CN114806986B - 高产罗克霉素的基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了高产罗克霉素的基因工程菌及其构建方法和应用，该基因工程菌以枯草芽孢杆菌Bs916为出发菌株，敲除或者失活菌株基因组中负调控SpoⅢD和/或Spo0AⅡ基因所得。本发明的基因工程菌株发酵生产罗克霉素的产量是菌株Bs916的13.8倍，在5L发酵罐40‑50h可稳定生产罗克霉素，产量达到45‑50mg/L，该罗克霉素高产基因工程菌及其构建方法为加速罗克霉素的产业化提供原材料，同时高产罗克霉素的基因工程菌可用于制备克氏原螯虾WSSV的防治生物试剂。

Description

高产罗克霉素的基因工程菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高产罗克霉素的基因工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
枯草芽孢杆菌是饲料添加剂使用芽孢杆菌之一，其最大的优势是其产生的芽孢不仅耐热、而且抗逆，因此在自然界广泛分布。它可以产生多种抗菌物质，脂肽类抗生素是其中一种。经研究发现，生防枯草芽孢杆菌Bs916可以合成表面活性素、伊枯草素、泛革素和罗克霉素这四大脂肽类抗生素家簇，被认为是研究脂肽类抗生素的优良菌株。由于脂肽类抗生素可以广范围抑制细菌、对抗病毒、治疗肿瘤以及调节免疫活性，在生物行业、制药领域、农药研发领域以及工业生产上都具有广泛的应用价值。
罗克霉素是从生防枯草芽孢杆菌中分离出来的一组含有9个氨基酸寡肽头部和13～15个脂肪酸碳链尾巴的新型环脂肽类抗生素。罗克霉素是一种极具研究价值的抗生素，具体表现在罗克霉素具有明显的抑制细菌及病毒特性及较低的溶血性，因此在生物医药、工业、农业、养殖业等领域中都具有很好的应用前景。申请人前期研究显示罗克霉素在Bs916中的产量极低，仅达到3.6mg/L，这是限制其应用的最大瓶颈。因此，进一步了解其合成调控机理，构建高产工程菌具有重要的意义。
WSSV全称为white spot syndrome virus，即白斑综合征目前针对该疾病并没有有效的治疗手段，养殖业中也多以预防为主，其中免疫调节剂被认为是一种环境友好型、可操作实施的手段。现有治疗白斑综合征的手段包括使用多种敏感抗生素，这可能导致严重的问题，如：病原菌的抗药性、药物在鱼体中的残留、环境污染等。与此同时，与抗生素相比，疫苗接种具有安全性、环境友好性、长期疗效保护性的优势，但是疫苗的操作性不强，使用疫苗较为繁琐，且直接投撒进河道，疫苗失活较快，对水生动物免疫调节不起作用。
免疫调节剂是调节细胞免疫和体液免疫功能的制剂，已有研究证实中草药提取成分、益生菌及其所产生的活性抗菌肽能够有效应用于防治白斑综合征。
发明内容
发明目的：针对目前对罗克霉素调控机理认识不清，且现有菌株生产罗克霉素的产量甚少，限制其广泛的运用，本发明提供一种高产罗克霉素的基因工程菌，本发明通过对以枯草芽孢杆菌Bs916基因组中负调控基因SpoⅢD及Spo0AⅡ基因进行敲除或者缺失构建得到了全新的高产罗克霉素的基因工程菌。
本发明还提供所述高产罗克霉素的基因工程菌的构建方法与应用。
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种高产罗克霉素的基因工程菌，所述基因工程菌以枯草芽孢杆菌Bs916为出发菌株，敲除或者失活菌株基因组中负调控基因SpoⅢD和/或Spo0AⅡ所得。
其中，所述负调控基因SpoⅢD，Spo0AⅡ的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示。
其中，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌Bs916。
本发明所述高产罗克霉素的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)以SpoⅢD，Spo0AⅡ编码基因为模板设计引物，以枯草芽孢杆菌Bs916的基因组DNA作为模板，扩增到部分SpoⅢD，Spo0AⅡ基因片段；
(2)同源重组质粒载体pMUTINSpoⅢD的构建：扩增的SpoⅢD基因片段经过双酶切，然后连接到经过同样双酶切的质粒载体pMUTINLoc中，构建同源重组整合质粒载体pMUTINSpoⅢD；
(3)同源重组质粒载体pUCSCSpo0AⅡ的构建：扩增的Spo0AⅡ基因片段经过双酶切，然后连接到经过同样双酶切的质粒载体pUCSCSrf中，构建同源重组整合质粒载体pUCSCSpo0AⅡ；
(4)SpoⅢD基因失活突变菌株ΔSpoⅢD的构建：将构建好的重组质粒pMUTINSpoⅢD转化至枯草芽孢杆菌Bs916得到高产罗克霉素的SpoⅢD基因失活突变株ΔSpoⅢD；
(5)Spo0AⅡ基因失活突变菌株ΔSpo0AⅡ的构建：将构建好的重组质粒pUCSCSpo0AⅡ转化至枯草芽孢杆菌Bs916得到高产罗克霉素的Spo0AⅡ基因失活突变株ΔSpo0AⅡ；
(6)SpoⅢD与Spo0AⅡ双基因失活突变菌株ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD的构建：将构建好的重组质粒pUCSCSpo0AⅡ转化至枯草芽孢杆菌Bs916突变株ΔSpoⅢD中得到高产罗克霉素的SpoⅢD与Spo0AⅡ双基因失活突变菌株ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD。
