CN110591996A - 一种高产l-赖氨酸枯草芽孢杆工程菌的构建方法及应用 - Google Patents

一种高产l-赖氨酸枯草芽孢杆工程菌的构建方法及应用 Download PDF

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夏树立
韩静
冯婧
张蕾
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Abstract

本发明公开了一种高产L‑赖氨酸枯草芽孢杆工程菌的构建方法及应用。根据GenBank辣椒CDS序列设计引物，以辣椒cDNA为模板，PCR克隆辣椒高赖氨酸基因CFLR，并将其插入穿梭表达载体pHT43，构建质粒pHT43‑CFLR。然后将含有启动子和终止子表达框Pgac‑CFLR‑rrnBT1T2插入到新构建的pK18mobsacB‑ΔALA中获得目的重组质粒pK18mobsacB‑ΔALA::CFLR。再将重组性质粒pK18mobsacB‑ΔALA::CFLR转化到枯草芽孢杆菌中,经过细胞内同源交换和培养基筛选，获得不带质粒抗性标记的高产L‑赖氨酸枯草芽孢杆菌株CMCC（B）63501/pK18mobsacB‑ΔALA::CFLR。结果表明，重组菌株L‑赖氨酸含量比野生菌株提高了34.89%，具有良好的应用潜力。

Description

一种高产L-赖氨酸枯草芽孢杆工程菌的构建方法及应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体说涉及一种高产L-赖氨酸枯草芽孢杆工程菌及构建方法。
背景技术
L-赖氨酸为人和动物所必需的、但自身不能合成的八种必需氨基酸之一，广泛运用于食品强化剂、医药产品和饲料添加剂等方面，其中90%以上的L-赖氨酸用作饲料添加剂。L-赖氨酸对平衡氨基酸组成、提高机体对谷类蛋白质的吸收、调节体内代谢平衡、改善动物营养及促进机体生长发育均有重要作用。目前，我国己成为世界第二大饲料生产国，对L-赖氨酸等添加剂需求量在逐年增加。另外，氨基酸饮料的开发及饮用流行和多种氨基酸保健品在市场崭露头角，都刺激着L-赖氨酸生产。因此，选育出高产L-赖氨酸菌株，提高L-赖氨酸糖酸转化率和降低生产成本具有非常重要的意义和应用前景。
目前，工业上用于生产L-赖氨酸的菌株大多数是通过物理诱变或化学诱变获得的营养缺陷型或解除调控作用的突变株。然而，与野生型菌株相比较，这些菌株存在很大的缺陷，如生长速度缓慢、糖耗速率低、对外界不良环境耐受力差等。随着生物技术的发展及枯草芽孢杆菌基因组的解析，传统诱变育种获得L-赖氨酸高产菌方法逐渐被代谢工程育种方法所取代。同时，大量研究表明，通过基因工程技术获得的基因工程菌，除保留了野生型菌株的一些优点外，还能很大程度上提高L-赖氨酸产量。因此利用代谢工程方法选育L-赖氨酸高产菌是本课题研究的主要方向。此外，由于我国用于生产L-赖氨酸菌株大多为大肠杆菌基因工程菌株，由于带有抗生素标记，菌体培养过程中需添加抗生素来维持菌体产酸的稳定性。并且，生产菌株为大肠杆菌，而2013年饲料添加剂目录明文规定饲料L-赖氨酸（纯度为65%和70%，含有大量的菌体）中不得含有大肠杆菌，因此应用大肠杆菌基因工程菌株存在巨大安全隐患，也导致在国内、国际市场上缺乏竞争力，从而制约了生产规模的扩大。枯草芽孢杆菌是食品安全性菌株，被广泛运用于氨基酸如L-赖氨酸和L-谷氨酸的生产。因此，本课题着眼于通过代谢工程育种方法对枯草芽孢杆菌代谢途径进行遗传改造，替代大肠杆菌作为L-赖氨酸生产菌，同时寻找一个合适的方法使得外源基因稳定插入到枯草芽孢杆菌基因组中，从而在发酵过程不添加抗生素，实现利用基因工程菌发酵生产L-赖氨酸。
本项课题目标是通过利用代谢工程育种方法选育高产L-赖氨酸枯草芽孢杆菌菌株，获得拥有自主知识产权的L-赖氨酸高产菌和发酵工艺优化，实现枯草芽孢杆菌菌株中L-赖氨酸增产30%以上。
发明内容
本发明的一个目的是克服现有技术的不足，提供一种产量大，低成本的L-赖氨酸枯草芽孢杆工程菌。
本发明的第二个目的是提供一种产L-赖氨酸枯草芽孢杆工程菌的构建方法。
本发明的第三个目的是提供一种将外源基因稳定插入到枯草芽孢杆菌基因组中，从而在发酵过程不添加抗生素，实现利用基因工程菌发酵生产L-赖氨酸。
为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：
一种高产L-赖氨酸枯草芽孢杆工程菌，其特征在于所述基因工程菌为不带质粒抗性标记的高产L-赖氨酸枯草芽孢杆菌株CMCC（B）63501/pK18mobsacB-ΔALA ::CFLR。
本发明进一步公开了高产L-赖氨酸枯草芽孢杆工程菌的构建方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）辣椒高赖氨酸基因（CFLR）的克隆以及穿梭表达载体pHT43的构建
按照GenBank中辣椒高赖氨酸基因CFLR cDNA序列设计引物，用Trizol提取辣椒花药中的RNA，并利用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，以该cDNA为模板，应用PCR克隆CFLRCDS序列；所述CFLRCDS序列如SEQ ID NO:1所示；
1 CTTTGAATCC AAATCAAAGG AAAACAGAAA ATATCAACAT CCCTTTTCCT CTATTCCTCC
61 AATTCTTTAT AACAACAATA AAAG ATGGGT TGTGGGGAAT CAAAGCACGC AGTTGCAACG
121 GAAAAAGCCA CCGTTCCAAA GAACAAGAGA TCATTGAGTT CTAAATCCAA TGGAGAAACT
181 CAAATTTCTC AAGAAAGTGT CAAGAAAAAT ACAGAAAATG GAGAATCTGG GGTTGCAGAA
