CN104651380A - 环脂肽抗生素罗克霉素生物合成相关的基因簇 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及环脂肽抗生素罗克霉素(Locillomycin)合成的基因簇,具体说是一种由枯草芽胞杆菌产生的具有抗细菌和病毒的新型环脂肽抗生素-罗克霉素(locillomycin)的生物合成基因簇的克隆、测序、分析、功能研究及其应用。整个基因簇包括10个基因:4个与罗克霉素大环生物合成相关的基因,2个调控相关基因,4个转运相关的基因。通过对上述相关基因的遗传操作可阻断或影响罗克霉素的合成。本发明所提供的基因及其蛋白也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。
Description
技术领域:
本发明属于微生物基因资源和基因工程领域,具体涉及具有广谱抗菌活性,特别是抗病毒活性的环脂肽抗生素罗克霉素(locillomycin)的生物合成、分析、功能研究及应用。
技术背景:
脂肽类抗生素是枯草芽孢杆菌及其相近物种通过非核糖体合成途径合成的一类由亲水性环状短肽头部和长链疏水性脂肪酸尾部组成的次生代谢产物,具有抗菌活性和溶血性能,在医药、农药和工业上具有广泛的应用价值。脂肽类抗生素根据其合成的基因簇和化学结构的差异可分为表面活性素(Surfactin)、伊枯草素(Iturin)和泛革素(Fengycin)三大家簇。
表面活性素家簇结构的共同特点是由7个氨基酸残基的多肽链通过酯键与含有13~15个碳原子β-羟基脂肪酸交联形成内酯环状结构的极性化合物。表面活性素通过作用于细胞膜的磷脂双分子层而表现出较强溶血活性、抑制细菌和病毒的活性。该家簇主要包括枯草芽孢杆菌产生的表面活性素,短小芽孢杆菌产生的表面活性剂(Pumilacidin),地衣芽孢杆菌产生的地衣芽孢杆菌素(lichenysin)。由于表面活性素7个氨基酸残基的变异性较大,表现出很强的多样性。
伊枯草素家簇结构的共同特点是由7个氨基酸残基的多肽链与含有14~17β-氨基脂肪酸链相连形成的化合物。伊枯草素也具有较强的溶血活性,主要是通过影响真菌细胞膜的表面张力,导致微孔的形成、促使电解质及其他重要离子的渗漏而表现出强的抗真菌活性。然而,伊枯草素对细菌和病毒的抑制活性较弱。伊枯草素家簇由枯草芽孢杆菌及其近源菌种合成分泌,主要包括9个异构体IturinA、C、D、E、Bacillomycin D、F、L、Lc和Mycosubtilin。
泛革素家簇结构的共同特点是由10个氨基酸残基的多肽链通过酯键与含有14~18个β-羟基饱和或非饱和的脂肪酸交联形成内酯环。泛革素的溶血作用没有表面活性素和伊枯草素强烈,但表现出强烈的抗真菌活性和弱的抗细菌和病毒活性。泛革素也主要是由枯草芽孢杆菌及其相近菌种合成分泌,主要包括4中异构体Fengycin A、B和Plipastatin A、B。
脂肽类化合物合成酶系NRPSs是目前所发现的最大的酶系之一,由多个模块(Module)按一定的空间顺序排列而成,一个典型的模块大约有1000个氨基酸组成,主要负责一次底物缩合反应,负责将一个氨基酸整合到延伸的肽骨架上。每个模块一般都含有氨基酸腺苷酰化(amino acid adenylation domain,A)、肽酰载体蛋白(peptidyl carrier protein doamin,PCP)、和缩合(condensation domain,C)三个基本结构域。上述基本结构域将氨基酸整合 到肽骨架的具体过程是:1)A结构域从底物池中选择结合特定的氨基酸,在ATP的作用下将底物活化;2)活化的底物,氨酰-AMP与PCP结构域上的辅因子磷酸泛酰巯基乙胺(4′-phosphopantetheine,Ppant)的巯基结合,形成氨酰-S-载体复合物;3)分别携带有氨酰基和肽酰基的载体与C结构域上的特定区域结合,形成新肽键,产生延长了一个氨基酸的新的肽键-S-载体复合物和游离的载体。在上述基本结构域的基础上,有些模块还存在一些修饰结构域,通常与基本结构域毗邻,对氨基酸残基进行进一步修饰。如,差向异构化结构域(Epimerization,E)催化L-型的氨基酸转化为D-型氨基酸,甲基转移酶结构域(methyltransferase domain,M)。在合成酶系NRPSs的最后一个模块包含一个硫酯酶结构域(Thioesterase domain,TE),该结构域负责脂肽类化合物的环化和从复合酶上的释放。脂肽类的化合物的肽序列和催化模块的排列之间存在线性关系,即模块的数量、种类和排列的空间顺序决定了相应脂肽类化合物肽序列的氨基酸残个数、种类和顺序。这种具有共线性结构域的NRPSs成为线性NRPSs(A型)。目前也发现一些偏离经典的共线性结构体系的NRPSs,如重复性NRPSs(B型)和非线性NRPSs(C型)。