作为优选，步骤(1)所述的引物为SpoⅢD-F(5’-TTTAAGCTTAAAAGAACCGGCGGAATCGT-3’)和SpoⅢD-R(5’-TTTGGATCCCTGACATTTCCGCTTACCTG-3’)用于扩增SpoⅢD基因片段；Spo0AⅡ-F(5’-TTTAAGCTTCTTTTCCCGCTTGTCTTCTC-3’)和Spo0AⅡ-R(5’-TTTGGATCCTTCTTGTACTTTAGTTTCGT-3’)用于扩增Spo0AⅡ基因片段。
作为优选，本发明所述高产罗克霉素的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)以SpoⅢD及Spo0AⅡ编码基因为模板设计引物，以枯草芽孢杆菌Bs916的基因组DNA作为模板，扩增获得部分SpoⅢD及Spo0AⅡ基因片段；
(2)以枯草芽孢杆菌Bs916中SpoⅢD编码基因序列设计引物SpoⅢD-F和SpoⅢD-R，以枯草芽孢杆菌Bs916基因组为模板，扩增部分SpoⅢD基因，获得840bp基因片段，扩增的SpoⅢD基因片段经过HindIII和BamHI双酶切，然后经过T4DNA连接酶连接到经过同样双酶切的质粒载体pMUTINLoc中，构建同源重组整合质粒载体pMUTINSpoⅢD，转化至枯草芽孢杆菌Bs916得到高产罗克霉素的基因工程菌SpoⅢD基因突变株ΔSpoⅢD；以枯草芽孢杆菌Bs916中Spo0AⅡ编码基因序列设计引物Spo0AⅡ-F和Spo0AⅡ-R，以枯草芽孢杆菌Bs916基因组为模板，扩增部分Spo0AⅡ基因，获得840bp基因片段，扩增的Spo0AⅡ基因片段经过HindIII和BamHI双酶切，然后经过T4DNA连接酶连接到经过同样双酶切的质粒载体pUCSCSrf中，构建同源重组整合质粒载体pUCSCSpo0AⅡ转化至枯草芽孢杆菌Bs916得到高产罗克霉素的基因工程菌Spo0AⅡ基因突变株ΔSpo0AⅡ。
(3)ΔSpoⅢD突变菌株的构建
以枯草芽孢杆菌Bs916为出发菌株制备感受态细胞，采用化学转化方法，将构建的SpoⅢD基因突变载体pMUTINSpoⅢD转化入枯草芽孢杆菌Bs916，其中，所述重组质粒载体pMUTINSpoⅢD含有SpoⅢD基因同源双交换臂，红霉素抗性基因，可定向对枯草芽孢杆菌Bs916中的SpoⅢD基因进行失活。
(4)ΔSpo0AⅡ突变菌株的构建
以枯草芽孢杆菌Bs916为出发菌株制备感受态细胞，采用化学转化方法，将构建的Spo0AⅡ基因突变载体pUCSCSpo0AⅡ转化入枯草芽孢杆菌Bs916，其中，所述重组质粒载体pUCSCSpo0AⅡ含有Spo0AⅡ基因同源双交换臂，壮观霉素抗性基因，可定向对枯草芽孢杆菌Bs916中的Spo0AⅡ基因进行失活。
(5)ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD双基因失活突变菌株的构建
以突变菌株ΔSpoⅢD为出发菌株制备感受态细胞，采用化学转化方法，将构建的Spo0AⅡ基因突变载体pUCSCSpo0AⅡ转化入突变菌株ΔSpoⅢD，其中，所述重组质粒载体pUCSCSpo0AⅡ含有Spo0AⅡ基因同源双交换臂，壮观霉素抗性基因，即可得到具有红霉素抗性和壮观霉素抗性的SpoⅢD及Spo0AⅡ双基因失活突变菌株ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD。
本发明所述高产罗克霉素的基因工程菌在发酵生产罗克霉素中的应用。
其中，所述发酵为通过基因工程菌进行发酵罐发酵：将菌种活化后制备种子液，按照体积比10-20％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在6.8-7.2，温度维持在35-38℃，溶氧在25-35％之间；发酵周期40-50h。
作为优选，所述发酵培养基组成为：葡萄糖10g/L，麦芽糖浆40-50g/L，玉米浆15-20g/L，尿素0.6-0.8g/L，K2HPO4 7g/L，MgSO4·7H2O 0.35g/L，FeSO4·7H2O10mg/L，(NH4)2SO43g/L，MnSO4·H2O 0.05g/L，VB1、VB3、VB5、VB12、VH各1-3mg/L，pH 7.0-7.2。
作为优选，在上述发酵培养基和发酵条件可以提升所述高产工程菌中罗克霉素的产量达到45-50mg/L。
本发明所述高产罗克霉素的基因工程菌在制备用于克氏原螯虾白斑综合征的防治生物试剂中的应用。
本发明所述SpoⅢD及Spo0AⅡ基因失活的枯草芽孢杆菌基因工程菌ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD生产的罗克霉素对WSSV病毒具有很强抑制繁殖的作用，可应用克氏原螯虾WSSV疫病的防治。
本发明利用SpoⅢD及Spo0AⅡ基因失活的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)Bs916作为发酵菌株，以上述优选培养基及发酵条件作为物质基础进行发酵，发酵液对WSSV病毒具有较好的抑制效果，能有效降低克氏原螯虾WSSV疫病的病发率及病虾中的WSSV拷贝数。