241 ACGGCGAAAA CAAGTGATGA GAAAGTAGAG GTTAAAGCCA AGGTGGATGA GGCAACTGCA
301 CCCAAAGTGG TGGCTGTAGA AAAAGAAAAA GCTAAAGAAA AGTCTGAGAA GAAAGAAATG
361 GTGGGAACAA CAGAGGAGGT TTTTGCTGAA AAGAAGGAAG AAAAAGTTGT GGAATCTCAA
421 CCTGGAGAGA AGAAGAATTC AAATGATGAA ACAACTCCAG CTGTTGCTGC TGTAGATAAG
481 ACAGAATCAG TTGAAGAGAT TAATGTGCAA GACAAAGCTG AGGAGACCAT TAAGCCAATC
541 GAAGAAGAGA AAAAGAAGGA AGAAGTTACC GCTGTTACTG AGGCCACAGA TGCTGCTAAA
601 TCAGAAAGTG CCAAGGATGC TGATAAACCA GAAAGTGCCA AGGATGTTGA TAAAATAGAA
661 ACTGTCAAGG ATGCTAATAA GCCAGAGACA GAGGAAAAGC CAAATGAGAA GAAAGCAACT
721 GAGACATCAA CAACAACAGA TTTGAAAACA GATTAAACTG CAGGCATGGA CACAGGGAAG
781 AGGGCTATTT ATTAGTTTAA TCCTTGCTTT TTTAAAGCTT GTTATAATTT CCAGCTTTAA
841 GTAAACATAT TTGTTCGATC TGTACTCGGA TGGCTGCTAT ACTACTCTGT TCTGCCAAAA
901 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA
（2）含高L-氨基酸目的基因CFLR的可活动性质粒pK18mobsacB-ΔALA::CFLR的构建：
通过PCR克隆枯草芽孢杆菌基因ALA的左右边界序列alaT-L和alaT-R，并进一步得到alaT片段，之后用T4连接酶构建双交换同源重组质粒pK18mobsacB-ΔALA；然后将含有启动子和终止子的CFLR基因表达框Pgac-CFLR-rrnBT1T2通过酶切位点Sma I插入到pK18mobsacB-ΔALA中获得目的重组质粒pK18mobsacB-ΔALA::CFLR；
（3）不带抗性标记高产L-赖氨酸枯草芽孢杆菌株的构建
将重组可活动性质粒pK18mobsacB-ΔALA::CFLR转化到枯草芽孢杆菌中实现第一轮同源交换，用氨苄霉素和和氯霉素抗性平板筛选发生第一次同源重组的菌株，再挑选氨苄霉素和和氯霉素抗性平板生长单菌落培养后，进行蔗糖敏感型第二次同源重组的菌株筛选，获得不带有抗性标记质粒的重组菌株。CMCC（B）63501/pK18mobsacB-ΔALA::CFLR。
本发明更进一步公开高产L-赖氨酸枯草芽孢杆工程菌的复苏扩繁方法：
（1）复苏种子液制备：
1）、培养基准备：葡萄糖 20 g，牛肉膏1 g，蛋白胨5 g，NaCl 5 g，H2O 1 000 ml，pH自然，高压灭菌锅121℃灭菌20 min。
2）、摇瓶培养基分装于250ml三角瓶，每瓶50ml。从斜面上挑取一环菌种，接入摇瓶种子培养基，37℃，180rpm振荡培养12小时即为种子液。
3）、取种子液分别1ml放入1.5mlEP（20个）离心管中3000rpm，8min，4℃离心，弃上清，将菌株放入-20℃冰箱冷藏保存备用。
（2）菌株扩繁培养
1）培养基制备：葡萄糖 20 g，牛肉膏1 g，蛋白胨5 g，NaCl 5 g，H2O 1 000 ml，pH7.0，高压灭菌锅121℃灭菌20 min；
2）接种，可以采用火焰接种法，在接种口放置酒精圈，点燃后，将菌种通过火焰圈迅速倒入摇瓶内，进行计时培养。 1L培养基放入3-5L的药瓶中；
3）菌株繁殖培养：种子培养好后，将种子接到发酵罐中，接种量5%，36℃—37℃控温通风培养，转速200转/分，培养12-16h；
4）将菌液放入离心管中4℃离心，弃上清，保留沉淀；
（3）菌粉制备
1）向菌渣中加入生理盐水和保护剂，得到混合菌液；混合菌液中加入总质量的80wt%的保护液，其余为菌渣和生理盐水
2）保护剂：总质量中海藻糖10wt%，乳糖10wt%，谷氨酸钠3wt%；
3）保护液：总质量中甘油2wt%、麦芽糖1wt%、L-半胱氨酸2wt%、乳糖2wt%；
3）充分混匀后，先放入-40-80℃中预冻48-96h，然后-冷冻干燥48-72h；
最后制备完成冻干粉。
所述冻干粉的理化特性：
（1）有效地防止了制品理化及生物特性的改变
（2）生物组织和细胞结构和特征的损伤较小，使其快速进入休眠状态，有效保护了许多热敏性药物生物制品有效成份的稳定性
（3）由于干燥在真空条件下进行，对于一些易氧化的物质具有很好的保护作用
（4）制品经过冻干后水份含量非常低，使制品的稳定性提高，受污染的机会减小，这不仅方便了运输还延长了制品保存期限。
本发明更进一步公开了高产L-赖氨酸枯草芽孢杆工程菌在益生菌中高效表达方面的应用。所述的益生菌中高效表达指的是重组菌株L-赖氨酸含量比野生菌株显著提高。实验结果显示野生菌的 Lys 含量是 21.08 μg/mL，重组菌的 Lys 含量是 26.33 μg/mL，结果重组菌 Lys 含量比野生菌提高了 24.89%(n=3)。
本发明主要解决了大肠杆菌突变株在发酵过程中需要添加抗生素和产生一定内毒素，并存在质粒表达不稳定和耐受性差等问题。以及化学合成方法存在生产效率低，生产成本高，不易直接作为饲料添加剂的问题。重点考察了利用基因敲除和替换技术，构建非质粒抗性的稳定表达L-赖氨酸的重组质粒，最终电转进入枯草芽孢杆菌感受态细胞中，获得稳定遗传目的工程菌种。实现在养殖业中作为饲料添加剂直接饲喂，有效降低饲喂成本，提高畜禽生长性能和免疫能力。以及在农业生产中枯草芽孢杆菌重组菌株作为体外发酵工程菌，有效提高L-赖氨酸生产效率和安全性，降低生产成本。