上述脂肽类化合物大多数在几十年前就被分离、鉴定和申请了专利。随着基因工程技术兴起,这些脂肽类化合物的合成基因簇也被陆续克隆报道和申请了专利。在伊枯草素家簇,1952年美国科学家申请了Mycosubtilin的专利,专利号为2602767;2001年日本科学家申请了Iturin A基因簇的专利,专利号为P2001-231561A;2004年德国科学家申请了Bacillomycin D基因簇的专利,专利号为WO/2004/111240A2;在2010年本研究团队也首次克隆报道了脂肽类抗生素Bacillomycin L的结构基因簇。目前发现报道的脂肽类化合物的NRPSs都是共线性关系,未见重复性和非线性关系的报道。
脂肽类化合物的一个重要特点是由脂肪酸和肽组成的杂合抗生素,催化脂肪酸和肽连接的酶叫做聚酮合成酶(polyketide synthases,PKSs)。尽管不同来源的PKSs都具有比较高的同源性,但不同的PKSs作用的底物都有较强的底物专一性,底物结构的变化会给这些PKSs催化的活性造成很大影响。脂肽类化合物的另一个重要特点是其肽段含有非蛋白质性质的氨基酸。这些非蛋白质性质氨基酸是经过与腺苷酰化结构域和毗邻的后修饰结构域,包括:差向异构、羟基化、羧基化和环氧化等结构域催化得来。大多数情况下这些后修饰步骤导致产生药效团特性。对于聚酮合成酶、腺苷酰化结构域和后修饰结构域对于底物的选择性也使其成为组合生物合成的引用注目的工具。
一直以来,提高菌株次生抗菌代谢化合物是工业生产抗菌化合物致力解决的优先问题。然而传统的通过改善发酵条件,或者通过化学诱变筛选产量提高的抗菌化合物产生菌株越来越受到限制,并且很容易达到饱和。脂肽类化合物的生产和应用也面临着同样的问题。随着 生物技术的发展特别是基因工程的飞速发展,提供了通过改造抗菌化合物产生菌株中相关基因而大幅度提高抗菌化合物产量的途径。这其中增加正调控基因拷贝数或打断负调控基因是最重要的途径之一。
发明内容:
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供一种新环脂肽抗生素罗克霉素生物合成基因簇。本发明提供了罗克霉素生物合成相关的所有基因和蛋白信息,为生物合成罗克霉素和遗传改造提供了基础;本发明的罗克霉素生物合成基因簇及其蛋白可以广泛用于农业、工业和医药领域。
本发明通过以下的技术方案实现的:
本发明涉及一种由枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis916产生的具有广谱抗菌活性,特别是抗病毒活性的环脂肽抗生素-罗克霉素(locillomycin)的生物合成基因簇,其序列如SEQID NO:1所示。
所述罗克霉素生物合成基因簇包含10个基因:
结构基因4个:LocD、LocA、LocB和LocC;其中:
所述基因LocD,位于SEQ ID NO:1的第7565~11446位,
所述基因LocA,位于SEQ ID NO:1的第11667~18644位,
所述基因LocB,位于SEQ ID NO:1的第18726~30332位,
所述基因LocC,位于SEQ ID NO:1的第30402~36782位;
转运基因4个:orf1、orf5、orf6和orf7;其中:
所述基因orf1,位于SEQ ID NO:1的第5675~6550位,
所述基因orf5,位于SEQ ID NO:1的第39787~40551位,
所述基因orf6,位于SEQ ID NO:1的第40538~42446位,
所述基因orf7,位于SEQ ID NO:1的第42518~45550位;
调节基因2个:orf3和orf4;其中:
所述基因orf3,位于SEQ ID NO:1的第36883~37566位,
所述基因orf4,位于SEQ ID NO:1的第37563~38585位。