本发明所述SpoⅢD和/或Spo0AⅡ编码基因在调控枯草芽孢杆菌罗克霉素产量中的应用。
现有对罗克霉素的调控机理认识不清，导致对罗克霉素的研究进展缓慢，且菌株所产罗克霉素的产量较低，影响其后续商业化生产与运用。本发明通过基础研究，发现Spo0AⅡ和SpoⅢD两个调控因子对罗克霉素的负调控作用，初步打断了对罗克霉素研究的瓶颈，提高了罗克霉素的产量，使罗克霉素的商业化生产成为可能。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明利用同源重组的方法，成功构建了一株提高罗克霉素产量的菌株ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD。与原始菌株Bs916相比，经过菌种改良的菌株ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD产生罗克霉素的能力显著提高，产量是原始菌株Bs916的10.6倍，远超现有其他野生菌菌株或者工程菌株罗克霉素的产量。
此外，本发明还揭示了SpoⅢD及Spo0AⅡ基因对罗克霉素的产生有阻抑作用，利用pMUTINSpoⅢD及pUCSCSpo0AⅡ载体对任何可遗传转化的枯草芽孢杆菌进行基因改良，以获得相应的改良菌种，达到提高罗克霉素产量的目的。在优化后的培养基中每升发酵液可制备获得45-50mg罗克霉素纯品，该基因工程菌生产的罗克霉素纯品可应用于克氏原螯虾WSSV的防治。本发明的基因工程菌及其构建方法为加速罗克霉素的产业化带来了可能与希望，也为其他脂肽类抗生素高产菌株的构建及产业化提供了可行的思路方案。
附图说明
图1为SpoⅢD及Spo0AⅡ部分基因突变载体的构建流程图；
图2为SpoⅢD及Spo0AⅡ同源重组整合质粒载体验证电泳图；
图3为枯草芽孢杆菌Bs916、突变株ΔSpoⅢD、突变株ΔSpo0AⅡ、突变株ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD抑制金黄色葡萄球菌活性示意图；
图4为枯草芽孢杆菌Bs916、突变株ΔSpoⅢD、突变株ΔSpo0AⅡ、突变株ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD产罗克霉素高效液相色谱分析示意图；
图5为枯草芽孢杆菌Bs916和突变株ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD处理塘口的病虾率；
图6为患白斑综合征克氏原螯虾；
图7为Bs916和ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD处理对克氏原螯虾WSSV病毒抑制作用。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
本发明实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
其中枯草芽孢杆菌Bs916，，保藏号CGMCC No.0808，在很多在先申请中均有报道如CN103524600A。由淮阴工学院罗楚平课题组提供，(表面活性素、杆菌霉素L、罗克霉素和泛革素4种脂肽类抗生素高效制备方法及其生物学活性，西南农业学报，2018年31卷11期)。
其中pMUTINLoc质粒以pMUTIN4为骨架，在多克隆位点HindIII和BamHI处插入了外源DNA片段Loc(以LocDF(5’-TTTAAGCTTTCAGGTACCAACGATGAACA-3’)和LocDR(5’-TTTGGATCCTTGTCCATTACAGCTACGGT-3’)作为引物，以Bs916的基因组DNA作为模板，PCR扩増到一条长812bp的片段为Loc，SEQ ID NO.3)，pMUTIN4购于美国芽孢杆菌菌株保藏中心(Bacillus Genetic Stock Center)，质粒编号为ECE139。
pUCSCSrf质粒以pUCSC为骨架，在多克隆位点HindIII和BamHI处插入了外源DNA片段Srf(以SrfA-AF(5’-TTTAAGCTTACACAGATATCAGGCAAGC-3’)和SrfA-AR(5’-TTTGGATCCGTCCCATCGTTCCTTCACA-3’)作为引物，以Bs916的基因组DNA作为模板，PCR扩增到一条长908bp的片段为Srf，SEQ ID NO.4)，pUCSC质粒含有pUC19(TranGene)的大肠杆菌复制起点和氨苄青霉素抗性基因，来源于pDG1728质粒壮观霉素抗性基因。其中pDG1728购于美国芽孢杆菌菌株保藏中心(Bacillus Genetic Stock Center)，质粒编号为ECE1728。
以SpecF(5’-TTTGGATCCCTGCAGCCCTGGCGAATG-3’)和SpecR(5’-TTTGAATTCAGATCCCCCTATGCAAGG-3’)作为引物，以pDG1728质粒作为模板，PCR扩増到一条长1182bp的含有壮观霉素表达盒的片段；表达盒经BamHI和EcoRI双酶切后克隆至pUC19载体，构建为重组载体pUCSC
质粒的构建参考文献：罗楚平.枯草芽胞杆菌Bs916产罗克霉素、表面活性素、杆菌霉素和泛革素的结构鉴定、合成途径及生物学功能[D].南京农业大学，2014.