本发明更加详细的描述如下：
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 原料
辣椒花药（采自天津农业科学院实验实习基地）；大肠杆菌（E.coli）均有市售、感受态DH5α均有市售、枯草芽孢杆菌CMCC（B）63501（保藏在国家菌种保藏中心）并由本实验室保存；pMD18-T载体购自宝生物工程（大连）有限公司；穿梭表达载体pHT43和pK18mobsacB购自Axygen公司。
1.1.2试剂
Trizol试剂购自Invitrogen公司；PrimeScript RT-PCR Kit、SYBR ® Premix Ex Taq™Ⅱ（Perfect Real Time)、Ex Taq酶、核酸限制性内切酶EcoRI-HF、PstI-HF、XbaⅠ、CloneExpress II One Step Cloning Kit连接体系购自南京诺维赞公司，DNA Marker购自全式金公司，限制性内切酶购自NEB公司，T4 DNA连接酶、蛋白Marker购自大连宝生物科技有限公司；氨苄青霉素、氯霉素、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）购自上海生工生物工程公司；L-赖氨酸标准品和1-氯-2, 4-二硝基苯（CDNB）购自SIGMA公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自Axygen公司；引物由天津英俊公司合成。其余均为国产或进口分析纯试剂。
1.1.3 培养基
枯草芽孢杆菌、大肠杆菌普通培养基：LB培养基；发酵培养基：可溶淀粉60g/L，豆饼粉30g/L，（NH4）2SO4 5g/L，Na2HPO4·12H2O 5g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，NaCl 0.1g/L，pH7.0。
1.2 方法
1.2.1 辣椒高赖氨酸基因（CFLR）的克隆以及穿梭表达载体pHT43的构建
按照GenBank中辣椒高赖氨酸基因CFLR cDNA（基因登录号：EU367999）序列设计引物，用Trizol提取辣椒花药中的RNA，并利用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，以该cDNA为模板，应用PCR克隆CFLRCDS序列。PCR体系如下：ddH2O 15μL, 2*KOD Fx buffer 25 μL,dNTP5 μL,Cflr-inF 1 μL,Cflr-inR 1 μL,KOD Fx Neo 1 μL,cDNA 2 μL，共50μL。扩增步骤如下：94℃预变性2min；98℃, 10 sec,58℃30 sec, 68℃60sec，该步骤循环36次；68℃延伸2min；16℃保存。同时准备线性化载体pHT43，酶切体系如下：质粒 20 uL（约8ug），缓冲液cutsmart 4 uL，XbaI 2 uL，ddH2O 14 uL，共40 uL，混匀后37℃孵育4h。PCR产物、酶切产物经鉴定和纯化回收后，用无缝克隆技术将CFLR基因连接到酶切后的穿梭表达载体pHT43中，以获得重组表达质粒pHT43-CFLR，连接体系如下：载体 4 uL (约300ng)，PCR纯化产物 4uL (约150ng)，5×CE buffer 4 uL，CE 2 uL，ddH2O 6 uL，共20 uL，混匀后37℃孵育30min，然后迅速冰浴保存。取5uL连接产物转化大肠杆菌DH5α细胞，在含有100μg/mL氨苄青霉素（Amp）LB平板上筛选阳性转化子并加以验证；
Cflr-inF引物序列GTAGGATCCTCTAGAATGGGTTGTGGGGAATCAAAG ；
Cflr-inR引物序列GACGTCGACTCTAGATGGCAGAACAGAGTAGTATAGCAGC ；
1.2.2 含高L-氨基酸目的基因CFLR的可活动性质粒pK18mobsacB-ΔALA::CFLR的构建
通过PCR克隆枯草芽孢杆菌基因ALA的左右边界序列alaT-L和alaT-R，并进一步得到alaT片段，之后用T4连接酶构建双交换同源重组质粒pK18mobsacB-ΔALA；然后将含有启动子和终止子的CFLR基因表达框Pgac-CFLR-rrnBT1T2通过酶切位点Sma I插入到pK18mobsacB-ΔALA中获得目的重组质粒pK18mobsacB-ΔALA::CFLR。PCR、酶切和连接体系同1.2.1。
1.2.3 不带抗性标记高产L-赖氨酸枯草芽孢杆菌株的构建
将重组可活动性质粒pK18mobsacB-ΔALA::CFLR转化到枯草芽孢杆菌中实现第一轮同源交换。用氨苄霉素和和氯霉素抗性平板筛选发生第一次同源重组的菌株。再挑选氨苄霉素和和氯霉素抗性平板生长单菌落培养后，进行蔗糖敏感型第二次同源重组的菌株筛选，最终获得的不带有抗性标记质粒的重组菌株。
1.2.4 枯草芽孢杆菌的传代培养
野生型枯草芽孢杆菌和重组枯草芽孢杆菌株，同时分别转接于普通LB斜面，37℃培养1d后再进行转接，共传代20次，每次传代后斜面均保存于4℃恒温冰箱。
1.2.5ΔALA和CFLR基因型的遗传稳定性研究
将活化后的第20代重组枯草芽孢杆菌株和野生型菌株分别在普通LB液体培养基中培养24h，于琼脂平板上稀释涂布，37℃培养1d。分别从各个平板上挑取单菌落，菌落PCR验证ΔProphage3的丢失和CFLR基因拷贝的存在。
1.2.6 重组枯草芽孢杆菌抗生素抗性丢失鉴定
将活化后的第20代重组枯草芽孢杆菌株和野生型菌株分别在普通LB液体培养基中培养24h，稀释后分别涂布于LB平板（无抗和添加100μg/mL氨苄霉素）、LB平板（无抗和添加150μg/mL氯霉素），37℃培养1d，比较不同平板上菌株的生长状况。
