CN102586343A - 一种从l-丙氨酸制备丙酮酸的生物催化方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种从L-丙氨酸制备丙酮酸的生物催化方法。粪产碱杆菌Alcaligensfaecalis1.1799细胞经通透性处理后，利用细胞中的L-氨基酸氧化酶在空气存在下催化L-丙氨酸氧化脱氨形成丙酮酸、氨和过氧化氢，同时利用细胞中的过氧化氢酶催化反应中形成的过氧化氢，实现丙酮酸的累积，无副产物产生。本发明方法具有成本低廉、产品收率和纯度高、环境友好的优点，适合丙酮酸的工业化生产。

Description

一种从L-丙氨酸制备丙酮酸的生物催化方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及微生物催化制备酮酸的新工艺。具体地说，本发明涉及利用粪产碱杆菌细胞催化L-丙氨酸氧化脱氨制备丙酮酸的生物催化方法。

背景技术

丙酮酸是最重要的α-氧代羧酸之一，不仅在生物能量代谢中具有十分重要的作用，而且也是一种重要的医药化工产品，在制药工业、日用化工、农用化学品等工业及科学研究领域有广泛的用途。鉴于丙酮酸巨大的市场需求，其生产技术的研究已成为化工和生物技术的一大热点。

丙酮酸的制备方法主要有化学合成法和生物技术法。

化学合成法主要包括酒石酸法和乳酸氧化法。酒石酸法以酒石酸为原料，通过与硫酸氢钾共熔脱水脱羧高温反应得到丙酮酸。该法虽然操作简单，但底物转化率低，生产成本高，污染严重。乳酸氧化法以乳酸乙酯为原料，修饰的银或铜为催化剂，反应温度300～600℃，通过液相或气相空气氧化转化为丙酮酸酯，形成的丙酮酸酯经精馏、水解得到丙酮酸。乳酸氧化法存在的缺点是需要采用高温反应。

生物技术法具有生产条件温和、成本低廉、产品纯度高、环境污染小的特点，是丙酮酸生产技术的发展方向。生物技术法包括发酵法和酶转化法。发酵法以糖质原料如葡萄糖或其它碳源直接发酵生成丙酮酸，如公开号CN101096691，CN101691545，CN1690188。发酵法生产丙酮酸的缺点是：丙酮酸作为糖酵解途径的最终产物，处于代谢途径中的关键代谢支点，在细胞中容易代谢为其它产物，很难累积；发酵液中丙酮酸的浓度较低，而且存在聚丙酮酸，α-酮戊二酸等有机杂酸，丙酮酸的分离提取困难。酶转化法主要有三个途径：乳酸脱氢酶法、乳酸氧化酶法和丙酮酸脱羧酶法。乳酸脱氢酶法以乳酸脱氢酶为生物催化剂，在辅酶NAD⁺存在下，催化乳酸形成丙酮酸，该法的缺点是反应具有可逆性，乳酸很难转化完全，加入的外源性辅酶NAD⁺价格非常昂贵，工业化可能性小。乳酸氧化酶法采用乳酸氧化酶为生物催化剂催化DL-乳酸转化为丙酮酸，不需要外源性辅酶，成本大大降低，具有工业应用价值，如公开号CN102199632，CN101182484。日本先进工业科学与技术国家研究院（AIST）成功开发丙酮酸的丙酮酸脱羧酶法制备工艺。该工艺采用丙酮酸脱羧酶/焦磷酸硫胺素酶反应系统，以乙醛为底物，在碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液中制备丙酮酸，产率81%。与发酵法相比，虽然酶转化法具有底物转化率高，分离纯化简单的优点，但丙酮酸的酶转化法工业生产仍有许多技术问题需要解决。

L-氨基酸氧化酶（L-amino acid oxidase）在分子氧存在下，催化L-氨基酸氧化脱氨产生相应的酮酸、氨和过氧化氢。微生物L-氨基酸氧化酶用于酮酸以及D-氨基酸的产生具有很好的前景。Degussa（公开号US6461841）公开了一个L-氨基酸氧化酶产生菌株Rhodococcus opacus DSM42350工程菌构建方法以及该工程菌用于制备D-氨基酸的方法，丹麦Novodisk（公开号CN1124979）公开了一个有关Trichoderma Harzianum L-氨基酸氧化酶用作洗涤剂添加酶的专利。产L-氨基酸氧化酶微生物已用于从DL-丙氨酸制备D-丙氨酸，如公开号CN1884565，CN101649344。在这些方法中，L-丙酮酸完全降解，不能累积。目前为止，尚无有关L-氨基酸氧化酶用于制备丙酮酸的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种从L-丙氨酸制备丙酮酸的生物催化方法，使得到的丙酮酸纯度高，反应不污染环境。

为实现上述目的，本发明以产L-氨基酸氧化酶的粪产碱杆菌整细胞为生物催化剂，催化L-丙氨酸氧化脱氨。反应中产生的过氧化氢利用细胞中的过氧化氢酶催化分解为水和氧，实现丙酮酸的高效制备。