SP盐：0.2％(NH4)2SO4，1.4％K2HPO4，0.6％KH2PO4，0.02％MgSO4·7H2O，0.1％柠檬酸钠。
CAYE(100×)：2％Casamino acid，10％酵母膏。
SpI培养基：SP盐溶液加入1％体积浓度为50％葡萄糖溶液以及1％体积100×CAYE溶液。
SpII培养基：SPI培养基加入1％体积50mmol/L CaCl2溶液，1％体积250mmol/LMgCl2溶液。
实施例1
SpoⅢD及Spo0AⅡ基因突变载体的构建
以枯草芽孢杆菌Bs916基因组中SpoⅢD基因序列设计引物SpoⅢD-F(5’-TTTAAGCTTAAAAGAACCGGCGGAATCGT-3’)和SpoⅢD-R(5’-TTTGGATCCCTGACATTTCCGCTTACCTG-3’)，以枯草芽孢杆菌Bs916基因组为模板，扩增部分SpoⅢD基因序列(SEQ ID NO.1)，获得840bp基因片段；采用Taq DNA聚合酶Mix(擎科生物技术有限公司)，PCR程序为：94℃5min；35×(94℃30s；52℃30s；72℃1.5min)；72℃10min。如图2a所示，泳道1为扩增的SpoⅢD片段。扩增片段经过切胶回收后，保存备用。
以枯草芽孢杆菌Bs916中基因组Spo0AⅡ基因基因序列设计引物Spo0AⅡ-F(5’-TTTAAGCTTCTTTTCCCGCTTGTCTTCTC-3’)和Spo0AⅡ-R(5’-TTTGGATCCTTCTTGTACTTTAGTTTCGT-3’)，以枯草芽孢杆菌Bs916基因组为模板，扩增部分Spo0AⅡ基因序列(SEQ ID NO.2)，获得840bp基因片段；采用Taq DNA聚合酶Mix(擎科生物技术有限公司)，PCR程序为：94℃5min；35×(94℃30s；55℃30s；72℃1.5min)；72℃10min，PCR反应体系详见表1。如图2a所示，泳道2为扩增的Spo0AⅡ片段。扩增片段经过DNA产物纯化试剂盒纯化浓缩后回收后，保存备用。
表1 PCR反应体系
将扩增获得的部分SpoⅢD片段与pMUTINLoc质粒经HindIII和BamHI37℃双酶切3h后进行切胶回收，回收产物借助快速连接试剂盒(T4连接酶)进行连接(图1)。所得的连接产物可直接将其转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过含氨苄青霉素的LB固体平板进行阳性克隆子的筛选。进一步地，对正确的转化子进行菌落PCR检测鉴定，以步骤(1)中所设计的上下引物进行扩增，以正确的转化子的菌落为模板，扩增条件如步骤(1)，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2b，为840bp大小的条带。其结果验证正确。通过提取质粒，酶切验证，如图2a所示，泳道4为经HindIII和BamHI双酶切后的pMUTINLoc质粒。重组质粒pMUTINSpoⅢD(图2b)双酶切后1％琼脂糖凝胶电泳验证得到840bp和8610bp两条大小的条带，与预期结果相符合。验证成功的载体可用于枯草芽孢杆菌的转化。
将扩增获得的部分Spo0AⅡ片段与pUCSCSrf质粒经HindIII和BamHI37℃双酶切3h后进行切胶回收，回收产物借助快速连接试剂盒(T4连接酶)进行连接(图1)。所得的连接产物可直接将其转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过含氨苄青霉素的LB固体平板进行阳性克隆子的筛选。进一步地，对正确的转化子进行菌落PCR检测鉴定，以步骤(1)中所设计的上下引物进行扩增，以正确的转化子的菌落为模板，扩增条件如步骤(1)，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2b，为840bp大小的条带。其结果验证正确。通过提取质粒，酶切验证，如图2a所示，泳道3为经HindIII和BamHI双酶切后的pUCSCSrf质粒。重组质粒pUCSCSpo0AⅡ(图1)双酶切后1％琼脂糖凝胶电泳验证得到840bp和4705bp两条大小的条带，与预期结果相符合。验证成功的载体可用于枯草芽孢杆菌的转化。
实施例2
基因突变芽孢杆菌ΔSpoⅢD、ΔSpo0AⅡ、ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD的构建
将构建好的pMUTINSpoⅢD突变载体转化枯草芽孢杆菌Bs916，通过同源重组的方式整合到枯草芽孢杆菌Bs916基因组上，在Bs916基因组SpoⅢD位点发生双交换，抗性平板上筛选得到红霉素抗性菌株，并进行PCR验证，正确的转化子命名为ΔSpoⅢD。该菌株的SpoⅢD基因被红霉素抗性基因所插入突变，成为突变了SpoⅢD基因的突变菌株，即所改良的菌株ΔSpoⅢD。
将构建好的pUCSCSpo0AⅡ突变载体转化枯草芽孢杆菌Bs916，通过同源重组的方式整合到枯草芽孢杆菌Bs916基因组上，在Bs916基因组Spo0AⅡ位点发生双交换，抗性平板上筛选得到壮观霉素抗性菌株，并进行PCR验证，正确的转化子命名为ΔSpo0AⅡ。该菌株的Spo0AⅡ基因被壮观霉素抗性基因所插入突变，成为突变了Spo0AⅡ基因的突变菌株，即所改良的菌株ΔSpo0AⅡ。具体过程为：挑枯草芽孢杆菌Bs916单菌落接种至25mLSpI培养基，30℃、180r/min振荡培养过夜。以1:25体积接种到新鲜的SpI培养基，30℃、250r/min振荡培养OD600至2.0，约3.5h；以1:10体积接种到SpII培养基，37℃、150r/min振荡培养1.5h后，以5000r/min离心收集。菌体以上清液1/10体积进行悬浮即用作枯草芽孢杆菌Bs916感受态细胞。在250μL感受态细胞中加入终浓度为1mmol/L EGTA，37℃，150r/min振荡培养，10min后加入1μg pMUTINSpoⅢD或者pUCSCSpo0AⅡ质粒，37℃，150r/min振荡培养1h，再以37℃，250r/min继续振荡培养30min。最后涂布在含有卡那霉素(50μg/mL)和红霉素(1μg/mL)的LB双抗性平板上。
将构建好的pUCSCSpo0AⅡ突变载体转化至突变菌株ΔSpoⅢD，通过同源重组的方式整合到突变菌株ΔSpoⅢD基因组上，在突变菌株ΔSpoⅢD基因组Spo0AⅡ位点发生双交换，抗性平板上筛选得到具有红霉素抗性和壮观霉素抗性的菌株，并进行PCR验证，正确的转化子命名为ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD。该菌株的Spo0AⅡ基因被壮观霉素抗性基因所插入突变，成为突变了Spo0AⅡ基因和SpoⅢD基因的突变菌株，即所改良的菌株为ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD。