1.2.7 SDS-PAGE凝胶电泳测定L-氨酸浓度
制取蛋白样，从离心所得的上清液中取20μL，再加相应体积的2×SDS上样缓冲液，超声1min，然后煮沸10min。取20μL蛋白样上样进行Tris-甘氨酸SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，其浓缩胶浓度为5%，电泳时电压为50 V，分离胶浓度为15%，电泳时电压为90V。电泳结束后，用固定液固定蛋白胶30min，用考马斯亮兰R250染色液染色，经脱色液脱色后观察表达后产物条带。
1.2.8 HPLC检测枯草芽孢杆菌重组发酵菌液中L-赖氨酸的含量
参照黄建国等（2009）HPLC测定饲料源小肽产品中赖氨酸含量中赖氨酸的测定方法。色谱条件：C18不锈钢分离柱YMC（5μm4.6×150mm）；流动相A：0.01mol/L Na Ac-0.01mol/LHAc 缓冲体系（pH=5.2），75%；流动相B：100%甲醇，25%；检测波长：350nm；柱温：20℃；流速：0.8m L/min；外标法定量；实验用水均为超纯水。
2 、结果
2.1 辣椒高赖氨酸基因（CFLR）的克隆
以辣椒花药cDNA为模板，PCR扩增获得CFLR CDS（图1A），对PCR扩增得到的CFLR片段进行测序并与NCBI上基因序列进行比对分析，发现克隆到的片段中包含672bp的编码框。除第36和42位碱基外，阅读框其余序列与Genebank中的CFLR序列一致。表明所克隆到的片段即辣椒花药辣椒高赖氨酸基因CFLR。
CFLR CDS的基因序列如下：
ATGCATAAAAAAATCTACTTATCTCCCCCTCACATGAGCGGCAGAGAGCAGCACTATATTTCAGAAGCCTTTCGCTCTA ACTGGATTGCGCCGCTTGGGCCTCTCGTGAATTCATTTGAAGAACAATTGGCTGAACGCGTCGGCGTAAAAGGGGCGGC TGCGGTCAGCTCTGGAACGGCGGCGATTCATCTGGCGCTGCGTTTGCTTGAGGTAAAAGAAGGAGACAGTGTGTTTTGC CAGTCCTTCACATTTGTAGCAACCGCCAACCCGATTTTGTATGAAAAAGCGGTGCCTGTCTTTATTGATTCTGAGCCTG ATACGTGGAATATGTCCCCGAAAGCCCTTGAACGAGCGCTGGAGGATGCGAAAAGAAACGGAAAGCTGCCAAAAGCGGT CATTGCCGTCAATTTATATGGGCAAAGCGCGAAAATGGATGAAATCATAAGCCTGTGTGATGCATACGGAGTTCCTGTC ATTGAGGACGCAGCCGAATCTCTCGGCACAGTTTTTAAAGGGAAGCAAAGCGGGACATTCGGGCGCTTCGGCATTTTTT CATTTAACGGGAACAAAATTATCACCACATCAGGTGGCGGGATGCTCGTTTCAGACGATGAAGCCGCCATTGAAAAAGC TAGATTTCTCGCTTCACAGGCCCGTGATCCGGCTGTACATTATCAGCACAGCGAAATCGGACACAATTACAGACTGAGC AATATTCTCGCTGGCGTAGGCATTGCCCAGCTTGAAGTGCTGGATGAGCGGGTGGAGAAAAGAAGGGCTATTTTTACGA GATACAAAAATGCGCTCGGTCACATAGACGGCGTCCGCTTTATGCCGGAGTATGCAGCAGGCGTATCCAATCGCTGGCT TACCACGCTCACACTTGATAACGGGCTGAATCCATATGACGCGGTTCAGCGTCTTGCTGAAGAAAACATTGAAGCGCGG CCGCTGTGGAAGCCGCTCCATACCCAGCCGCTGTTTGCGCCGTCTTTATTTTATTCTCATGAAGGTAATGGGAGCATAT GCGAAGATCTTTTCAAGCAAGGGATCTGTCTCCCGTCTGGGTCAAATCTGACGGAAGAAGAACAAGACCGGGTCATTGA TGTGCTAGCACACTTATTCCAAACTGCCGAGGTGAAGAAATGGACAGCAAGCATTCGATGA
2.2 穿梭表达载体pHT43-CFLR的构建和鉴定
线性化的pHT43与CFLR连接产物转化大肠杆菌后，挑选部分克隆进行PCR鉴定，结果如图1B所示，挑选其中部分阳性克隆进行测序，并与CFLR CDS序列进行比对。结果表明克隆到的CFLR片段成功插入pHT43。
2.3 可活动性质粒pK18mobsacB-ΔALA的构建
如图2A所示，以枯草芽孢杆菌为模板，分别扩增左边界序列alaT-L和右边界序列alaT- R，产物分别为909bp和773bp（PCR体系同上，结果如图2B），并纯化；然后将纯化产物等量（摩尔数）混合作为模板，以alaT-L-F 和alaT-R-R为引物进一步扩增，融合两个片段，获得alaT（图2C）。
alaT-L-F 引物序列-CCGGAATTCGATGTTTGGTACGTTGA ；
alaT-L-R引物序列-CGTTATCCCGGGCAATCCAGTTAGAGCGAAAGG ；
然后用EcoRI-HF和PstI-HF pK18mobsacB载体与alaT片段进行消化（图2D），纯化后进行连接、转化大肠杆菌、挑取克隆进行PCR鉴定（图2E）和测序，得到预期克隆，并命名为pK18mobsacB-ΔALA。
A，枯草芽孢杆菌ALA突变构建流程示意图；B，左边界序列alaT-L（泳道1）和右边界序列alaT-R（泳道2）的克隆；C，alaT克隆结果；D，pK18mobsacB载体、alaT片段酶切后电泳图片；E， PCR鉴定克隆，其中CK+和CK-分别为阳性对照（alaT为模板）和阴性对照（模板为ddH2O），引物为ALAT-RF/ALAT-RR，产物773bp。