所述4个结构基因编码的蛋白具体为:
所述基因LocD编码的蛋白序列如SEQ ID NO:4所示,该蛋白为含有聚酮化合物合成酶模块的多功能复合酶,命名为罗克霉素合成酶D;
所述基因LocA编码的蛋白序列如SEQ ID NO:5所示,该蛋白为含有肽链延伸模块的多功能复合酶,命名为罗克霉素合成酶A;
所述基因LocB编码的蛋白序列如SEQ ID NO:6所示,该蛋白为该蛋白为含有肽链延伸模块的多功能复合酶,命名为罗克霉素合成酶B;
所述基因LocC编码的蛋白序列如SEQ ID NO:7所示,该蛋白为该蛋白为含有肽链延伸模块和肽链环化模块的多功能复合酶,命名为罗克霉素合成酶C;
所述4个转运基因编码的蛋白具体为:
所述基因orf1编码的蛋白序列如SEQ ID NO:3所示,该蛋白为含有ATP结合结构域的ABC转运蛋白,命名为potA;
所述基因orf5编码的蛋白序列如SEQ ID NO:10所示,该蛋白为含有ATP结合结构域的ABC转运蛋白,命名为potB;
所述基因orf6编码的蛋白序列如SEQ ID NO:11所示,该蛋白为含有ATP结合结构域的ABC转运蛋白,命名为potC;
所述基因orf7编码的蛋白序列如SEQ ID NO:12所示,该蛋白为多种药物转运蛋白AcrB,命名为potD。
所述2个调节基因编码的蛋白具体为:
所述基因orf3编码的蛋白序列如SEQ ID NO:8所示,该蛋白为该蛋白为参与二组分调控系统的组氨酸激酶,命名为RGP1;
所述基因orf4编码的蛋白序列如SEQID NO:9所示,该蛋白为感应组氨酸激酶的调控蛋白,命名为RGP2。
与现有技术相比,本发明具有如下的有益效果:利用本发明的基因簇可以实现以下目的:
包含本发明的所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆DNA可用于从芽胞杆菌(Bacillus subtilis916)基因组文库中定位更多的文库质粒。这些文库质粒至少包含本发明中的部分序列,也包含基因组中以前临近区域未克隆的DNA。
本发明所提供的核苷酸序列可以被修饰或突变。这些途径包括插入或置换,聚合酶链式反应,错误介导聚合酶链式反应,位点特异性突变,不同序列的重新连接,序列的不同部分或其它来源的同源序列进行直接进化(DNA shuffling),或通过紫外线或化学试剂。
本发明的序列或至少部分序列可以通过合适的表达系统在外源宿主中表达以得到修饰的脂肽类化合物基因簇或更高的生物活性或更高的产量。这些外源宿主包括芽胞杆菌、大肠杆菌、酵母、链霉菌、植物和动物等。
包含本发明所提供的氨基酸序列或至少部分序列可以用来分离所需要的蛋白质并可用于抗体的制备。包含本发明所提供的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至新的生物活性,或者提高产量或优化了蛋白动力学特征或其它致力于得到的性质。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在异源宿主中表达并通过DNA芯片技术了解它们在宿主代谢链中的功能。
包含本发明所提供的核苷酸序列编码的蛋白可以催化脂肪酸和苏氨酸的连接,进一步通过非线性的NRPSs途径催化合成含有9个氨基酸残基的新型环九肽脂肽类抗生素-罗克霉素,是一种新颖的合成脂肽类化合物的机制。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通过遗传重组来构建质粒以获得新型生物途径,也可以通过插入、置换、缺失或失活进而获得新型生物合成途径。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因或DNA片段可以通过中断罗克霉素生物合成的一个或几个步骤而得到新的罗克霉素结构类似物或前体。
包含本发明的核苷酸序列或知道部分核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以用来提高罗克霉素或其衍生物的产量,例如增加正调控基因的拷贝数或增强其表达以及负调控基因的敲除等。本发明提供了在基因工程微生物中提高产量的途径。
总之,本发明提供了新型环脂肽抗生素合成相关的所有基因和蛋白信息,为生物合成罗克霉素和遗传改造提供了基础;本发明的罗克霉素合成基因簇及其蛋白可广泛用于农业、工业和医药领域。