具体过程为：挑突变菌株ΔSpoⅢD单菌落接种至25ml SpI培养基，30℃、180r/min振荡培养过夜。以1:25体积接种到新鲜的SpI培养基，30℃、250r/min振荡培养OD600至2.0，约3.5h；以1:10体积接种到SpII培养基，37℃、150r/min振荡培养1.5h后，以5000r/min离心收集。菌体以上清液1/10体积进行悬浮即用作突变菌株ΔSpoⅢD感受态细胞。在250μL感受态细胞中加入终浓度为1mmol/L EGTA，37℃，150r/min振荡培养，10min后加入1μgpUCSCSpo0AⅡ质粒，37℃，150r/min振荡培养1h，再以37℃，250r/min继续振荡培养30min。最后涂布在含有卡那霉素(50μg/mL)和红霉素(1μg/mL)的LB双抗性平板上。
实施例3
枯草芽孢杆菌Bs916，Spo0AⅡ基因失活突变株ΔSpo0AⅡ和SpoⅢD基因失活突变株ΔSpoⅢD、以及突变株ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD抑制金黄色葡萄球
采用牛津杯法进行抑菌活性的测定，具体步骤包括：活化枯草芽孢杆菌Bs916、突变菌株ΔSpoⅢD、突变菌株ΔSpo0AⅡ和突变菌株ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD，取各个突变菌株单菌落于5mL LB液体培养基中于180rpm/min、37℃恒温箱中培养12h后，按体积比2％的量将对数期的金黄色葡萄球菌菌液接种至100mL冷却至46℃的LB固体培养基中，混匀后倒入无菌平板中，将平板等分并做好标注，无菌操作下夹取牛津杯垂直放置在无菌平板中，各取200uL培养的各个突变株菌液加入到牛津杯中，进行实验对比，静置平放于37℃培养箱中培养24h，观察牛津杯周围抑菌圈，抑菌圈直径(mm)＝测量总直径(mm)-牛津杯直径(mm)。
如图3，枯草芽孢杆菌Bs916抑菌圈直径为8.6mm，ΔSpo0AⅡ抑菌圈直径为9.6mm，ΔSpoⅢD抑菌圈直径为10.0mm，突变菌株ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD抑菌圈直径为13.0mm，抑制区面积分别为野生型菌的2.8倍，3.6倍，10.6倍。
综上所述，菌株ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD对金黄色葡萄球菌有良好的抑制效果，并且比原始菌株和前两种突变株显著增效。
实施例4
突变菌株ΔSpoⅢD、突变菌株ΔSpo0AⅡ和突变菌株ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD产罗克霉素的含量
活化枯草芽孢杆菌Bs916、突变菌株ΔSpoⅢD、突变菌株ΔSpo0AⅡ和突变菌株ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD，分别挑取单菌落至5mlLB液体培养基中37℃、180r/min培养12h，制备种子液，按照体积比1％接种量将种子液接入含有200ml LB培养液的500mL摇瓶中，37℃，180rpm培养48h，菌液离心(10000r/5min)取上清液酸沉，加盐酸调pH值2.5-2.8，在4°冰箱中静置24h，再次离心(12000r/15min)，取沉淀用100％甲醇浸提，采用去离子水稀释为含30％甲醇水溶液，加氢氧化钠调pH至6.5-7.0，然后上样于NH2固相萃取柱，分别用30％甲醇水，50％甲醇水，100％甲醇，0.5％甲酸甲醇溶液，1％甲酸甲醇溶液，2％甲酸甲醇溶液梯度洗脱，随后进行高效液相色谱检测(HPLC)，色谱柱为25mm×5mm C18柱(安捷伦3.5μm，4.6×250mm)，流动相为乙腈和水(1％TFA)，比例为50％：50％，流速0.5mL/min，紫外检测波长230nm。
实验结果如图4所示，目标化合物在2％甲酸甲醇洗脱溶液中检测到，其中，出发菌株枯草芽孢杆菌Bs916的峰面积为1056.1，突变体ΔSpo0AⅡ的峰面积为2617.6，突变体ΔSpoⅢD的峰面积为4043.3，突变体ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD的峰面积为9612.2，即突变体ΔSpoⅢD的产量是野生型的3.8倍，突变体ΔSpo0AⅡ的产量是野生型的2.6倍，突变体ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD的产量是野生型的9.2倍，说明突变体ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD敲除或者失活菌株基因组中负调控基因SpoⅢD和Spo0AⅡ显著增效。
实施例5
突变菌株ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD高产罗克霉素的发酵培养基优化。
首先，利用LB培养基活化枯草芽孢杆菌Bs916，突变株ΔSpoⅢD，突变株ΔSpo0AⅡ和突变株ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD，37℃，180rpm条件下培养24h。
以此对数期培养液作为种子液，按体积比15％接种量接种于3L的LB培养基或优化培养基(葡萄糖10g/L，麦芽糖浆40g/L，玉米浆15g/L，尿素0.8g/L，K2HPO4 7g/L，MgSO4·7H2O 0.35g/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，(NH4)2SO4 3g/L，MnSO4·H2O 0.05g/L，VB1、VB3、VB5、VB12、VH各2mg/L)的5L发酵罐中进行培养，发酵过程pH稳定在7.0左右，温度维持在37℃，溶氧在30％，发酵周期48h，即为种子液。枯草芽孢杆菌Bs916，突变株ΔSpoⅢD，突变株ΔSpo0AⅡ和突变株ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD发酵产罗克霉素的含量，具体方法同实施例4。结果显示，枯草芽孢杆菌Bs916在LB培养基中发酵生产的罗克霉素产量达到3.6mg/L,突变株ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD在LB培养基中发酵生产的罗克霉素产量达到35-40mg/L，而经上述优化培养基和发酵条件发酵生产的罗克霉素的产量是菌株Bs916的13.8倍，产量达到45-50mg/L。
