CN109022380A - 一种提高l-氨基酸脱氨酶异源表达酶活的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程领域，涉及一种提高L‑氨基酸脱氨酶异源表达酶活的方法，采用L‑氨基酸脱氨酶（L‑amino acid deaminase，LAAD）基因与过氧化氢酶（Catalase）基因串联表达。本发明采用L‑氨基酸脱氨酶串联过氧化氢酶进行表达，提高了单位菌体的酶活，也提高了单位发酵体积菌体的量，从而具有很高的工业化运用价值。

Description

一种提高L-氨基酸脱氨酶异源表达酶活的方法
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种提高L-氨基酸脱氨酶异源表达酶活的方法。
背景技术
L-氨基酸脱氨酶（LAAD, L-Amino Acid Deaminase），也可以称作L-氨基酸氧化酶(LAAO，L-Amino Acid Oxidase, EC 1.4.3.2)，是一类黄素蛋白（flavoenzyme）对天然和非天然的L-氨基酸具有广谱的α位脱氨活性。LAAD在氧的参与下氧化L-氨基酸脱α-氨基，生成酮酸和氨，并产生副产物双氧水。L-氨基酸脱氨酶可用于氧化L-氨基酸的氨基制备对应的α-酮酸或用于氧化消旋氨基酸中的L-氨基酸来制备D-氨基酸。无论是α-酮酸或D-氨基酸都是重要的医药中间体。
过氧化氢酶（Catalase），主要来源于微生物及动物肝脏（如牛肝），并被工业化开发运用于分解双氧水（H2O2），消除双氧水对其所在环境中其它物质的氧化破坏。
L-氨基酸脱氨酶来源多种微生物，如Proteus、ProÍidencia、Morganella属，另外蛇毒中L-氨基酸脱氨酶也被商业化运用，只是太昂贵而不能广泛使用。微生物来源的L-氨基酸脱氨酶较容易进行基因操作，并可通过发酵获得酶。采用大肠杆菌表达有活性的L-氨基酸脱氨酶时，L-氨基酸脱氨酶在细胞内会对细胞内的氨基酸进行脱氨反应并产生双氧水，而双氧水对细胞产生毒害，造成细胞过早自溶，从而使得单位菌体的酶活表达量小，同时单位发酵体积的菌体量少，严重影响了工业化运用。
发明内容
本发明提供一种提高L-氨基酸脱氨酶异源表达酶活的方法，L-氨基酸脱氨酶串联表达过氧化氢酶，提高了单位菌体的酶活，也提高了单位发酵体积菌体的量，从而具有很高的工业化运用价值。
本发明采用如下的技术方案：一种提高L-氨基酸脱氨酶异源表达酶活的方法，采用L-氨基酸脱氨酶（L-amino acid deaminase，LAAD）基因与过氧化氢酶（Catalase）基因串联表达。
作为优选，采用奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)的L-氨基酸脱氨酶（L-aminoacid deaminase，LAAD）基因（genbank登录号EU669819.1）LAAD与嗜冷杆菌（Psychrobacterpiscatorii T-3）的过氧化氢酶（Catalase）基因（genbank登录号EU543218）PKTA串联表达。
作为优选，在PKTA基因片段上游加上DNA片段，所述DNA片段序列为：aagctttctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacc。
具体操作步骤如下：
1.重组菌构建
全基因合成来源于奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)的L-氨基酸脱氨酶（L-aminoacid deaminase，LAAD）基因（genbank登录号EU669819.1）LAAD，并连入pET28a载体（NdeⅠ/Hind），构建质粒laad，转化至E.Coli BL21（DE3），构建重组菌PMLAAD；
全基因合成来源于嗜冷杆菌（Psychrobacterpiscatorii T-3）的过氧化氢酶（Catalase）基因（genbank登录号EU543218）PKTA，并连入pET28a载体（NcoⅠ/Xhol），构建质粒pkta，转化至E.Coli BL21（DE3），构建重组菌PKTA；
