CN102021164A

CN102021164A - 一种无抗生素抗性标记的枯草芽孢杆菌构建方法及筛选靶基因失活的枯草芽孢杆菌的方法

Info

Publication number: CN102021164A
Application number: CN 201010535809
Authority: CN
Inventors: 陆兆新; 张充; 别小妹; 吕凤霞; 王煜; 赵海珍
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2010-11-09
Filing date: 2010-11-09
Publication date: 2011-04-20
Anticipated expiration: 2030-11-09
Also published as: CN102021164B

Abstract

本发明公开了一种无抗生素抗性标记的枯草芽孢杆菌构建方法及筛选靶基因失活的枯草芽孢杆菌的方法。本方法首先以枯草芽孢杆菌168为出发菌株，构建两个同源交换片段，利用同源重组原理，通过两次双交换过程构建了一个可调控的赖氨酸营养缺陷型菌株BS-PS。以大肠杆菌克隆载体pMD19-T为骨架构建了通用型整合突变载体PLC，以枯草芽孢杆菌中性蛋白酶nprE为失活靶基因，采用插入失活策略，以PLC为基础，构建了插入失活nprE的整合载体PLC-InprE，转化入BS-PS，通过一次单交换，以及一次自发单交换过程，以控制赖氨酸的合成为筛选标记结合PCR验证结果，对蛋白酶插入失活的突变菌株进行筛选。

Description

一种无抗生素抗性标记的枯草芽孢杆菌构建方法及筛选靶基因失活的枯草芽孢杆菌的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种无抗生素抗性标记的枯草芽孢杆菌构建方法及筛选靶基因失活的枯草芽孢杆菌的方法。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)被公认为是安全菌株(GRAS)，可以使外源基因分泌表达出有活性的产物。此外，枯草芽孢杆菌遗传背景清楚、具有生长迅速、培养条件简单、良好的发酵基础和生产技术，使其在科研和工农业生产领域被广泛应用。B.subtilis作为一种重要的工业微生物，具有开发为食品级表达宿主的优势，减少用于食品行业的重组生物制品的下游分离纯化成本。

目前B.subtilis作为宿主的最大问题是其自身分泌的蛋白酶，对外源蛋白产生降解作用，严重的影响了外源目的产物的分泌表达产量。B.subtilis分泌多种蛋白酶对外源基因的降解作用早已引起许多学者的注意。国外学者通过基因敲出技术将已发现的蛋白酶基因逐个敲除，生成了DB104、DB403、WB600、WB700、WB800等蛋白酶缺陷菌株。WB800是由加拿大Sui-Lam Wong教授实验室创建的敲除了碱性蛋白酶(apr)、中性蛋白酶(npr)、金属蛋白酶(mpr)、中性蛋白酶B(nprB)、三种丝氨酸蛋白酶(epr、bpf和vpr)和胞壁蛋白酶(cwp)8种蛋白酶的菌株。该菌株已失去绝大部分的蛋白酶活力，很多基因在该宿主内实现了稳定表达。但是WB800内残留的蛋白酶仍然对某些敏感蛋白造成降解。WB800的构建也是通过传统的基因敲出过程，宿主本身携带了多种抗生素基因，不能应用于食品级工程菌，不符合食品安全标准。

传统的对枯草芽孢杆菌染色体的基因操作是通过一个正向筛选标记实现的，通常是在要失活或敲除的基因内部插入一个抗性基因，其两端即为同源交换臂，这样根据同源重组原理，修饰过的或无活性的基因将原始染色体上的活性基因置换。然而，当我们在经过一次基因修饰的菌株上再次进行基因操作，不可避免的引入第二个抗性基因；另外一种方法是通过再一次的单交换作用，将第一次引入的抗性基因切除掉。可以想见第一种方法，将会导致宿主产生多种抗生素抗性，而且多重抗生素抗性压力下有可能会改变菌株的生理特性；第二种方法的缺陷是发生一次双交换后，再发生一次单交换的频率极低，而且没有正向筛选标记，工作量相当大。