实施例6
枯草芽孢杆菌Bs916和突变株ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD对克氏原螯虾发病率的影响
本实验养殖试验地为30亩，均分为六个塘口，以塘口一和塘口二为对照塘口，塘口三和塘口四喷洒Bs916菌液，塘口五和塘口六喷洒ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD菌液。每隔15天，取各个塘口50只克氏原螯虾进行健康状况检测，根据观察克氏原螯虾是否有活力，虾壳的颜色是否正常以及解剖虾后，观察克氏原螯虾的肠道，虾壳上是否有明显溃烂的灰白色斑点，判断虾是否患病(如图6)。根据上诉检测标准检测后，计算病虾率。如图5所示，喷洒ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD菌液菌液的塘口，克氏原螯虾的发病率比喷洒Bs916菌液的塘口和空白对照发病率低，说明喷洒ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD菌液可以在一定程度上降低克氏原螯虾的发病率。
本实验喷洒的Bs916菌液和ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD菌液均为实施例5所述的优化培养基发酵产生的种子液，喷洒量为1L/亩。
实施例7
ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD对克氏原螯虾WSSV防治
挑选规格相近、肢体健全、富有活力，无明显病灶的克氏原螯虾置于水族箱中，共360只；每天投喂基础饲料或免疫饲料3次，日投喂量约为克氏原螯虾体重的5％，每3天换水一次，换水量为养殖水体的1/3，持续14天。本实验分为空白对照组、喷Bs916组、喷ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD组共3个小组，每组三个重复。每24h每组分别投喂基础饲料或免疫饲料1次，日投喂量约为克氏原螯虾体重的5％，24h换水一次，换水量为养殖水体的1/3，持续3天。实验3d后，对喷Bs916组、喷ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD组和空白对照组的克氏原螯虾进行WSSV人工感染实验。人工感染实验第1天，投喂混合克氏原螯虾病料的基础饲料及免疫饲料。之后养殖管理继续投喂相应的基础饲料及免疫饲料，每隔24h，提取存活的对照组和经过枯草芽孢杆菌Bs916和ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD处理的克氏原螯虾的基因组DNA进行荧光定量PCR测定WSSV病毒拷贝数(如图7)。结果显示，突变株ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD和枯草芽孢杆菌Bs916抑制WSSV病毒繁殖的效果都优于空白对照组，且突变株ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD抑制WSSV病毒繁殖的效果明显优于枯草芽孢杆菌Bs916。
本实验采用的克氏原螯虾病料为用毒种为患白斑综合征的病虾(PCR检测WSSV为中国大陆株，呈强阳性)头胸部去除肝胰腺后剪碎混合作为感染实验用克氏原螯虾病料，分成小份，-80℃保存备用。
病虾检测：提取克氏原螯虾的基因组DNA，使用引物WSSVF(5’-AGCTCCAACACCTCCTCCTTCA-3’)和WSSVR(5’-TTACTCGGTCTCAGTGCCAGA-3’)进行荧光定量PCR测定。荧光定量PCR反应体系(10μl)：5μl 2×Premix Ex Taq，200ng基因组DNA，2μl vF2(1μM)，2μl vR1(1μM)。Real time PCR程序为：95℃3min；95℃3s，60℃50s。共40循环；制作60-95℃的溶解曲线，每0.5℃读板；10℃保存。Real time PCR重复三次；qPT-PCR仪是real-time thermal cycler(Bio-Rad，USA)
本实验采用的基础饲料具体含量为粗蛋白含量≥30％，粗纤维含量≤10％，粗脂肪含量≥4.0％，粗灰分含量≤20.0％，总磷含量≥0.6％，水分含量≤12.0％，赖氨酸含量≥1.4％，粒径3.0mm，采购自连云港通威饲料有限公司。
本实验采用的免疫饲料①为喷洒Bs916(约2×108cfu/mL，添加量为5mL/kg)与基础饲料充分混匀，并放在阴凉通风处阴干，使添加剂黏附于饲料上。
本实验采用的免疫饲料②为喷洒ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD(约2×108cfu/mL，添加量为5mL/kg)与基础饲料充分混匀，并放在阴凉通风处阴干，使添加剂黏附于饲料上。
序列表
<110> 淮阴工学院
<120> 高产罗克霉素的基因工程菌及其构建方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 840
<212> DNA
<213> SpoⅢD基因(SpoⅢDArtificial Sequence)
<400> 2
cttttcccgc ttgtcttctc cctgttcccg ctgaatccag ccgttttctt caaggcgttt 60
gatcgttctg gtaacggtcg gcgcctctac gttcagatag gaccagattt ctttttgggt 120
catcggtccg atcgttttta agcaatatag gattgaccat tgagaggagt acaggccgaa 180
tggttccagc cgttcattgg ctttcttcgt aatcaggcgg gcgcattgat tgatttggtg 240
aatgaggcgt ctgttgacgt ggatcatttc cgttctcctt ttcaaaaaac ttacctaagt 300