质粒pkta，通过PCR扩增，在pkta基因片段上游加上DNA片段（aagctttctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacc），回收正确的目的片段（含PKTA和DNA片段的目的片段）后HindⅢ/XhoⅠ双酶切，并纯化回收正确的酶切后的目的片段；质粒laad采用HindⅢ/XhoⅠ双酶切，并纯化回收正确的线性质粒；酶切片段（酶切后的目的片段和酶切后的laad线性片段）连接，构建串联表达质粒pmlaadpkta，转化至E.Coli BL21（DE3），构建重组菌PMLAADPKTA。
2. 重组菌表达
重组菌PMLAAD和PMLAADPKTA采用TB进行发酵。
1）培养基
LB：
琼脂LB-Kan平板(g/L)：
注：培养基灭菌冷却至50-60℃，100ml LB加100μl Kan溶液（100mg/ml），混匀，倒平板（25-30ml/6cm平皿）。
TB(g/L)：
2）发酵流程
(1)菌种活化：从甘油管或牛奶管接菌至LB琼脂平板(Kan,100mg/L)，37℃培养12-14h。
(2)一级种子：从平板上挑取单菌至4ml LB试管，加Kan至终浓度为100mg/L，37℃，220rpm培养过夜（16h）。
(3)二级种子：取新鲜菌液按2%接种量接种于LB（100ml/500ml）摇瓶，加Kan至终浓度为100mg/L， 37℃，220rpm培养3.0-3.5h，OD600为1.0左右。
(4)1L/5L的TB发酵：二级种子2%-10%的接种量接入TB培养基（1L/5L发酵摇瓶），加Kan至25mg/L，37℃，220rpm，培养3h，开始降温25℃；加IPTG至终浓度（0.1mM），220rpm，25度，培养过夜。
(5)发酵20-24h，收集菌体。
通过实施上述技术方案，本发明采用L-氨基酸脱氨酶串联过氧化氢酶进行表达，提高了单位菌体的酶活，也提高了单位发酵体积菌体的量，从而具有很高的工业化运用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细说明。
实施例1：
一种提高L-氨基酸脱氨酶异源表达酶活的方法，具体操作步骤如下：
1.重组菌构建
全基因合成来源于奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)的L-氨基酸脱氨酶（L-aminoacid deaminase，LAAD）基因（genbank登录号EU669819.1）LAAD，并连入pET28a载体（NdeⅠ/Hind），构建质粒laad，转化至E.Coli BL21（DE3），构建重组菌PMLAAD；
全基因合成来源于嗜冷杆菌（Psychrobacterpiscatorii T-3）的过氧化氢酶（Catalase）基因（genbank登录号EU543218）PKTA，并连入pET28a载体（NcoⅠ/Xhol），构建质粒pkta，转化至E.Coli BL21（DE3），构建重组菌PKTA；
质粒pkta，通过PCR扩增，在pkta基因片段上游加上DNA片段（aagctttctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacc），回收正确的目的片段（含PKTA和DNA片段的目的片段）后HindⅢ/XhoⅠ双酶切，并纯化回收正确的酶切后的目的片段；质粒laad采用HindⅢ/XhoⅠ双酶切，并纯化回收正确的线性质粒；酶切片段（酶切后的目的片段和酶切后的laad线性片段）连接，构建串联表达质粒pmlaadpkta，转化至E.Coli BL21（DE3），构建重组菌PMLAADPKTA。
2. 重组菌表达
重组菌PMLAAD和PMLAADPKTA采用TB进行发酵。
1）培养基
LB：
琼脂LB-Kan平板(g/L)：
注：培养基灭菌冷却至50-60℃，100ml LB加100μl Kan溶液（100mg/ml），混匀，倒平板（25-30ml/6cm平皿）。
TB(g/L)：
2）发酵流程
(1)菌种活化：从甘油管或牛奶管接菌至LB琼脂平板（Kan，100mg/L），37℃培养12-14h。
(2)一级种子：从平板上挑取单菌至4ml LB试管，加Kan至终浓度为100mg/L，37℃，220rpm培养过夜（16h）。
(3)二级种子：取新鲜菌液按2%接种量接种于LB（100ml/500ml）摇瓶，加Kan至终浓度为100mg/L， 37℃，220rpm培养3.0-3.5h，OD600为1.0左右。