ALAT-R-F引物序列-ACTGGATTGCCCGGGATAACGGGCTGAATCCATATG ；
ALAT-RR引物序列-AAACTGCAGGCAGAAGCTTAATATGATTGC ；
2.4 含高L-氨基酸目的基因CFLR的可活动性质粒pK18mobsacB-ΔALA::CFLR的构建
选取2.3测序正确克隆培养，提取质粒，Sma I酶切并纯化；以PHT43-CFLR质粒为模板，扩增从启动子区Pgrac至CFLR的序列并纯化，无缝连接后转化大肠杆菌，再次进行克隆鉴定和测序，选取正确克隆培养并提取质粒，完成PK18mobsacB-ΔALA-CFLR构建（图3A-C）。
2.5 CFLR基因型的遗传稳定性研究
将重组枯草芽孢杆菌株和野生型菌株分别在普通 LB液体培养基中培养。分别从各个平板上挑取单菌落，菌落PCR验证CFLR基因拷贝的存在。如图4所示，重组枯草芽孢杆菌株中CFLR基因拷贝数明显比野生型菌株增加。
2.6比较不同平板上菌株的生长状况
PK18mobsacB-ΔALA-CFLR转化枯草芽孢杆菌，进行抗性和筛选（图5）。
2.7SDS-PAGE凝胶电泳测定L-赖氨酸浓度
对照菌（野生型枯草芽抱杆菌）和重组菌（重组枯草芽孢杆菌株）经过IPTG诱导表达（分别如图6泳道1和2），重组菌种出现了两条明显的蛋白条带，一条约24kDa，和CFLR基因表达的蛋白大小相符（图6）。
2.8 HPLC检测枯草芽孢杆菌重组发酵菌液中L-赖氨酸的含量
根据标准品各个浓度的峰面积制作标准曲线如图7，给出回归方程；赖氨酸标准品衍生液HPLC结果，野生型枯草芽抱杆菌的HPLC检测结果和重组菌的HPLC检测结果分别见图8和图9。目的峰的出峰时问约在14.223min左右，经计算，野生菌的Lys含量为21.08 μg/mL，重组菌的Lys含量达到28.42 μg/mL，重组菌Lys含量比野生菌提高了34.89%（n=3）。
3讨论
利用基因工程手段选育L-赖氨酸生产菌己成为当代育种的主要趋势。提高菌体生物合成途径中L-赖氨酸产量，主要是改造生物合成途径，如过表达L-赖氨酸合成途径中关键性酶基因，提高进入L-赖氨酸合成途径中“C”通量；通过基因敲除阻断细胞代谢途径中形成副产物途径。利用表达质粒介导的氨基酸合成途径中关键性酶基因的过表达是对枯草芽孢杆菌进行基因改造的主要手段。武彩霞等从辣椒花药中克隆CFLR基因，并利用基因工程手段将CFLR转入枯草芽孢杆菌中，从而使枯草芽孢杆菌发酵液中赖氨酸含量提高了16.05%。李学琳等从四棱豆中克隆wblrp基因，并将其转入枯草芽孢杆菌中，使枯草芽孢杆菌发酵液中赖氨酸含量提高9.85%。孙晓波等构建高赖氨酸蛋白基因（CFLR）植物表达载体pAHC25-CFLR，并将其转入植物小麦中，获得了籽粒中赖氨酸含量显著提高的小麦株系。然而，利用表达质粒介导基因的过表达必将在枯草芽孢杆菌细胞内引入抗性基因（如氨节青霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因等），而为了维持质粒的稳定，在发酵过程中需向培养基中添加一定浓度的抗生素，这种方式导致了其应用的局限性。因此，为了克服表达质粒介导的基因过表达存在的缺点，需要构建一种不依赖表达质粒介导的基因过表达，且获得的重组菌株不带有任何抗性标记的方法。
自杀性质粒pKl8mobsacB被广泛应用于对枯草芽孢杆菌基因组的基因敲除和基因替换。实现对基因的敲除和替换是通过重组质粒与基因组间发生双交换同源重组来完成的，获得的重组菌株不带有质粒和抗性标记双交换同源重组优于单交换同源重组是因为：
（1）重组效率高；（2）不受同源片段的限制。另外，研究表明，CFLR是高赖氨酸蛋白基因，该基因所编码蛋白质中赖氨酸含量为21.2%，是目前已知赖氨酸含量最高天然蛋白。现已报道天然存在高赖氨酸蛋白基因还有sb401、SBgLR、st901、tsb和wblrp，但这些基因所表达蛋白质中赖氨酸含量都低于CFLR。结合以上两点本文构建了一种新的直接作用枯草芽孢杆菌基因组同时实现ALA基因敲除和CFLR基因过表达而不带有任何抗性标记的方法。通过该方法实现枯草芽孢杆菌发酵液中赖氨酸含量提高34.89%。另外，本文构建的方法实现ALA基因的敲除，也能和其他研究一样在不影响菌株生长的情况下减少枯草芽孢杆菌代谢途径中副产物如L-丙氨酸的积累，并利于赖氨酸产量的提高。
枯草芽孢杆菌遗传背景清楚，蛋白分泌机制健全、生长迅速、培养简便、不分泌内毒素，具有较好生物安全性，是美国食品药物管理局（FDA）和中国农业部批准使用安全菌株；可直接将表达产物分泌到培养基中，产物便于提取和纯化，是表达外源基因良好受体菌。本试验采用野生型宿主菌CMCC（B）63501是枯草芽孢杆菌表达系统中最为广泛应用的宿主菌，在本试验中外源基因表达成功（在24 ka处出现目条带）。益生菌枯草芽孢杆菌作为外源蛋白宿主菌已成功表达多种类型基因，Liu等实现芽孢杆菌akibiⅠ-1内切葡聚糖酶在枯草芽孢杆菌168中过量表达；Abbasi-Hosseini等克隆克劳氏芽孢杆菌中碱性丝氨酸蛋白基因，并在枯草芽孢杆菌WB600中成功表达，重组枯草芽孢杆菌比原始菌株产碱性蛋白酶活性增强3倍，李爽等构建pHT43-VP2重组表达载体，并转化入枯草芽孢杆菌WB600中诱导表达。结果表明在69 ka处存在目蛋白，郭菁等将构建重组质粒通过化学转化法转入枯草芽孢杆菌蛋白酶缺失菌株WB600中，转化子pWT22-BLG4/WB600在IPTG（1.0 mmol·L -1）诱导下，发酵液上清中蛋白酶活达到620U·mL-1，高于出发菌株G4BLG4酶活（240 U·mL-1）；外源基因转入枯草芽孢杆菌中例子还有很多，本研究在枯草芽孢杆菌中表达植物来源高赖氨酸蛋白基因CFLR，可为今后开展高赖氨酸蛋白基因在益生菌中高效表达和应用提供理论基础。