附图说明:
图1罗克霉素的化学结构;
图2罗克霉素生物合成基因簇的基因组成;
图3与罗克霉素生物合成相关的基因同框缺失突变株southern杂交验证
图4与罗克霉素生物合成相关的基因同框缺失突变株发酵液的高效液相色谱(HPLC)分析;
图5与罗克霉素生物合成相关的基因同框缺失突变株发酵液的质谱(MS)分析;
图6罗克霉素合成关键酶基因的氨基酸腺苷酰化结构域异源表达;
图7腺苷酰化结构域重组表达产物的催化活性;
图8推导的罗克霉素生物合成途径示意图。
具体实施方式
以下结合图1~8对本发明做进一步详细说明。
1.罗克霉素生物合成基因簇的克隆、序列分析及功能分析:
罗克霉素(Locillomycin)是本团队鉴定的一种新型的环脂肽类抗生素,具有广谱抗菌活性,特别是抗病毒活性,专利申请号为201310416487.7(图1)。为鉴定到罗克霉素的合成基因簇,本团队在前期Bacillus subtilis916全基因组框架测序的基础上,预测到罗克霉素合成的部分基因簇,估计其中缺失约9kb的核酸序列。通过同源交换同框敲除失活预测基因簇中的locD基因,得到的突变体无法再产生罗克霉素,证实了预测的基因簇与罗克霉素生物合成相关。为了获得罗克霉素合成基因簇的全长序列,构建了Bacillus subtilis916基因组文库;采用PCR的方法从基因组文库筛选到所需要的柯斯质粒,并测序获得合成罗克霉素的完成基因簇序列。生物信息学分析了46783bp的染色体区域,包含14个开放读码框,并和模式菌株Bacillus subtilis168、Bacillus amyloliquefaciens FZB42进行了比较(图2)。开放阅读框详细的分析结果列于表1。
表1罗克霉素(locillomycin)的生物合成基因簇中各基因及编码蛋白的功能分析
2.罗克霉素结构基因编码多功能复合酶功能结构域的预测
采用美国国家生物信息中心的Conserved Domain Database search及其提供世界范围的Blast引擎。获得的核苷酸序列编码的氨基酸序列通过与已经得到充分了解的一些脂肽类化合物合成酶的氨基酸序列进行比较从而推测这些多肽的功能特征(图2)。结构基因中一些关 键功能结构域的预测结果列于表2~表5。
生物材料保存信息:
保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)
保藏地址:北京市海淀区中关村北一条13号,中国微生物研究所
保藏日期:2002年9月30日
保藏编号:CGMCC No.0808
分离命名:枯草芽胞杆菌916(Bacillus subtilis916)
键功能结构域的预测结果列于表2~表5。
表2:LocD
结构域 | 在LocD(序列3)中氨基酸位置 |
ACS | 72-557 |
PCP1 | 594--657 |
ACP | 679-1,099 |
LocA编码Locillomycin合成延伸模块1,包含10个结构域,分别为PCP2、缩合结构域1(Condensation domain1,C1)、HXXPF重复结构域1(HXXPF-repeated domain1,H1)、氨基酸腺苷酰化结构域1(Amino acid adenylation domain1,A1)、PCP3、C2、H2、PCP4、C3、H3。延伸模块1中的结构域在LocA中的位置表3所示:
表3:LocA
结构域 | 在LocA(序列4)中氨基酸位置 |
PCP2 | 11-65 |
C1 | 152-437 |
H1 | 471-534 |
P3 | 763--809 |
C2 | 831-1,123 |
H2 | 1,144-1,233 |
A1 | 1,308-1,561 |
PCP4 | 1,771-1,861 |
C3 | 1,873-2,161 |
H3 | 2,182-2,273 |
LocB编码Locillomycin合成延伸模块2,包含13个结构域,分别为A2、PCP5、C4、TIGR01720结构域、C5、A3、PCP6、C5、H4、A4、PCP7、C6、H5。其中TIGR01720结构域是一种功能未知的后修饰结构域。延伸模块2中的结构域在LocB中的位置如表4所示:
表4LocB:
结构域 | 在LocB(序列5)中氨基酸位置 |
A2 | 308--699 |