因此，建立一套枯草芽孢杆菌的无抗生素抗性标记基因的筛选技术对基础研究和应用研究具有重要推动作用。Fabret等在2002年第一次报导了枯草芽孢杆菌无标记基因组修饰的方法，原理是通过控制尿嘧啶合成的有无来起到筛选的目的。此后，先后出现了5篇这方面的报导，或是以利用抗药性筛选、利用营养缺陷型筛选和利用毒素基因/解毒素基因筛选。这些方法的共同之处是需要发生两次双交换过程达到基因修饰的目的。第一次双交换借助同源片段，第二次双交换借助所修饰的靶基因位点两侧引入的两个同向重复序列(DR)。虽然上述方法能够达到无抗生素抗性标记筛选的目的，但是构建敲除载体过程繁琐，并且重组突变效率低。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种无抗生素抗性标记的枯草芽孢杆菌构建方法及筛选靶基因失活的枯草芽孢杆菌的方法。

一种无抗生素抗性标记的条件赖氨酸营养缺陷型枯草芽孢杆菌构建方法，其特征在于包括下述步骤：

(1)分别构建SpovAF-CM-Lys和SpovAF-Pspac-Lys同源交换片段；

(2)SpovAF-CM-Lys转化枯草芽孢杆菌168感受态细胞，发生一次双交换，该菌株基因组上LysA基因天然启动子被置换为含有终止子的CM基因，得到赖氨酸营养缺陷型突变菌株BS-CM；

(3)SpovAF-Pspac-Lys转化BS-CM感受态细胞，发生一次双交换，所述的CM基因被替换为受LacI基因抑制调节的Pspac启动子，得到无抗生素抗性标记的条件赖氨酸营养缺陷型枯草芽孢杆菌BS-PS。

其中，所述的SpovAF-CM-Lys同源交换片段通过如下步骤得到：

(1)以枯草芽孢杆菌168基因组DNA为模板分别进行PCR扩增得到spoVAF基因和Lys基因，以pJC164.3质粒为模板PCR扩增包括启动子和终止子的CM基因，将这三个基因分别克隆至pMD19-T载体，得到pMD19-T-spoVAF、pMD19-T-LysA、pMD19-T-CM载体；

(2)步骤(1)所述的pMD19-T-CM经双酶切后获得CM片段，与经过相同双酶切处理的pMD 19-T-spoVAF载体连接得到pMD 19-T-spoVAF-CM载体；

(3)步骤(1)所述的pMD19-T-LysA经双酶切后获得LysA片段，与经过相同双酶切处理的pMD19-T-spoVAF-CM载体连接得到pMD19-T-S-C-L载体；

(4)以spoVAF-F(SEQ ID NO.1)为上游引物，LysA-R(SEQ ID NO.4)为下游引物，以步骤(3)所述pMD19-T-S-C-L载体为模板PCR扩增得到SpovAF-CM-LysA同源交换片段。所述的SpovAF-Pspac-LysA同源交换片段通过如下步骤得到：

(1)以枯草芽孢杆菌168基因组DNA为模板分别进行PCR扩增得到spoVAF基因和Lys基因，以PDG-Stu质粒为模板PCR扩增得到Pspac启动子基因，将这三个基因分别克隆至pMD19-T载体，得到pMD19-T-spoVAF、pMD19-T-LysA、pMD19-T-Pspac载体；

(2)步骤(1)所述的pMD19-T-Pspac经双酶切后获得Pspac片段，与经过相同双酶切处理的pMD 19-T-spoVAF载体连接得到pMD 19-T-spoVAF-Pspac载体；

(3)步骤(1)所述的pMD19-T-LysA经双酶切后获得LysA片段，与经过相同双酶切处理的pMD19-T-spoVAF-Pspac载体连接得到pMD19-T-S-P-L载体；