综上所述，本文构建的直接作用枯草芽孢杆菌基因组同时实现基因敲除和另一基因过表达而不带有任何抗性标记的方法是可行的，并且可以运用在通过基因工程手段选育L-赖氨酸高产菌。
本发明公开的高产L-赖氨酸枯草芽孢杆工程菌的构建方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：
（1）实现在养殖业中作为饲料添加剂直接饲喂，有效降低饲喂成本，提高畜禽生长性能和免疫能力。
（2）实现在农业生产中枯草芽孢杆菌重组菌株作为体外发酵工程菌，有效提高L-赖氨酸生产效率和安全性，降低生产成本。
附图说明
图1为CFLR片段的克隆产物和鉴定结果；其中A为CFLR克隆产物电泳结果，其中M为Trans 2K DNA Marker，1为克隆产物；B，pHT43-CFLR克隆电泳结果，其中1~10为不同的单克隆，CK-和CK+分别为阴性（模板为ddH2O）和阳性对照（模板为CFLR克隆产物）；
图2为可活动性质粒pK18mobsacB-ΔALA的构建；如（A）所示，以枯草芽孢杆菌为模板，分别扩增左边界序列alaT-L和右边界序列alaT-R，产物分别为909bp和773bp（PCR体系同上，结果如图（B），并纯化；然后将纯化产物等量（摩尔数）混合作为模板，以alaT-L-F 和alaT-R-R为引物进一步扩增，融合两个片段，获得alaT（C），然后用EcoRI-HF和PstI-HFpK18mobsacB载体与alaT片段进行消化（D），纯化后进行连接、转化大肠杆菌、挑取克隆进行PCR鉴定（E）和测序，得到预期克隆，并命名为pK18mobsacB-ΔALA；
图3为酶切鉴定重组质粒pK18mobsacB-ΔALA::CFLR；A，pK18mobsacB-ΔALA酶切电泳图片，其中泳道1和2分别为酶切后产物和对照质粒，M为Trans 2K Plus II DNA marker；B，Pgrac-CFLR片段扩增结果；C，PK18mobsacB-ΔALA-CFLR构建克隆鉴定结果，其中1-7为不同的克隆， CK+和CK-分别为阳性对照（Pgrac-CFLR片段为模板）和阴性对照（模板为ddH2O），引物为Pgrac-F/CFLR-R；B和C中M为Trans 2K DNA marker；
图4为菌落PCR验证CFLR基因；1，重组枯草芽孢杆菌株；2，野生型菌株；
图5为枯草芽孢杆菌筛选结果；1，枯草芽孢杆菌；2，转化PK18mobsacB载体的枯草芽孢杆菌，3，转化PK18mobsacB-ΔALA-CFLR后经过筛选的重组枯草芽孢杆菌；
图6为SDS-PAGE凝胶电泳检测CFLR蛋白诱导表达结果；
图7为赖氨酸标准曲线；
图8为赖氨酸标准品衍生液的HPLC结果；
图9为HPLC测定枯草芽胞杆菌中赖氨酸的含量。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。
实施例1
高产L-赖氨酸枯草芽孢杆工程菌的构建方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）辣椒高赖氨酸基因（CFLR）的克隆以及穿梭表达载体pHT43的构建
按照GenBank中辣椒高赖氨酸基因CFLR cDNA序列设计引物，用Trizol提取辣椒花药中的RNA，并利用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，以该cDNA为模板，应用PCR克隆CFLRCDS序列；所述CFLRCDS序列如SEQ ID NO:1所示；
（2）含高L-氨基酸目的基因CFLR的可活动性质粒pK18mobsacB-ΔALA::CFLR的构建：
通过PCR克隆枯草芽孢杆菌基因ALA的左右边界序列alaT-L和alaT-R，并进一步得到alaT片段，之后用T4连接酶构建双交换同源重组质粒pK18mobsacB-ΔALA；然后将含有启动子和终止子的CFLR基因表达框Pgac-CFLR-rrnBT1T2通过酶切位点Sma I插入到pK18mobsacB-ΔALA中获得目的重组质粒pK18mobsacB-ΔALA::CFLR；
（3）不带抗性标记高产L-赖氨酸枯草芽孢杆菌株的构建
将重组可活动性质粒pK18mobsacB-ΔALA::CFLR转化到枯草芽孢杆菌中实现第一轮同源交换，用氨苄霉素和氯霉素抗性平板筛选发生第一次同源重组的菌株，再挑选氨苄霉素和和氯霉素抗性平板生长单菌落培养后，进行蔗糖敏感型第二次同源重组的菌株筛选，得到不带有抗性标记质粒的重组菌株CMCC（B）63501/pK18mobsacB-ΔALA ::CFLR。
实施例2
高产L-赖氨酸枯草芽孢杆工程菌的复苏扩繁方法：
（1）复苏种子液制备：
1、培养基准备：葡萄糖 20 g，牛肉膏1 g，蛋白胨5 g，NaCl 5 g，H2O 1 000 ml，pH自然，高压灭菌锅121℃灭菌20 min。
2、摇瓶培养基分装于250ml三角瓶，每瓶50ml。从斜面上挑取一环菌种，接入摇瓶种子培养基，37℃，180rpm振荡培养12小时即为种子液。
3、取种子液分别1ml 放入1.5mlEP（20个）离心管中3000rpm，8min ，4℃离心，弃上清，将菌株放入-20℃冰箱冷藏保存备用。
（2）菌株扩繁培养
1、培养基制备：葡萄糖 20 g，牛肉膏1 g，蛋白胨5 g，NaCl 5 g，H2O 1 000 ml，pH7.0。高压灭菌锅121℃灭菌20 min。
2、接种，可以采用火焰接种法，在接种口放置酒精圈，点燃后，将菌种通过火焰圈迅速倒入摇瓶内，进行计时培养；1L培养基放入5L的药瓶中。
3、菌株繁殖培养：种子培养好后，将种子接到发酵罐中，接种量5%， 37℃控温通风培养，转速200转/分，培养16小时。
4、将菌液放入离心管中4℃离心，弃上清，保留沉淀。
（3）菌粉制备
1）向菌渣中加入生理盐水和保护剂，得到混合菌液，混合菌液中加入总质量的80wt%的保护液，其余为菌渣和生理盐水；
2）保护剂：总质量中海藻糖10wt%，乳糖10wt%，谷氨酸钠3wt%；