PCP5 | 784--847 |
C4 | 859-1164 |
[0075]
TIGR01720 | 1,167-1,317 |
C5 | 1,329-1,632 |
A3 | 1,818-2,220 |
PCP6 | 2,305-2,369 |
C5 | 2,385-2,672 |
H4 | 2,693-2,784 |
A4 | 2,859-3,253 |
PCP7 | 3,338-3,402 |
C6 | 3,418-3,706 |
H5 | 3,727-3,818 |
LocC编码Locillomycin合成延伸模块3和终止模块,包含7个结构域,分别为A5、PCP7、C7、H5、A6、PCP8和硫酯酶结构域(Thioesterase domain,TE)。延伸模块3和终止模块中结构域在LocC中的位置如表5所示:
表5LocC:
结构域 | 在LocC(序列6)中氨基酸位置 |
A5 | 298--694 |
PCP7 | 777-841 |
C7 | 857-1,144 |
H5 | 1,165-1,256 |
A6 | 1,331-1,726 |
PCP8 | 1,811-1,875 |
TE | 1,898-2,106 |
3.罗克霉素的生物合成基因簇边界的确定
突变株QDD(破坏locD)和突变株QDC(破坏LocC)丧失了产生罗克霉素的合成能力,证明LocD和LocC是必须基因(图3,图4,图5)。对LocD上游基因orf1和LocC下游基因orf3进行敲除,分别获得突变株QF1和QF3,生物测定明突变株QF1和QF3仍然能够产生罗克霉素。据此,罗克霉素生物合成基因簇确定在orf1和orf3之间,含有四个开放阅读框架,分别编码LocD、LocA、LocB和LocC四种多功能复合酶。
4.罗克霉素氨基酸腺苷酰化结构域氨基酸选择性位点预测、重组表达和催化功能
在采用美国国家生物信息中心的Conserved Domain Database search及其提供世界范围 的Blast引擎预测到6个氨基酸腺苷酰化结构域的基础上,进一步采用网上(http://nrps.informatic.uni-tuebingen.de)在线软件NRPSprdictor2预测氨基酸腺苷酰化结构域的特异性选择位点,预测特异性激活氨基酸。采用大肠杆菌重组表达体系,将6个氨基酸腺苷酰化结构域在大肠杆菌DE3菌株中成功实现了异源表达和纯化(图6)。纯化的重组表达产物的催化功能进行了测定,确定了每个氨基酸腺苷酰化结构域催化的氨基酸底物(图7)。氨基酸腺苷酰化结构域的特异性选择位点,特异性激活氨基酸的预测及生物化学实验确定,如表6所示。
表6:氨基酸腺苷酰化结构域底物选择性预测和实验证明
5.罗克霉素的生物合成途径
根据体外酶活性实验、体内突变实验和生物学分析整个基因簇的功能,推导罗克霉素的生物合成途径,总结如图8所示。
以下进一步提供实施实例,这些实例有助于理解本发明,仅用作说明而不限制本发明的应用范围。下列实施例中未标明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等分子克隆:实验手册(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989),或按照制造厂商所建议的条件。
<实施例1>罗克霉素产生菌Bacillus subitilis916总DNA的提取
接种枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis916至50ml LB液体培养基,37℃、200r/min条件下振荡过夜培养;培养液5000r/min,离心10分,空干培养基;菌体浮于40ml TE缓冲液中,加入溶菌酶浓度至100ug/ml,37℃温育20min;然后加RNAase(1mg/ml)100ul,10%SDS5ml,37℃度,保温30min;再加蛋白酶K至终浓度50ug/ml,37度℃保温75min,若粘稠,继续;再分别用酚,酚氯仿(1:1),氯仿抽提2次;最后加入1/5醋酸钠(3M),2.5倍已醇,沉淀60min,轻晃管子,用细玻璃棒挑出DNA丝,70%已醇洗,真空干燥,即为提取的总DNA。
<实施例2>罗克霉素产生菌Bacillus subitilis916基因组文库的构建