(4)以spoVAF-F(SEQ ID NO.1)为上游引物，LysA-R(SEQ ID NO.4)为下游引物，以步骤

(3)所述pMD19-T-S-P-L载体为模板PCR扩增得到SpovAF-Pspac-LysA同源交换片段。

一种利用无抗生素抗性标记基因筛选技术筛选靶基因失活的枯草芽孢杆菌的方法，包括如下步骤：

(1)按照权利要求1所述方法构建无抗生素抗性标记的条件赖氨酸营养缺陷型枯草芽孢杆菌BS-PS；

(2)构建插入失活靶基因的同源整合载体；

(3)将步骤(2)所述的同源整合载体转化步骤(1)所述的无抗生素抗性标记的条件赖氨酸营养缺陷型枯草芽孢杆菌BS-PS，通过一次单交换和一次由于基因组结构不稳定引起的自发单交换过程，以是否能自我合成赖氨酸为筛选标记，得到两种基因型的枯草芽孢杆菌突变株，一种为枯草芽孢杆菌回复突变菌株，另一种为靶基因失活的无抗生素抗性标记基因的枯草芽孢杆菌突变株，经PCR鉴定筛选得到靶基因失活的无抗生素抗性标记基因的枯草芽孢杆菌突变株。

其中，步骤(2)所述的插入失活靶基因的同源整合载体通过如下方法构建：

(1)以大肠杆菌pMD19-T为骨架，构建了一个含有P43-LacI自主表达框及CM结构基因的通用型整合载体PLC-T；

(2)构建插入插入子的失活枯草芽孢杆菌168靶基因；

(3)将步骤(2)所述的失活枯草芽孢杆菌168靶基因亚克隆至通用型整合载体PLC-T，得到所述的插入失活靶基因的同源整合载体。

步骤(3)所述的PCR鉴定方法为设计扩增靶基因的引物，分别以靶基因失活的无抗生素抗性标记基因的枯草芽孢杆菌突变株基因组和枯草芽孢杆菌回复突变菌株基因组为模板进行PCR扩增，以靶基因失活的无抗生素抗性标记基因的枯草芽孢杆菌突变株基因组为模板扩增出来的条带比以枯草芽孢杆菌回复突变菌株基因组为模板扩增的条带多出插入序列的大小。

所述的靶基因为蛋白酶基因，优选nprE基因或aprE基因。

有益效果：

本发明以BS168为出发菌株，通过两次双交换过程获得了BS-PS突变菌株，该菌株基因组上控制赖氨酸合成酶的基因LysA的启动子被置换为Pspac启动子，该启动子可受LacI的抑制，即BS-PS菌株可受LacI调控。该无抗生素抗性标记的条件赖氨酸缺陷型枯草芽孢杆菌构建方法过程简单，重组突变效率高。赖氨酸是枯草杆菌宿主生长所必须氨基酸，控制其合成的启动子为组成型，本发明中选择能够调控的Pspac启动子，并且枯草杆菌本身不合成LacI阻抑蛋白，因此可通过LacI严格控制宿主的生长情况。同时，赖氨酸条件营养型标记符合食品级工程菌对筛选标记的要求。

本发明在构建条件赖氨酸缺陷型枯草芽孢杆菌BS-PS的基础上，能够以赖氨酸能否自我合成为筛选标记，对枯草芽孢杆菌同一菌株进行重复、多次的基因组改造，获得的蛋白酶失活的枯草芽孢杆菌突变菌株，与以已报导的方法相比有以下优点：

(1)该方法在敲除靶蛋白酶的同时不会向宿主引入抗生素基因，所构建的蛋白酶失活的枯草芽孢杆菌无抗生素抗性基因，可应用于食品级工程菌，不符合食品安全标准。

(2)构建整合突变载体简单。以往报导的方法需要复杂的操作过程来构建用来发生两次双交换过程的元件，即用来发生第一次双交换的A、B同源片段和用来发生第二次双交换的两DR序列，靶基因则位于两个DR之间。本方法首先构建一个通用的整合载体PLC-T，在此基础上只要将靶基因内部插入或缺失一段序列，然后将修饰后的靶基因插入PLC-T即可。