3）保护液：总质量中甘油2wt%、麦芽糖1wt%、L-半胱氨酸2wt%、乳糖2wt%；
4）充分混匀后，先放入-40-80℃中预冻48-96h，然后-冷冻干燥48-72h；
最后制备完成冻干粉。
所述冻干粉的理化特性：
（1）有效地防止了制品理化及生物特性的改变
（2）生物组织和细胞结构和特征的损伤较小，使其快速进入休眠状态，有效保护了许多热敏性药物生物制品有效成份的稳定性
（3）由于干燥在真空条件下进行，对于一些易氧化的物质具有很好的保护作用
（4）制品经过冻干后水份含量非常低，使制品的稳定性提高，受污染的机会减小，这不仅方便了运输还延长了制品保存期限。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津市畜牧兽医研究所
<120> 一种高产L-赖氨酸枯草芽孢杆工程菌的构建方法及应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 920
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctttgaatcc aaatcaaagg aaaacagaaa atatcaacat cccttttcct ctattcctcc 60
aattctttat aacaacaata aaagatgggt tgtggggaat caaagcacgc agttgcaacg 120
gaaaaagcca ccgttccaaa gaacaagaga tcattgagtt ctaaatccaa tggagaaact 180
caaatttctc aagaaagtgt caagaaaaat acagaaaatg gagaatctgg ggttgcagaa 240
acggcgaaaa caagtgatga gaaagtagag gttaaagcca aggtggatga ggcaactgca 300
cccaaagtgg tggctgtaga aaaagaaaaa gctaaagaaa agtctgagaa gaaagaaatg 360
gtgggaacaa cagaggaggt ttttgctgaa aagaaggaag aaaaagttgt ggaatctcaa 420
cctggagaga agaagaattc aaatgatgaa acaactccag ctgttgctgc tgtagataag 480
acagaatcag ttgaagagat taatgtgcaa gacaaagctg aggagaccat taagccaatc 540
gaagaagaga aaaagaagga agaagttacc gctgttactg aggccacaga tgctgctaaa 600
tcagaaagtg ccaaggatgc tgataaacca gaaagtgcca aggatgttga taaaatagaa 660
actgtcaagg atgctaataa gccagagaca gaggaaaagc caaatgagaa gaaagcaact 720
gagacatcaa caacaacaga tttgaaaaca gattaaactg caggcatgga cacagggaag 780
agggctattt attagtttaa tccttgcttt tttaaagctt gttataattt ccagctttaa 840
gtaaacatat ttgttcgatc tgtactcgga tggctgctat actactctgt tctgccaaaa 900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 920
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtaggatcct ctagaatggg ttgtggggaa tcaaag 36
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gacgtcgact ctagatggca gaacagagta gtatagcagc 40
<210> 4
<211> 1167
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgcataaaa aaatctactt atctccccct cacatgagcg gcagagagca gcactatatt 60
tcagaagcct ttcgctctaa ctggattgcg ccgcttgggc ctctcgtgaa ttcatttgaa 120
gaacaattgg ctgaacgcgt cggcgtaaaa ggggcggctg cggtcagctc tggaacggcg 180
gcgattcatc tggcgctgcg tttgcttgag gtaaaagaag gagacagtgt gttttgccag 240
tccttcacat ttgtagcaac cgccaacccg attttgtatg aaaaagcggt gcctgtcttt 300
attgattctg agcctgatac gtggaatatg tccccgaaag cccttgaacg agcgctggag 360
gatgcgaaaa gaaacggaaa gctgccaaaa gcggtcattg ccgtcaattt atatgggcaa 420
agcgcgaaaa tggatgaaat cataagcctg tgtgatgcat acggagttcc tgtcattgag 480
gacgcagccg aatctctcgg cacagttttt aaagggaagc aaagcgggac attcgggcgc 540
ttcggcattt tttcatttaa cgggaacaaa attatcacca catcaggtgg cgggatgctc 600