将提取的Bacillus subtilis916总DNA用Sau3A I部分酶解,用1%低熔点琼脂糖凝胶,在装有0.5被TBE电泳缓冲液的脉冲场电泳(Pulse Field Gel Electrophoresis,PEGE,Bio-Rad)中分离。回收约40kb大小的DNA片段,然后用碱性磷酸酶处理使末端去磷酸化,供载体的连接及包装转染用。将处理好的基因组DNA和柯斯质粒载体按照1:1的分子数比例用T4DNA连接酶(NEB)连接。将在冰上溶解的噬菌体包装蛋白(MaxPlaxLambda Packing Extracts,EPICENTER Biotechnologies公司)加入连接产物中,混匀,避免产生汽包,短暂离心,在30℃中温育90min后加入另一份包装蛋白,继续温育90min后加入噬菌体稀释缓冲液(Phage Dilution Buffer,100mM NaCl,10mM MgCl,10mM Tris-HCl pH8.3)至1ml,加入25μl氯仿,4℃保存。将大肠杆菌EPI3000培养至OD600=0.8~1.0作为感受态菌,将包装产物与感受态菌混合,37℃温育20分钟后涂含阿拉伯抗生素的LB平板。37℃培养过夜。挑取单克隆至含抗生素的LB培养基96孔板中继续培养18小时,加入灭菌的甘油至终浓度20%,-70℃保存。随机从平板中挑取10个克隆,采用碱法小量制备的方法抽提重组黏粒,酶切后凝胶电泳的结果表明每个黏粒插入的片段约为40kb左右。对于枯草芽胞杆菌而言,其基因组大小约为4Mb,我们建立的文库效价超过为5000pfu/μgDNA,插入片段约为40kb左右,足以代表Bacillus subtilis916整个基因组,这表明建立的文库具有良好的质量,能满足文库筛选的需要。根据罗克霉素已经知道的部分序列设计引物,采用PCR的方法从基因组文库中筛选所需要的柯斯质粒。
<实施例3>基因破坏突变株的获得
采用同源双交换的方法破坏罗克霉素合成基因簇相关开发阅读框,获得相应基因破坏突变株。同源双交换质粒载体构建。根据罗克霉素不同开放阅读框的核酸序列,设计引物从Bacillus subtilis916基因组DNA中分别扩增到上游同源片段和下游同源片段(约750bp),扩增的上下游同源片段两两插入到pUC19构建系列备用重组质粒载体。备用重组质粒载体再插入来源于pBEST501质粒的硫酸新霉素抗性基因构建系列同源双交换质粒载体。构建好的同源重组质粒载体经过化学转化的方法导入到Bacillus subtilis916中得到双交换突变体,所得突变体通过PCR和southern杂交在基因型上加以证明。化学转化方法如下:(1)试剂配制:Sp-A(0.4g硫酸氨,0.2g磷酸二氢钾,3.66g三水磷酸氢二钾,加水至100ml),Sp-B(0.04g硫酸镁,加水至100ml),CAYE(0.1g Casamino acid,0.5g酵母提取物,加水至5ml),Spl(Sp-A和Sp-B各98ml,2ml50%葡萄糖,2ml CAYE),Sp2(58.8ml Spl,0.6ml50mM Cacl2,0.6ml250mMMgCl2);(2)转化步骤:挑B-916单菌落接种至2.5ml Spl培养基,30℃、180rpm振荡培养过夜;然后以1:25体积接种到新鲜的Spl培养基,30℃、250rpm振荡培养OD600至2.0,约3.5 小时;然后以1:10体积接种到Sp2培养基,37℃、150rpm振荡培养1.5小时后,以5000rpm离心收集;菌体以上清液1/10体积进行悬浮即用作感受态细胞;在250μl感受态细胞中加入终浓度为1mmol/L EGTA,37℃,150rpm/min振荡培养;10min后加入1μg DNA,37℃,150rpm振荡培养1h,再以37℃,250rpm继续振荡培养30min;最后涂布在含相应抗生素LB平板上。
<实施例4>罗克霉素产生菌Bacillus subitilis916和基因中断突变株的发酵、产物分离纯化与鉴定