aactaattgt gctgtttcat tctacagcag gatcgcgcgg atgtaaaccc cccgatcaaa 360
aagcagaaaa ttatgacccg ccccttgtcc ttattgagtt tttagcatat tcccaattca 420
ttgctaatac actgttacaa acctatcaaa gagagtgttt gaggtgaggg atcgtgggca 480
tatttctaaa accttcttat ataatcggac aacgaagaag ctgcatcatc agtgaatctg 540
ttacagaata cggatctcat ttcacacttc tcacatccaa ctggggaggt cgagtggtgt 600
gcacgattac atcaaagagc gaacaatcaa gattggtaag tatatcgtgg agacgaaaaa 660
aaccgttcgt gtcattgcga aagagtttgg tgtttccaaa agtaccgtac acaaagatct 720
gacagagcgc ctgcctgaaa tcaatcctga cttggcgaat gaagtaaaag aaatactcga 780
ttatcataaa tccatcagac atttaagagg gggagaggcg acgaaactaa agtacaagaa 840
<210> 1
<211> 840
<212> DNA
<213> Spo0AⅡ基因(Spo0AⅡArtificial Sequence)
<400> 1
aaaagaaccg gcggaatcgt tcaggggatg agcggaagcc cgatcatcca gaacggaaag 60
gtcgtcggag ccgtaaccca cgtatttgtc aatgatccga caagcggcta cggcgttcat 120
atcgaatgga tgctgtctga agcgggtgtt gatgtttacg ggaaagacaa agcaagctga 180
ctgccggatg atccggcagt ttttttatgt gatgcgttct tcacttcttt cctggattca 240
tgtaaaataa gacatgaaga tttttcgaca aattcacgtt tcctgatttg tcaaacttaa 300
tttttagtcg aaaaacctag aaaatgctag aaaaacaaag atataccact attattggta 360
aatatggatt ttttaaaagg ggaagtagtg gttttgtcga atgtaacatg tagcagtcaa 420
atgggttgcg tcctgttaat acattggggg aggaagaaac gtggagaaaa ttaaagtttg 480
tgttgctgat gataatcgag agcttgtaag cctgttgagt gaatatatag agggacagga 540
tgatatggaa gtgatcggcg ttgcttataa cggacaggaa tgtctttctt tgtttaaaga 600
taagaatcca gatgtgctcg ttttagacat tatcatgccg catctggacg gacttgcggt 660
tttggagcgt ctgcgggaat cagagctcga gaagcagccg aacgtcatca tgctgacggc 720
attcggtcag gaagacgtta cgaaaaaagc cgtcgattta ggcgcgtcct atttcatcct 780
gaagccgttt gatatggaaa accttgtcgg ccatattcgc caggtaagcg gaaatgtcag 840
<210> 3
<211> 812
<212> DNA
<213> Loc(Artificial Sequence)
<400> 3
tcaggtacca acgatgaaca taagttgaaa ttttttaagg tttgggaaaa attaaataat 60
ccttatctga tatgtgatat ggaacaatat gagaatttaa tgaaatatgc acagcatgca 120
ggaatagata ctgtaaaaat acgcaataga gtaattgata ttcaagaagt ttataatttc 180
gaggaagagg gcctcatcca caagtgtaca gaagatgata ttgcatttgt acagttttct 240
tcgggttcaa ctggtgaccc caagggggtt atattaaaac accgcaatat aatggcaaat 300
atagaaggaa tcattaccaa tggtgaaatg agtaagagtg acagtttatt aacttggctg 360
cctttaacgc atgacatggg gattattggc tgtcatttag taccgacatt tttgaatatt 420
aatcaagtgc agattaatac aaatgatttc attagaagac ctactctatg gcttgagaaa 480
gccactcagc ataaatcaac tttattattc tctcctaatt ttggatacag atataccttg 540
aaatatatga aaaaattttc aatgaactat gatttatcac atgttcggtt aattataaat 600
ggtgctgaac caatttcggc tgacttatgt gaagaatttt tatctgaaat gagtcagtat 660
ggtttaaaaa agagaacgat gcttccatca tatggacttg ctgaggcctg tcttggtgta 720
gcttcaccta atccatctga aggaaaaata atagagtggg tcattgatag aagaaaaatg 780
aatattggtg ataccgtagc tgtaatggac aa 812
<210> 4
<211> 908
<212> DNA
<213> Srf(Artificial Sequence)
<400> 4
acacagatat caggcaagcc ggctgctctg cggacgagct gtcaaaatgg gggcgtgaag 60
