CN105331601B - 一种基于自然转化的副猪嗜血杆菌高效遗传重组方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于自然转化的副猪嗜血杆菌高效遗传重组方法及应用，属于细菌遗传改造技术领域。本发明中通过在上游引物中添加USS序列ACCGCTTG，使的PCR产物含有这个USS序列，副猪嗜血杆菌会识别并带入菌体内部进行重组，无需构建突变常用的自杀质粒，本方法把抗性基因直接引入到PCR产物中，直接用PCR产物就能实现筛选，同时在引物中引入USS，细菌就会直接吞噬这个重组模版用于同源重组。本发明的基于自然转化的副猪嗜血杆菌高效遗传重组方法在构建副猪嗜血杆菌双组分系统突变体中应用。

Description

一种基于自然转化的副猪嗜血杆菌高效遗传重组方法及应用

技术领域

本发明属于细菌遗传改造技术领域，特别涉及一种基于自然转化的副猪嗜血杆菌高效遗传重组方法及应用。

背景技术

同源重组技术常用于细菌基因功能研究或遗传改造，同源重组技术是利用已构建好的带有目标基因敲除盒的外源质粒载体通过一定方式引入菌体细胞，带有同源序列的片段会与目标基因进行同源配对，在多个重组相关蛋白的作用下实现DNA片段交换，从而实现细菌目标基因改造的目的。要实现外源质粒载体的导入通常用到接合转移，电击转化或自然转化等方法，其中自然转化是指菌体高效吸收和整合外源核酸DNA的能力，一般认为自然转化能力的出现是细菌利用外源DNA作为营养物质或修复自身基因组损伤的一种机制。利用自然转化的特性，至今已证实有多种细菌能通过这种方式成功实现基因定向突变，是实现细菌遗传研究的有效手段之一。

目前，大部分关于副猪嗜血杆菌(H.parasuis)突变体的构建主要是通过自然转化的方法实现的，Bigas等首先发现H.parasuis存在环腺苷酸(cAMP)依赖的自然转化现象，能获取含有吸收信号序列(uptake signal sequence，USS)的外源核酸片段，利用此特性，Bigas等首次在H.parasuis上构建出了胸苷酸合成酶(thyA)基因缺失突变株。

随后有多项研究通过自然转化的方法构建多个H.parasuis突变体，包括外膜蛋白ompP2和ompP5基因，脂寡糖合成相关基因opsX、rfaF和waaQ，半乳糖代谢相关基因galUE以及细胞肿胀毒素基因cdtABC，此外还有多个致病相关基因，并证实这些基因与H.parasuis抗补体或粘附入侵相关，为H.parasuis致病机理的研究提供了可靠的遗传研究方法。

本技术在利用自然转化的基础上进一步优化重组方法，进一步提高副猪嗜血杆菌遗传改造效率。

发明内容

为克服上述现有技术中存在的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种基于自然转化的副猪嗜血杆菌高效遗传重组方法。本发明的遗传重组方法无需构建载体，也不需要电击，直接用PCR产物跟菌混合完成；克服了传统遗传重组方法中需要构建载体和点击转化等繁琐步骤。

本发明的另一目的在于提供上述的基于自然转化的副猪嗜血杆菌高效遗传重组方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种基于自然转化的副猪嗜血杆菌高效遗传重组方法，具体包括以下步骤：

1)以副猪嗜血杆菌基因组为模板，设计重组目标基因的上臂扩增引物对和下臂扩增引物对，分别扩增获得目标基因上臂片段和目标基因下臂片段，其中所述的上臂扩增引物对的上游引物中包含USS序列(uptake specific sequence)；

2)扩增获得抗性标记基因，所述的抗性标记基因的前端序列与目标基因上臂片段后端序列存在部分重叠，所述的抗性标记基因的后端序列与目标基因下臂片段前端存在部分重叠片段，以目标基因上臂片段的上游扩增引物和目标基因下臂片段的下游扩增引物进行重叠PCR扩增，获得依次排列有USS序列、目标基因上臂片段、抗性标记基因和目标基因下臂片段的重组片段PCR产物；