(3)突变效率高。以往报导的方法需要发生两次双交换过程，而本方法需要发生两次单交换的过程。枯草芽孢杆菌基因组发生单交换比双交换的频率高，因此，本方法整个过程要比以往报导的方法效率要高。

(4)本发明所采用的方法可在同一突变菌株重复使用。本发明中利用赖氨酸能否自我合成为筛选标记，在发生第二次自发单交换过程后，突变宿主恢复了赖氨酸合成能力。当再次转化入整合突变载体后，又可以以赖氨酸合成能力的有无作为筛选标记。因此，可以在同一菌株运用本发明方法进行多次基因突变操作。

附图说明

图1.本发明技术方案。

图2.SpovAF-CM-LysA和SpovAF-Pspac-LysA同源交换片段的构建。

图3.BS-CM突变菌株的构建。

图4.BS-PS突变菌株的构建。

图5.BS-PS菌株蛋白酶nprE和aprE失活整合载体的构建。

图6.BS-PS菌株nprE蛋白酶基因的插入失活。(a)整合突变载体与BS-PS基因组发生单交换；(b)过渡菌株由于基因组不稳定发生自发单交换。

图7.PCR产物电泳验证BS-PS-nI菌株。

图8.PCR产物电泳验证BS-PS-nI-aI菌株。

图9.SDS-PAGE检测BS-PS-nI-aI菌株分泌蛋白。

具体实施方式

本发明首先构建SpovAF-CM-LysA和SpovAF-Pspac-LysA两个同源交换片段，通过两次双交换过程将枯草芽孢杆菌168改造为条件赖氨酸营养缺陷型菌株BS-PS。在此基础上构建失活nprE和aprE靶基因的同源整合载体，通过一次单交换过程，获得过渡菌株，由于过渡菌株基因组结构不稳定引起再一次自发单交换过程，以赖氨酸为筛选标记，筛选蛋白酶基因插入失活的突变菌株(技术方案如图1)，从生理、分子及生化方面对突变菌株进行验证，技术方案如图1具体实施方式如下：

实施例1BS-PS突变菌株的构建

(1)SpovAF-CM-LysA同源交换片段的构建

构建路线见图2。以spoVAF-F(SEQ ID NO.1)和spoVAF-R(SEQ ID NO.2)为引物，以枯草芽孢杆菌168(BS168)基因组DNA为模板PCR扩增spoVAF基因；以LysA-F(SEQ ID NO.3)和LysA-R(SEQ ID NO.4)为引物，以BS168基因组DNA为模板PCR扩增Lys基因；以CM-F(SEQ ID NO.5)和CM-R(SEQ ID NO.6)为引物，以pJC164.3质粒(BGSC，含有CM基因)为模板PCR扩增包括启动子和终止子的CM(氯霉素抗性基因)。扩增得到的三个基因分别克隆至pMD19-T(购自Takara公司)载体，经验证、测序正确后，分别命名为pMD19-T-spoVAF、pMD19-T-LysA、pMD19-T-CM，于-20℃条件下保存备用。

PCR扩增体系如下：10×Pfu PCR buffer 10μl，10μM上游引物10μl，10μM下游引物10μl，2.5mMdNTPs 8μl，pJC164.3质粒10ng，ddH2O加至100μl，Pfu DNA聚合酶5U。PCR程序为94℃2min；30×(94℃45s；58℃50s；72℃4min)；72℃10min。以下PCR反应同此条件。

pMD19-T-CM用BamHI/XhoI双酶切后获得CM片段，与经过相同双酶切处理的pMD19-T-spoVAF载体，用T4DNA连接，构建得到pMD19-T-spoVAF-CM载体，酶切验证正确后于-20℃条件下保存备用。

pMD19-T-LysA用BamHI/KpnI双酶切后获得LysA片段，与经过相同双酶切处理的pMD19-T-spoVAF-CM载体，用T4DNA连接，构建得到pMD19-T-S-C-L载体，酶切验证正确后于-20℃条件下保存备用。