(4)1L/5L的TB发酵：二级种子2%-10%的接种量接入TB培养基（1L/5L发酵摇瓶），加Kan至25mg/L，37℃，220rpm，培养3h，开始降温25℃；加IPTG至终浓度（0.1mM），220rpm，25度，培养过夜。
(5)发酵20-24h，3500rpm*25min离心收集菌体，称量菌体，计算单位发酵体积的湿菌含量。
(6)结果：串联表达菌PMLAADPKTA达到28g/L的湿菌含量，而对照菌PMLAAD只有9.7g/L的湿菌含量，而且菌体有部分自溶。
(7)两份菌-30℃冰箱冷冻24h。
3. 酶活测定
向250ml的摇瓶中加入9ml的100mM pH6.5的磷酸盐缓冲液，然后加入1g的冷冻破胞的菌体（实验组串联表达菌PMLAADPKTA，对照组为PKTA），搅拌分散均匀，置于30℃摇床中220rpm，预热30min。然后加入10ml的L-Phe底物溶液（20g/L，pH6.5,30℃预热30min），置于30℃摇床，250rpm反应30min，反应结束后，取样，用磷酸水溶液（pH3.0）稀释20倍，并100℃水浴处理3min。离心取上清，HPLC检测产物酮苯丙氨酸浓度。
结果：实验组串联表达菌PMLAADPKTA，产物酮苯丙氨酸的浓度为3.5g/L，而对照组PMLAAD的产物浓度为2.1g/L。说明串联表达菌的L-氨基酸脱氨酶的酶活明显高于未串联过氧化氢酶的菌。
序列表
<110> 浙江正硕生物科技有限公司
<120> 一种提高L-氨基酸脱氨酶异源表达酶活的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<220>
<222> (1)..(47)
<223> DNA片段
<400> 1
aagctttcta gaaataattt tgtttaactt taagaaggag atatacc 47

Claims (7)

1.一种提高L-氨基酸脱氨酶异源表达酶活的方法，其特征在于，采用L-氨基酸脱氨酶基因与过氧化氢酶基因串联表达。
2.根据权利要求1所述一种提高L-氨基酸脱氨酶异源表达酶活的方法，其特征在于，所述L-氨基酸脱氨酶基因来源于奇异变形杆菌。
3.根据权利要求1或2所述一种提高L-氨基酸脱氨酶异源表达酶活的方法，其特征在于，过氧化氢酶基因来源于嗜冷杆菌。
4.根据权利要求3所述一种提高L-氨基酸脱氨酶异源表达酶活的方法，其特征在于，在PKTA基因片段上游加上DNA片段，所述DNA片段序列为SEQ NO.1所示序列。
5.根据权利要求4所述一种提高L-氨基酸脱氨酶异源表达酶活的方法，其特征在于，具体操作步骤如下：
1.重组菌构建
构建L-氨基酸脱氨酶基因质粒laad，转化至E.Coli BL21（DE3），构建重组菌PMLAAD；
构建过氧化氢酶基因质粒pkta，转化至E.Coli BL21（DE3），构建重组菌PKTA；
在质粒pkta上的pkta基因片段上游加上DNA片段后，HindⅢ/XhoⅠ双酶切所得目的片段，同时采用HindⅢ/XhoⅠ双酶切质粒laad，连接，构建串联表达质粒pmlaadpkta，转化至E.Coli BL21（DE3），构建重组菌PMLAADPKTA；
2.重组菌表达
采用TB培养基进行发酵。
6.根据权利要求5所述一种提高L-氨基酸脱氨酶异源表达酶活的方法，其特征在于，
(1)菌种活化；
(2) 一级种子：从平板上挑取单菌至装有LB培养基的试管，加Kan至终浓度为100mg/L，37℃，220rpm培养过夜；
(3) 二级种子：取一级种子新鲜菌液按2%接种量接种于含LB培养基的摇瓶，加Kan至终浓度为100mg/L，37℃，220rpm培养3.0-3.5h，OD600为1.0；
(4) TB发酵：二级种子2%-10%的接种量接入TB培养基，加Kan至25mg/L，37℃，220rpm，培养3h，开始降温25℃；加IPTG至终浓度为0.1mM，220rpm，25度，培养过夜；
(5) 发酵20-24h，收集菌体。
7.根据权利要求5所述一种提高L-氨基酸脱氨酶异源表达酶活的方法，其特征在于，构建L-氨基酸脱氨酶基因质粒laad和过氧化氢酶基因质粒pkta采用pET28a载体。
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