-谷氨酸钠反应完全，然后离心10min(7000转/分)去除细胞，上清液中的α-酮异戊酸浓度采用2,4-二硝基苯肼法测定。反应液中α-酮异戊酸浓度为69g/L，收率80％。
实施例9：苯丙酮酸制备
将实施例3中获得的湿菌体悬浮在1L磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH8.0)中，菌体浓度为30g细胞/L(干重)，再向其中加入28g(0.17mol)L-苯丙氨酸，30℃下摇床振荡(180转/分)反应48h，利用柱前衍生化-HPLC跟踪反应，直至L-苯丙氨酸反应完全，然后离心10min(7000转/分)去除，上清液中的苯丙酮酸浓度采用2,4-二硝基苯肼法测定。反应液中苯丙酮酸浓度为25g/L，产率90％。
实施例10：α-丁酮酸制备
将实施例3中获得的湿菌体悬浮在1L磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH8.0)中，菌体浓度为50g细胞/L(干重)，再向其中加入60g(0.50mol)L-苏氨酸，30℃下摇床振荡(180转/分)反应48h，利用柱前衍生化-HPLC跟踪反应，直至L-苏氨酸反应完全，然后离心10min(7000转/分)去除，上清液中的α-酮丁酸浓度采用2,4-二硝基苯肼法测定。反应液中α-丁酮酸浓度为34g/L，产率67％。
附录：解木聚糖类赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus XX-2)16srDNA序列表
Claims (5)
1.一种解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XX-2，其特征在于：所述解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No:M2015520。
2.权利要求1所述的解木糖赖氨酸芽孢杆菌在制备α-酮酸中的应用，其特征在于，将L-氨基酸或其盐氧化生成α-酮酸，所述L-氨基酸为L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸的任一种，所述L-氨基酸盐为L-谷氨酸钠；所述α-酮酸为丙酮酸、α-酮异己酸、α-酮异戊酸、α-酮-β-甲基戊酸、α-酮戊二酸、苯丙酮酸、α-丁酮酸的任一种。
3.利用权利要求1所述的解木糖赖氨酸芽孢杆菌制备α-酮酸的方法，其特征在于：在产酶培养基中培养解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2细胞，离心收集菌体，磷酸盐缓冲液洗涤菌体，得到湿菌体；将湿菌体悬浮在磷酸盐缓冲液中制备菌悬液；再向菌悬液中加入底物L-氨基酸或其盐，经生物转化后获得产物α-酮酸；其中所述L-氨基酸为L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸的任一种，所述L-氨基酸盐为L-谷氨酸钠；所述α-酮酸为丙酮酸、α-酮异己酸、α-酮异戊酸、α-酮-β-甲基戊酸、α-酮戊二酸、苯丙酮酸、α-丁酮酸的任一种。
4.根据权利要求3所述的解木糖赖氨酸芽孢杆菌制备α-酮酸的方法，其特征在于：所述产酶培养基组成为：牛肉膏3g/L，酵母膏5g/L，氯化钠5g/L，L-丙氨酸3g/L，pH6；产酶培养条件为：温度30℃，转速180转/分，时间48小时。
5.根据权利要求3所述的解木糖赖氨酸芽孢杆菌制备α-酮酸的方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液为磷酸钠缓冲液，浓度为100mmol/L，pH8.0；转化体系中L-氨基酸浓度为26～160g/L，菌体浓度为20～50g/L，所述菌体为干重，温度为30℃，转速为180转/分，转化时间为24～48小时。
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