以spoVAF-F(SEQ ID NO.1)为上游引物，LysA-R(SEQ ID NO.4)为下游引物，以pMD19-T-S-C-L载体为模板进行PCR扩增反应，PCR产物即为SpovAF-CM-LysA同源交换片段，经PCR产物回收试剂盒回收处理后即可用于电转化操作。

(2)SpovAF-Pspac-LysA同源交换片段的构建

构建路线见图2。以Pspac-F(SEQ ID NO.7)和Pspac-R(SEQ ID NO.8)为引物，以PDG-Stu质粒(BGSC，含有Pspac启动子基因)为模板PCR扩增得到Pspac启动子基因，该启动子受LacI抑制。扩增得到的Pspac启动子克隆至pMD19-T载体，经验证、测序正确后，命名为pMD19-T-Pspac，于-20℃条件下保存备用。

pMD19-T-Pspac用BamHI/XhoI双酶切后获得Pspac片段，与经过相同双酶切处理的pMD19-T-spoVAF载体，用T4DNA连接，构建得到pMD19-T-spoVAF-Pspac载体，酶切验证正确后于-20℃条件下保存备用。

pMD19-T-LysA用BamHI/KpnI双酶切后获得LysA片段，与经过相同双酶切处理的pMD19-T-spoVAF-Pspac载体，用T4DNA连接，构建得到pMD19-T-S-P-L载体，酶切验证正确后于-20℃条件下保存备用。

以spoVAF-F(SEQ ID NO.1)为上游引物，LysA-R LysA-R(SEQ ID NO.4)为下游引物，以pMD19-T-S-P-L载体为模板进行PCR扩增反应，PCR产物即为SpovAF-Pspac-LysA同源交换片段，经PCR产物回收试剂盒回收处理后即可用于电转化操作。

(3)BS-CM突变菌株的构建

构建路线如图3所示。以BS168为出发菌株，制备感受态细胞，采用电转化方法，将获得的同源交换片段SpovAF-CM-LysA转化入BS168，在基因组SpovAF和LysA位点发生双交换，CM抗性平板上筛选得到BS-CM抗性菌株。该菌株的SpovAF和LysA结构基因连接处被置换为CM基因，产生两个表型效应，一是BS-CM突变菌株具有氯霉素抗性；二是，LysA基因天然启动子被置换掉，而CM基因含有终止子，其启动子不能对LysA基因起转录作用，因此失去合成赖氨酸功能，BS-CM菌株成为赖氨酸营养缺陷型突变体。

(4)BS-PS突变菌株的构建

构建路线如图4所示。以BS-CM为出发菌株，制备感受态细胞，采用电转化方法，将获得的同源交换片段SpovAF-Pspac-LysA转化入BS-CM菌株，在基因组SpovAF和LysA位点发生双交换，基本培养基平板上筛选得到BS-PS突变菌株。通过两次同源重组的双交换过程，原始枯草芽孢杆菌LysA基因启动子被置换为Pspac启动子，该启动子受LacI基因抑制调节，菌株被改造为条件营养缺陷型，即在LacI基因存在时为赖氨酸营养缺陷型，无LacI基因恢复正常表型。