3)将步骤2)获得重组片段与受体副猪嗜血杆菌进行自然转化，经过对抗性标记基因的筛选，获得副猪嗜血杆菌的重组突变体。

步骤1)中所述的USS序列为ACCGCTTG。

步骤1)中所述的目标基因优选为副猪嗜血杆菌的qseC、qseB、arcA、arcB、cpxR和cpxA等基因。

步骤2)中所述的抗性标记基因优选为GmR抗性标记基因或KanR抗性标记基因中的一种。

步骤3)中所述的自然转化，具有步骤如下：将受体副猪嗜血杆菌接种于TSA平板，含5％CO₂培养箱37℃培养24h，之后用TSB把菌体从平板中冲洗下来，用TSB培养基把菌体浓度调整为10⁹cfu/ml；取20μL菌液置于TSA平板上，加入1μg步骤2)获得的重组片段PCR产物，用接种环混合后置于培养箱中37℃培养5h，之后用TSB再次把菌体洗下，离心，去上清后加入100μL TSB培养基悬浮菌体，然后把菌液涂布在含有Gm的TSA平板上，37℃培养2天，完成自然转化，同时用TE buffer做阴对照。

上述的基于自然转化的副猪嗜血杆菌高效遗传重组方法应用于构建副猪嗜血杆菌(H.parasuis)双组分系统突变体。

作为优选的实施方式，以双组分系统qseC突变体的构建方法为例，具体步骤如下：

1)以副猪嗜血杆菌基因组为模板，设计重组qseC基因的上臂扩增引物对和下臂扩增引物对，分别扩增获得qseC基因上臂片段和qseC基因下臂片段，其中所述的上臂扩增引物对的上游引物中包含USS序列(uptake specific sequence)；所述的上臂扩增引物对为：

P1(qseC-up-F)：ACCGCTTGTAAATACCAGTTTGCGTTTTC；

P2(qseC-up-R)：ATGTCAATTCGGGATCCGCGCACACAATCAAGCCCAATAA；

所述的下臂扩增引物对为：

P3(qseC-down-F)：GATCGGCTTCGTCGACACGTAGGATGGAGATATAAGGCAC；

P4(qseC-down-R)：TGCCAACAGCAATCACAGTA；

2)扩增获得GmR抗性标记基因，所述的GmR抗性标记基因的前端序列与qseC基因上臂片段后端序列存在部分重叠，所述的GmR抗性标记基因的后端序列与qseC基因下臂片段前端存在部分重叠片段，以qseC基因上臂片段的上游扩增引物P1(qseC-up-F)和qseC基因下臂片段的下游扩增引物P4(qseC-down-R)进行重叠PCR扩增，获得依次排列有USS序列、目标基因上臂片段、抗性标记基因和目标基因下臂片段的重组片段PCR产物；

3)将步骤2)获得重组片段与受体副猪嗜血杆菌进行自然转化，经过对抗性标记基因的筛选，获得副猪嗜血杆菌的重组qseC突变体。

步骤1)中所述的USS序列为ACCGCTTG。

步骤3)中所述的自然转化，具有步骤如下：将受体副猪嗜血杆菌接种于TSA平板，含5％CO₂培养箱37℃培养24h，之后用TSB把菌体从平板中冲洗下来，用TSB培养基把菌体浓度调整为10⁹cfu/ml；取20μL菌液置于TSA平板上，加入1μg步骤2)获得的重组片段PCR产物，用接种环混合后置于培养箱中37℃培养5h，之后用TSB再次把菌体洗下，离心，去上清后加入100μL TSB培养基悬浮菌体，然后把菌液涂布在含有Gm的TSA平板上，37℃培养2天，完成自然转化，同时用TE buffer做阴对照。

上述重组方法中，所用的特异性引物是本发明人根据NCBI数据库上的测序菌株SH0165的序列进行设计所得。

上述重组方法中，本发明人提取的H.parasuis基因组DNA作为模版，参照TaKaRaEx Taq聚合酶的使用说明进行PCR扩增，PCR产物或酶切产物按照Gel Extraction Kit(Omega Inc)试剂盒说明进行回收得到重组基因。

其余双组分系统突变株包括qseB、arcA、arcB、cpxR和cpxA的构建用相同的方法，不同的是用KanR抗性基因替代GmR，获得Km抗性的突变体。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明中通过在上游引物中添加USS序列(ACCGCTTG)，使的PCR产物含有这个USS序列，副猪嗜血杆菌会识别并带入菌体内部进行重组，无需构建突变常用的自杀质粒，自杀质粒是指载体不能在菌体中复制，只有发生重组的菌才能获得抗性基因，才能生存，本方法把抗性基因直接引入到PCR产物中，直接用PCR产物就能实现筛选，同时在引物中引入USS，细菌就会直接吞噬这个重组模版用于同源重组。