首先是将生长于LB(10%胰蛋白胨,5%酵母粉,5%氯化钠)斜面的枯草芽胞杆菌Bs916接种于含有5mL LB液体的试管培养基,37℃、200r/min条件下振荡24h;然后将培养液转接到333ml/L的摇瓶,在28℃、180r/min条件下振荡培养72h,收获发酵液。所得发酵液离心除去菌体,用浓盐酸调至pH2.8沉淀过夜。8000g离心25min得到沉淀,沉淀采用甲醇抽提,抽提物经0.22μmol·L-1微孔滤膜后,获得罗克霉素粗提物。罗克霉素粗提物采用去离子水稀释为含30%甲醇水溶液,pH值调至7.0,然后上样于NH2固相萃取柱,分别用含50%甲醇水溶液,100%甲醇,含0.5%甲酸甲醇溶液,1%甲酸甲醇溶液,2%甲酸甲醇溶液梯度洗脱,在2%甲酸甲醇洗脱溶液中含有罗克霉素。2%甲酸甲醇洗脱溶液的pH值调至7.0,氮气吹干浓缩后用去离子水稀释为30%甲醇水溶液,在真空干燥,获得罗克霉素的部分纯化物。提取的罗克霉素高效液相色谱的检测条件为:采用C18(5μm;250by4.6mm;VYDAC218TP;VYDAC,Hesperia,CA)柱;流动相为乙腈:水:三氟乙酸(50:50:0.5vol/vol);流速为0.5mL·min-1;紫外检测波长为230nm。采用电喷雾质谱仪(美国安捷伦6410液湘色谱-质谱联用仪)检测罗克霉素相对分子质量。将制备罗克霉素提取物采用含有饱和α-氰基-4-羟基桂皮酸,0.1%三氟乙酸,乙腈和水(体积比3:1)溶液稀释1000倍后,通过注射器直接进样。利用ESI/MS测定化合物的分子量,电喷雾条件为:毛细管电压32V、喷雾电压20KV、毛细管温度320℃,检测方式:正离子。
<实施例5>氨基酸腺苷酰化功能结构域的异源表达和纯化
本实施例均以pET28a+(Novagen公司)为表达载体,将待表达的氨基酸腺苷酰化功能结构域的核酸序列用高保真的pfu酶和带有限制性酶切位点的引物扩增出,酶切后连接至相应酶切处理的表达载体上,构建融合表达质粒,并转化至大肠杆菌JM109中,测序正确后,将质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)。将含有融合表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)接种到含卡那霉素的LB培养基中37℃培养过夜。然后将0.5ml的种子接种到50ml的含相应抗生素的LB培养基中培养OD600=0.6,将培养温度降至28℃,加入IPTG至终浓度1mM,继续培养6小时。 培养液在12000r/min离心5min收集菌体,然后重悬于25ml裂解缓冲液(20mM磷酸钠,0.5M NaCl,pH7.4),反复冻融两次,放置冰浴中用超声波继续破碎细胞,然后在4℃,16000r/min,离心1h。对重组表达蛋白去上清郭镍金属螯合小柱(HisTrap HP column,GEHealthcare公司)纯化,用SDS-PAGE电泳鉴定。纯化后的蛋白用脱盐柱(HisTrap Desalting column,GEHealthcare公司)进行缓冲液置换,置换为25mM的Tris-HCl(pH7.4)的缓冲液。蛋白定量采用Bradford方法(Bradford Protein Assay Kit,Bio-Rad公司)。
<实施例6>纯化的重组表达产物的催化功能
腺苷酰化功能域是非核糖体肽合成酶中每个模块都必须含有的3个功能域之一,催化氨酰腺苷酸(aminoacyl adenylate)中间体的生成,伴随焦磷酸的生成,通过检测反应体系中焦磷酸的生成,检测腺苷酰化功能域对不同氨基酸的催化活性。焦磷酸用EnzChek Pyrophosphate Assay Ki t检测,其反应原理为,首先焦磷酸被IP(inorganic pyrophosphatase)催化生成磷酸;然后在PNP(purine nucleoside phosphorylase)的催化下,磷酸与底物MesG(guanosine analogue)--起反应,生成生色产物,此时反应体系的最大吸收波长从325-330am变为355~360nm。参照焦磷酸检测试剂盒的使用说明,设计反应体系如下(200μl体系):4mmol/L ATP,4mmol/L2,3.不同氨基酸(4mmol/L),2μmol/L氨基酸腺苷酰化功能域,0.4mmol/L MesG,0.2U PNP,0.2U IP,10mmol/L MgCl2,10μL20xBuffer,30℃反应30min,然后通过紫外分光光度计进行全波段扫描。
Claims (3)
1.一种具有广谱抗菌,特别是抗病毒活性的环脂肽抗生素-罗克霉素的生物合成基因,其特征在于,所述的基因选自下组:
1)LocD基因:
LocD的核酸序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列第7565-11446个碱基,长度为3882个碱基,编码1293个氨基酸的蛋白,其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示;
2)LocA基因
LocA的核酸序列为SEQ NO:1所示的核苷酸序列第11667-18644个碱基,长度为6978个碱基,编码2325个氨基酸的蛋白,其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示;
3)LocB基因
LocB的核酸序列为SEQ NO:1所示的核苷酸序列第18726-30332个碱基,长度为11607个碱基,编码3868个氨基酸的蛋白,其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示;
4)LocC基因:
LocC的核酸序列为SEQ NO:1所示的核苷酸序列第30402-36782个碱基,长度为6381个碱基,编码2126个氨基酸的蛋白,其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
2.如权利要求1所述的具有广谱抗菌,特别是抗病毒活性的环脂肽抗生素-罗克霉素的生物合成基因所编码的蛋白,其特征在于,所述的蛋白选自下组:
1)LocD基因编码的蛋白,其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示;
2)LocA基因编码的蛋白,其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示;
3)LocB基因编码的蛋白,其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示;和
4)LocC基因编码的蛋白,其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
3.根据权利要求2所述的环脂肽罗克霉素的生物合成基因所编码的蛋白的用途,其特征在于,所述的蛋白是LocD基因、LocA基因、LocB基因和LocC基因编码的蛋白,罗克霉素合成基因簇及编码蛋白所含功能结构域详细描述如下:
1)LocD基因编码的蛋白含有乙酰CoA连接酶结构域(acyl-CoA ligase domain,ACS),乙酰载体蛋白结构域(acyl carrier protein domain,PCP),和β酮乙酰合成酶结构域(β-keto acyl synthetase domain,KAS)
2)LocA基因编码的蛋白含有一个氨基酸残基延伸模块,由3个PCP结构域,3个缩合结构域(condensation domain,C);1个腺苷酰化结构域(adenylation domain,A)组成;
3)LocB基因编码的蛋白含有3个氨基酸残基延伸模块,由3个PCP结构域,3个C结构域和3个A结构域组成;
4)LocC基因编码的蛋白含有2个氨基酸残基延伸模块和一个脂肽环化释放模块,由2个PCP结构域,1个C结构域,2个A结构域和1个硫脂酶结构域(Thioesterase domain,TE)组成;
它们用于催化合成罗克霉素以下反应:激活脂肪酸,脂肪酸连接至苏氨酸残基,然后选择性的将不同的氨基酸残基整合到脂肽链骨架,该过程中LocB基因编码的蛋白被重复使用,形成一条含有脂肪酸和9个氨基酸残基组成的肽链,最终肽链首尾相连环化形成成熟的脂肽抗生素罗克霉素。
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CN114806986B (zh) * | 2022-03-29 | 2023-11-14 | 淮阴工学院 | 高产罗克霉素的基因工程菌及其构建方法和应用 |
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- 2013-11-21 CN CN201310586700.9A patent/CN104651380A/zh active Pending
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