实施例2利用无抗生素抗性标记基因筛选技术筛选靶基因失活的枯草芽孢杆菌

(1)BS-PS菌株蛋白酶nprE和aprE失活整合载体的构建

本发明选取了两个枯草芽孢杆菌分泌较多的蛋白酶基因aprE和nprE，采用插入失活的策略，进行突变失活研究。以大肠杆菌pMD19-T为骨架，构建了一个通用型整合载体PLC-T。在通用载体的基础上构建了用于插入失活aprE基因的PLC-IaprE-T整合载体和用于插入失活nprE基因的PLC-InprE-T整合载体。构建路线如图5所示。

PLC-T整合载体的具体构建过程如下：

以P43-F(SEQ IDNO.9)/P43-R(SEQ IDNO.10)为引物，以BS168基因组DNA为模板PCR扩增P43启动子基因；以LacI-F(SEQ ID NO.11)/LacI-R(SEQ ID NO.12)为引物，以质粒pMUTIN4(BGSC，含有LacI结构基因)为模板扩增包括终止子在内的LacI基因；以P43基因和LacI基因为模板通过SOE-PCR技术扩增获得P43-LacI自主表达框，LacI基因受P43启动子控制，组成型表达。将P43-LacI表达框亚克隆至pMD19-T载体，验证并测序正确后命名为pMD19-T-P43-LacI，于-20℃条件下保存备用。

以CM-F(SEQ ID NO.5)/CM-R(SEQ ID NO.6)为引物，以pJC164.3质粒为模板，PCR扩增CM表达元件，扩增产物用BamHI/XhoI双酶切，与经过相同双酶切处理的pMD19-T-P43-LacI载体，用T4DNA连接，即获得PLC-T载体，酶切验证正确后于-20℃条件下保存备用。

PLC-IaprE-T整合载体的具体构建过程如下：

以aprE-F(SEQ ID NO.15)/aprE-R(SEQ ID NO.16)为引物，B.subtilis基因组为模板PCR获得该段基因，亚克隆至pMD19-T载体，验证测序正确后，命名为aprE-T。通过基因分析软件，在基因内部找到HindIII可做为插入子(IS)的合适酶切插入位点。以YH-F(SEQ ID NO.19)/YH-R(SEQID NO.20)为引物，以酵母(NCBI，EU882859)基因组为模板PCR扩增获得YH序列做为IS，两端带有HindIII酶切位点。用HindIII酶切处理YH，与同样经过HindIII处理的aprE-T用T4DNA酶连接，得到载体IaprE-T。该载体内，aprE基因内部插入了YH序列，产生了插入失活效应，YH两侧的aprE序列即可做为后续的同源交换片段。

IaprE-T载体用BamHI酶切处理，割胶回收得到IaprE基因片段，与同样经过BamHI酶切处理的PLC-T载体用T4DNA酶连接，酶切电泳验证正确后，即得到用于插入失活BS168aprE基因的整合载体PLC-IaprE-T。

PLC-InprE-T整合载体的具体构建过程如下：

以nprE-F(SEQ ID NO.13)/nprE-R(SEQ ID NO.14)为引物，B.subtilis 168基因组为模板PCR获得该段基因，亚克隆至pMD19-T载体，验证测序正确后，命名为nprE-T。通过基因分析软件，在基因内部找到BglII可做为插入子(IS)的合适酶切插入位点。以YB-F(SEQ ID NO.17)/YB-R(SEQID NO.18)为引物，以酵母(NCBI，EU882859)基因组为模板PCR扩增获得YB序列做为IS，两端带有BglII酶切位点。用BglII酶切处理YH，与同样经过BglII处理的nprE-T用T4DNA酶连接，得到载体InprE-T。该载体内，nprE基因内部插入了YH序列，产生了插入失活效应，YB两侧的nprE序列即可做为后续的同源交换片段。

IaprE-T载体用BamHI酶切处理，割胶回收得到InprE基因片段，与同样经过BamHI酶切处理的PLC-T载体用T4DNA酶连接，酶切电泳验证正确后，即得到用于插入失活枯草芽孢杆菌168nprE基因的整合载体PLC-InprE-T。