gtttcagacg atgaagccgc cattgaaaaa gctagatttc tcgcttcaca ggcccgtgat 660
ccggctgtac attatcagca cagcgaaatc ggacacaatt acagactgag caatattctc 720
gctggcgtag gcattgccca gcttgaagtg ctggatgagc gggtggagaa aagaagggct 780
atttttacga gatacaaaaa tgcgctcggt cacatagacg gcgtccgctt tatgccggag 840
tatgcagcag gcgtatccaa tcgctggctt accacgctca cacttgataa cgggctgaat 900
ccatatgacg cggttcagcg tcttgctgaa gaaaacattg aagcgcggcc gctgtggaag 960
ccgctccata cccagccgct gtttgcgccg tctttatttt attctcatga aggtaatggg 1020
agcatatgcg aagatctttt caagcaaggg atctgtctcc cgtctgggtc aaatctgacg 1080
gaagaagaac aagaccgggt cattgatgtg ctagcacact tattccaaac tgccgaggtg 1140
aagaaatgga cagcaagcat tcgatga 1167
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ccggaattcg atgtttggta cgttga 26
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cgttatcccg ggcaatccag ttagagcgaa agg 33

Claims (4)

1.一种高产L-赖氨酸枯草芽孢杆工程菌，其特征在于所述基因工程菌为不带质粒抗性标记的高产L-赖氨酸枯草芽孢杆菌株CMCC（B）63501/pK18mobsacB-ΔALA ::CFLR。
2.权利要求1所述的高产L-赖氨酸枯草芽孢杆工程菌的构建方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）辣椒高赖氨酸基因（CFLR）的克隆以及穿梭表达载体pHT43的构建
按照GenBank中辣椒高赖氨酸基因CFLR cDNA序列设计引物，用Trizol提取辣椒花药中的RNA，并利用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，以该cDNA为模板，应用PCR克隆CFLRCDS序列；所述CFLRCDS序列如SEQ ID NO:1所示；
（2） 含高L-氨基酸目的基因CFLR的可活动性质粒pK18mobsacB-ΔALA::CFLR的构建：
通过PCR克隆枯草芽孢杆菌基因ALA的左右边界序列alaT-L和alaT-R，并进一步得到alaT片段，之后用T4连接酶构建双交换同源重组质粒pK18mobsacB-ΔALA；然后将含有启动子和终止子的CFLR基因表达框Pgac-CFLR-rrnBT1T2通过酶切位点Sma I插入到pK18mobsacB-ΔALA中获得目的重组质粒pK18mobsacB-ΔALA::CFLR；
（3）不带抗性标记高产L-赖氨酸枯草芽孢杆菌株的构建
将重组可活动性质粒pK18mobsacB-ΔALA::CFLR转化到枯草芽孢杆菌中实现第一轮同源交换，用氨苄霉素和和氯霉素抗性平板筛选发生第一次同源重组的菌株，再挑选氨苄霉素和和氯霉素抗性平板生长单菌落培养后，进行蔗糖敏感型第二次同源重组的菌株筛选，获得不带有抗性标记质粒的重组菌株；CMCC（B）63501/pK18mobsacB-ΔALA::CFLR。
3.采用权利要求1所述高产L-赖氨酸枯草芽孢杆工程菌进行复苏扩繁的方法：
（1）复苏种子液制备：
1）、培养基准备：葡萄糖 20 g，牛肉膏1 g，蛋白胨5 g，NaCl 5 g，H2O 1 000 ml，pH自然，高压灭菌锅121℃灭菌20 min；
2）、摇瓶培养基分装于250ml三角瓶，每瓶50ml；
从斜面上挑取一环菌种，接入摇瓶种子培养基，37℃，180rpm振荡培养12小时即为种子液；
3）、取种子液分别1ml放入1.5mlEP（20个）离心管中3000rpm，8min，4℃离心，弃上清，将菌株放入-20℃冰箱冷藏保存备用；
（2）菌株扩繁培养
1）培养基制备：葡萄糖 20 g，牛肉膏1 g，蛋白胨5 g，NaCl 5 g，H2O 1 000 ml，pH7.0，高压灭菌锅121℃灭菌20 min；
2）接种，可以采用火焰接种法，在接种口放置酒精圈，点燃后，将菌种通过火焰圈迅速倒入摇瓶内，进行计时培养；
1L培养基放入3-5L的药瓶中；
3）菌株繁殖培养：种子培养好后，将种子接到发酵罐中，接种量5%，36℃—37℃控温通风培养，转速200转/分，培养12-16h；
4）将菌液放入离心管中4℃离心，弃上清，保留沉淀；
（3）菌粉制备
1）向菌渣中加入生理盐水和保护剂，得到混合菌液；混合菌液中加入总质量的80wt%的保护液，其余为菌渣和生理盐水
2）保护剂：总质量中海藻糖10wt%，乳糖10wt%，谷氨酸钠3wt%；
3）保护液：总质量中甘油2wt%、麦芽糖1wt%、L-半胱氨酸2wt%、乳糖2wt%；
4）充分混匀后，先放入-40-80℃中预冻48-96h，然后-冷冻干燥48-72h；
最后制备完成冻干粉。
4.权利要求1所述高产L-赖氨酸枯草芽孢杆工程菌在益生菌中高效表达方面的应用；所述的益生菌中高效表达指的是重组菌株L-赖氨酸含量比野生菌株显著提高。
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