aagctggcaa gcctctggcg ttatatgatc aggatttatt ccgtttttcc gtgcacacga 120
tcagtgaaaa tgaggtctgg ttttacgcta atgtgcatca cattatttca gacgggattt 180
ccatgacgat tctgggcaat gcgattaccg atatttattt ggagctctca ggcggagcaa 240
gtgaggaaca gacggagatt ccttctttta tcgagcacgt gctgacagag caggaatatg 300
tgcagtcgaa gcggtttaaa aaggatcggg atttttggaa cgggcagttt gagaccgtgc 360
cggagcttgt gtccctgaaa cggagccagg cagatgcggg tcttgatgca aaacggtttt 420
ctcaagaaat tcctcacgac ttatatggcc gcattcattc attctgcgag gagcataaag 480
tcagcgtact atctctgttc cagtcagctc tgatcactta tctctacaaa gtgaccggcc 540
gggatgacgt tgtcacgggt acgtttatgg gaaaccggac gaatgcgaaa gaaaagcaga 600
tgctcgggat gttcgtatct acggtgcctg tgcggacaag tgttgacgga ggacagtcgt 660
tcttggaatt cgttaaaggc cggatgaagg atctgatgaa aattctccgc caccaaaagt 720
atccgtataa cctgcttgtc aatgatttgc gcgcttcgaa aagttcgctg agcagattgt 780
ttacggtggc tctggagtac caggtgatgc agtggcagaa aaaagagaat ctgtccttcc 840
tgacagaccc tattttcagc ggaagcggta caaatgatat ttcaattcat gtgaaggaac 900
gatgggac 908

Claims (8)

1.一种高产罗克霉素的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以枯草芽孢杆菌为出发菌株，敲除或者失活菌株基因组中负调控基因SpoⅢD和Spo0AⅡ所得；所述负调控基因SpoⅢD，Spo0AⅡ的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌Bs916，保藏号CGMCC No.0808。
2.一种权利要求1所述的高产罗克霉素的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）以SpoⅢD，Spo0AⅡ编码基因为模板设计引物，以枯草芽孢杆菌Bs916的基因组DNA作为模板，扩增到部分SpoⅢD，Spo0AⅡ基因片段；
（2）同源重组质粒载体pMUTINSpoⅢD的构建：扩增的SpoⅢD基因片段经过双酶切，然后连接到经过同样双酶切的质粒载体pMUTINLoc中，构建同源重组整合质粒载体pMUTINSpoⅢD；
（3）同源重组质粒载体pUCSCSpo0AⅡ的构建：扩增的Spo0AⅡ基因片段经过双酶切，然后连接到经过同样双酶切的质粒载体pUCSCSrf中，构建同源重组整合质粒载体pUCSCSpo0AⅡ；
（4）SpoⅢD基因失活突变菌株ΔSpoⅢD的构建：将构建好的重组质粒pMUTINSpoⅢD转化至枯草芽孢杆菌Bs916得到高产罗克霉素的SpoⅢD基因失活突变株ΔSpoⅢD；
（5）Spo0AⅡ基因失活突变菌株ΔSpo0AⅡ的构建：将构建好的重组质粒pUCSCSpo0AⅡ转化至枯草芽孢杆菌Bs916得到高产罗克霉素的Spo0AⅡ基因失活突变株ΔSpo0AⅡ；
（6）SpoⅢD与Spo0AⅡ双基因失活突变菌株ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD的构建：将构建好的重组质粒pUCSCSpo0AⅡ转化至枯草芽孢杆菌Bs916突变株ΔSpoⅢD中得到高产罗克霉素的SpoⅢD与Spo0AⅡ双基因失活突变菌株ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD。
3.根据权利要求2的构建方法，其特征在于，步骤（1）所述的引物为SpoⅢD-F ：5’-TTTAAGCTTAAAAGAACCGGCGGAATCGT-3’和SpoⅢD-R ：5’-TTTGGATCCCTGACATTTCCGCTTACCTG-3’用于扩增SpoⅢD基因片段；Spo0AⅡ-F：5’-TTTAAGCTTCTTTTCCCGCTTGTCTTCTC-3’和Spo0AⅡ-R：5’-TTTGGATCCTTCTTGTACTTTAGTTTCGT-3’用于扩增Spo0AⅡ基因片段。
4.一种权利要求1所述的高产罗克霉素的基因工程菌在发酵生产罗克霉素中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵为通过基因工程菌进行发酵罐发酵：将菌种活化后制备种子液，按照体积比10-20%接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在6.8-7.2，温度维持在35-38℃，溶氧在25-35%之间；发酵周期40-50h。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基组成为：葡萄糖10g/L，麦芽糖浆40-50g/L，玉米浆15-20g/L，尿素0.6-0.8g/L，K2HPO4 7g/L，MgSO4·7H2O 0.35g/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，（NH4）2SO4 3g/L，MnSO4·H2O 0.05g/L，VB1、VB3、VB5、VB12、VH各1-3mg/L，pH 7.0-7.2。
7.一种权利要求1所述的高产罗克霉素的基因工程菌在制备用于克氏原螯虾白斑综合征防治生物试剂中的应用。
8.一种SpoⅢD和Spo0AⅡ编码基因在调控枯草芽孢杆菌罗克霉素产量中的应用。
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