(2)BS-PS菌株aprE、nprE蛋白酶基因的插入失活

将含有蛋白酶插入失活的整合载体PLC-InprE-T电转化入BS-PS菌株，发生同源重组过程。如图6(a)所示，第一次单交换，产生一过渡菌株BS-PS-PI，赋予宿主氯霉素抗性特征，可通过氯霉素抗性平板进行筛选阳性重组子，同时宿主还会产生另一个重要生理特征，即赖氨酸营养缺陷，这是由于载体上的LacI基因作用于Pspac启动子，从而抑制了LysA基因的表达，突变菌株不能在基本培养基上生长；如图6(b)所示，由于此时两个同源臂的存在，在没有CM抗性筛选压力下，丰富培养基中多次传代培养后，将会发生第二次单交换，由于交换事件可发生在两个同源臂中的任何一个，所以交换后的基因型有两种，一种是整合载体序列全部交换丢失的基因型即产生了回复突变，另一种是我们希望得到的基因修饰菌株。这两种交换结果都会使宿主恢复自我合成赖氨酸的能力，即能够通过基本培养基筛选出发生了第二次单交换的菌株。这两种单交换产生的基因型可以通过PCR技术加以区分，设计用来扩增靶基因的引物，以基因经过改造的菌株基因组为模板扩增出来的条带比以回复突变菌株基因组为模板扩增的条带多出插入序列的大小。通过此方法最终达到无抗生素抗性筛选标记的基因整合筛选。

(3)蛋白酶失活菌株的生理验证

无抗生素标记基因失活菌株生理验证：BS-PS、BS-PS-In(基因失活，目的菌株)、BS-PS-PI菌株(过渡菌株)划线于同一MM(基本培养基平板)上，BS-PS-PI菌株不能生长，是由于该菌株基因组整合LacI基因，LacI对控制LysA基因表达的启动子Pspac有抑制作用，平板上会出现少数几个菌落的原因是LacI与Pspac结合的不牢固，或者是在生长压力下，发生了单交换过程，长出的菌落可能是BS-PS或BS-PS-In基因型菌株。三种菌株均能在MM+赖氨酸的平板上生长。三种菌株中只有BS-PS-PI菌株能够在MM+CM平板上生长，BS-PS菌株和BS-PS-PI菌株均在发生交换的过程中，CM基因被置换掉，达到无抗生素基因残留的目的。

(4)蛋白酶失活菌株的分子验证

对nprE蛋白酶基因(BS-PS-nI菌株)失活过程的分子验证(图7)，以nprE-F(SEQ ID NO.13)/nprE-R(SEQ IDNO.14)为引物，分别以枯草芽孢杆菌168基因组DNA(lane 1，1400bp)，BS-PS基因组DNA(lane 2，1400bp)，PLC-InprE基因组DNA(lane 3，1800bp)，BS-PS-PI基因组DNA(lane 4，1400bp and 1800bp)和BS-PS-nI基因组DNA(lane 5，1800bp)为模板进行PCR扩增，扩增出与预期结果大小一致的产物。图8是对aprE蛋白酶基因(BS-PS-nI-aI菌株)失活过程的分子验证，以aprE-F/aprE-R为引物，以BS168基因组DNA(lane 1，800bp)，BS-PS-nI基因组DNA(lane 2，800bp)，PLC-IaprE基因组DNA(lane 3，1200bp)，BS-PS-nI-PI基因组DNA(lane 4，800bp和1200bp)和BS-PS-nI-aI基因组DNA(lane 5，1200bp)模板进行PCR扩增，扩增出与预期结果大小一致的产物。

(5)蛋白酶失活菌株的生化验证

无抗生素标记基因失活菌株生化验证：对BS-PS-In-Ia突变菌株插入失活后的InprE和IaprE进行基因序列和读码框的分析，从理论上分析得出BS-PS菌株天然nprE蛋白酶分子量为53.7kD，天然aprE蛋白酶分子量为36.1kD。对两个基因进行插入失活后，由于读码框的改变，BS-PS-In-Ia菌株InprE分子量为26.7kD，IaprE分子量为16.2kD。