技术路线如下：

一种从L-丙氨酸制备丙酮酸的生物催化方法，包括以下步骤：

a）细胞培养：粪产碱杆菌在培养基中，以L-丙氨酸为诱导剂，30℃培养24h，离心，获得湿菌体。

b）细胞通透性处理：每1g湿菌体用1mL 30%丙酮水溶液处理5～20min，离心，用冷生理盐水洗涤2次，获得通透性细胞。

c）催化反应：每1L蒸馏水中悬浮20～100g步骤b）中的通透性细胞，加入0.2～1.0mol L-丙氨酸，30℃下反应6～12h，获得丙酮酸。

同时采用HPLC监测反应过程并测定反应液中丙酮含量；其中HPLC条件为：

色谱柱：C18；流动相：10mmol/L乙酸钠与甲醇按体积比80:20混合的溶液，pH3.5；检测波长：214nm；温度：25℃。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：1）以发酵产生的L-丙氨酸为原料，成本低廉；2）组合微生物中共表达的L-氨基酸氧化酶和过氧化氢酶催化L-丙氨酸氧化脱氨，无副产物乙酸产生，丙酮酸分离工艺简单，化学纯度高；3）不需要高温高压和有机溶剂，整个工艺环境友好。

具体实施方式

    以下是以粪产碱杆菌Alcaligens faecali 1.1799细胞为生物催化剂，催化L-丙氨酸氧化脱氨制备丙酮酸的的实施例，但本发明并不限于所列出的几个实例。

实施例1：细胞培养

（1）斜面培养：将粪产碱杆菌Alcaligens faecali 1.1799菌株接种于灭菌的固体培养基上，30℃下静止培养48h。固体培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化钠5 g/L，琼脂15 g/L，pH值7.4～7.6。

（2）一级培养：将斜面培养的细胞接种于含5ml灭菌培养基的试管中，30℃下摇床振荡培养24h。培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化钠5 g/L，pH值7.0。

（3）扩大培养：将一级培养的细胞以10%接种量接种于含诱导剂（L-丙氨酸）的50mL灭菌扩大培养基中，30℃下摇床振荡培养24h。培养基：蛋白胨10 g/L,牛肉膏3 g/L，氯化钠5 g/L，L-丙氨酸10 g/L，pH值7.0。培养液离心15min（8000rpm）收集湿菌体。

实施例2：细胞通透性处理

  50g湿菌体中加入50mL 30%丙酮水溶液，室温下处理5～20min，离心15min（8000rpm），用生理盐水洗涤2次，得通透性细胞48g。

实施例3：丙酮酸制备

20g经通透性处理的湿细胞悬浮于1L蒸馏水中，加入17.8g（0.2mol） L-丙氨酸，30℃下反应6h，用HPLC监测反应直至L-丙氨酸完全转化。反应完成后，离心15min（8000rpm），去除细胞。用HPLC测定上清液中丙酮酸浓度。反应液中丙酮酸浓度为16.7g/L，收率95%。

HPLC条件为：

色谱柱：C18；

流动相：10mmol/L乙酸钠与甲醇按体积比80:20混合的溶液，pH3.5；

检测波长：214nm；

温度：25℃。

实施例4：丙酮酸制备

80g经通透性处理的湿细胞悬浮于1L蒸馏水中，加入71.2g（0.8mol）L-丙氨酸，30℃下反应12h，用HPLC监测反应直至L-丙氨酸完全转化。反应完成后，离心15min（8000rpm），去除细胞。用HPLC测定上清液中丙酮酸浓度。反应液中丙酮酸浓度为64.0g/L，收率91%。

HPLC条件为：

色谱柱：C18；

流动相：10mmol/L乙酸钠与甲醇按体积比80:20混合的溶液，pH3.5；

检测波长：214nm；

温度：25℃。

Claims (2)

1.一种从L-丙氨酸制备丙酮酸的生物催化方法，包括以下步骤：

a）细胞培养：粪产碱杆菌在培养基中，以L-丙氨酸为诱导剂，30℃培养24h，离心，获得湿菌体；

b）细胞通透性处理：每1g湿菌体用1mL 30%丙酮水溶液处理5～20min，离心，用冷生理盐水洗涤2次，获得通透性细胞；

c）催化反应：每1L蒸馏水中悬浮20~100g步骤b）中的通透性细胞，加入0.2~1.0mol L-丙氨酸，30℃下反应6～12h，获得丙酮酸。

2.根据权利要求1所述一种从L-丙氨酸制备丙酮酸的生物催化方法，其特征是：步骤c）采用HPLC监测反应过程并测定反应液中丙酮含量；其中HPLC条件为：

色谱柱：C18；

流动相：10mmol/L乙酸钠与甲醇按体积比80:20混合的溶液，pH3.5；

检测波长：214nm；

温度：25℃。