为了验证理论上对两个蛋白酶分子量变化的推测，将BS-PS-In-Ia菌株摇瓶培养，发酵液离心上清液浓缩后，以BS-PS菌株为对照，进行SDS-PAGE电泳分析。结果为BS-PS-In-Ia样品在53kD和36kD位置比泳道1少了两个蛋白条带，而在26kD和16kD位置比泳道1多了两个蛋白条带(图9)。因此验证了论证上对两个蛋白分子量变化的推测。

Claims

1.一种无抗生素抗性标记的条件赖氨酸营养缺陷型枯草芽孢杆菌构建方法，其特征在于包括下述步骤：

(1)分别构建SpovAF-CM-Lys和SpovAF-Pspac-Lys同源交换片段；

(2)利用所述的SpovAF-CM-Lys转化枯草芽孢杆菌168感受态细胞，发生一次双交换，该菌株基因组上LysA基因天然启动子被置换为含有终止子的CM基因，得到赖氨酸营养缺陷型突变菌株BS-CM；

(3)利用所述的SpovAF-Pspac-Lys转化BS-CM感受态细胞，发生一次双交换，所述的CM基因被替换为受LacI基因抑制调节的Pspac启动子，得到无抗生素抗性标记的条件赖氨酸营养缺陷型枯草芽孢杆菌BS-PS。

2.根据权利要求1所述的无抗生素抗性标记的条件赖氨酸营养缺陷型枯草芽孢杆菌构建方法，其特征在于所述的SpovAF-CM-Lys同源交换片段通过如下步骤得到：

(4)以spoVAF-F(SEQ ID NO.1)为上游引物，LysA-R(SEQ ID NO.4)为下游引物，以步骤(3)所述pMD19-T-S-C-L载体为模板PCR扩增得到SpovAF-CM-LysA同源交换片段。

3.根据权利要求1所述的无抗生素抗性标记的条件赖氨酸营养缺陷型枯草芽孢杆菌构建方法，其特征在于所述的SpovAF-Pspac-LysA同源交换片段通过如下步骤得到：

(4)以spoVAF-F(SEQ ID NO.1)为上游引物，LysA-R(SEQ ID NO.4)为下游引物，以步骤(3)所述pMD19-T-S-P-L载体为模板PCR扩增得到SpovAF-Pspac-LysA同源交换片段。

4.一种利用无抗生素抗性标记基因筛选技术筛选靶基因失活的枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于包括如下步骤：

(2)构建插入失活靶基因的同源整合载体；

5.根据权利要求4所述的利用无抗生素抗性标记基因筛选技术筛选靶基因失活的枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于步骤(2)所述的插入失活靶基因的同源整合载体通过如下方法构建：

(2)构建插入插入子的失活枯草芽孢杆菌168靶基因；

6.根据权利要求4所述的利用无抗生素抗性标记基因筛选技术筛选靶基因失活的枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于步骤(3)所述的PCR鉴定方法为设计扩增靶基因的引物，分别以靶基因失活的无抗生素抗性标记基因的枯草芽孢杆菌突变株基因组和枯草芽孢杆菌回复突变菌株基因组为模板进行PCR扩增，以靶基因失活的无抗生素抗性标记基因的枯草芽孢杆菌突变株基因组为模板扩增出来的条带比以枯草芽孢杆菌回复突变菌株基因组为模板扩增的条带多出插入序列的大小。

7.根据权利要求4～6任一项所述的利用无抗生素抗性标记基因筛选技术筛选靶基因失活的枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于所述的靶基因为蛋白酶基因。

8.根据权利要求7所述的利用无抗生素抗性标记基因筛选技术筛选靶基因失活的枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于所述的靶基因为nprE基因或aprE基因。