1.本发明的遗传重组方法无需构建任何载体，能快速高效实现副猪嗜血杆菌突变体的构建；

2.本发明的遗传重组方法实现更简便的转化，无需做感受态，无需电击，直接混合，然后涂板，经抗性筛选即可获得副猪嗜血杆菌突变体；

3.本发明成功构建了多个副猪嗜血杆菌双组分系统突变体，说明此方法可靠性高，能有效实现目的基因的靶向突变。

4.本发明多种抗性突变体的成功构建，说明此方法能灵活利用抗性标记基因，为多基因敲除研究提供技术基础。

附图说明

图1为qseC突变株PCR鉴定图；其中A为PCR鉴定的原理图；B为PCR鉴定产物的电泳结果图；泳道1，qseC突变株Gm抗性基因扩增；泳道2，野生菌株SC096Gm抗性基因扩增；泳道M，DNA分子量Marker；泳道3，用引物P1与P238从qseC突变株扩增突变株特征片段；泳道4，用引物P1与P238从SC096扩增突变株特征片段。

图2qseB突变株PCR鉴定；其中A为PCR鉴定的原理图；B为PCR鉴定产物的电泳结果图；泳道1，用引物P21与P254从qseB突变株扩增突变株特征片段；泳道2，用引物P21与P254从SC096扩增突变株特征片段；泳道M，DNA分子量Marker。

图3cpxA或cpxR突变株PCR鉴定；其中A为PCR鉴定的原理图；B为PCR鉴定产物的电泳结果图；泳道1，用引物P9与P254从cpxA突变株扩增突变株特征片段；泳道2，用引物P9与P254从SC096扩增突变株特征片段；泳道3，用引物P5与P254从cpxA突变株扩增突变株特征片段；泳道4，用引物P5与P254从SC096扩增cpxR突变株特征片段；泳道M，DNA分子量Marker。

图4arcA或arcB突变株PCR鉴定；其中A为PCR鉴定的原理图；B为PCR鉴定产物的电泳结果图；泳道1，用引物P14与P254从arcA突变株扩增突变株特征片段；泳道2，用引物P14与P254从SC096扩增突变株特征片段；泳道3，用引物P17与P254从arcB突变株扩增突变株特征片段；泳道4，用引物P17与P254从SC096扩增突变株特征片段；泳道M，DNA分子量Marker。

图5重组基因扩增示意图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1基于自然转化的副猪嗜血杆菌高效遗传重组qseC的方法

(1)特异性引物设计

根据NCBI数据库所公开的副猪嗜血杆菌测序菌株SH0165的序列进行引物设计。以目的基因qseC为例，选取靶基因上臂序列约500bp及下臂序列约500bp作为特异性引物设计的目标，所设计的引物如表1的P1～P4所示，特征是带有自然转化所必须的核酸获取特殊序列USS(Uptake Specific Sequence,具体序列为ACCGCTTG)以及重叠PCR所需要的各种互补序列。

其中，qseC基因的上臂序列如下：

aaataccagtttgcgttttcgcttgatgatcgtgatttcttgcacggcgttgcttatttggcttgtatccactgcagtggcgtgggtgcaagttcgtcacgaagttgatgaagtgtttgatgctcaacaggtgctgtttgctcaacgtttggcctcttcagatttacgcacattattgatggaacgtaagccacaacggactttcaacggcgaacaccataaaaaatcttttaaaaagatcgctttcgatgatgatgctctggcatttgctatctttaatgcccaaggggaaaggatattgagcgacgggcataatggtgcaaactttccatttaaaagagccagtggttttaccaaatcccgacttaatcacgaagatgaagacgagtggcgaattttttggctacctataggtgatcgtttttttgtggcggtcggtcaagagcaagattatcgagatgatctggttcaaggaatggtgtttagccaaatgtggatttggttcgccagtttgccgttattattgggcttgattgtgtg

qseC基因的下臂序列如下：

aggatggagatataaggcacaaacggtgtgagccgtttcaaacctaactaagcaggtgtttgttgttgctcgatgtattggcgaataatcgaaatgggcgcattaccgcggcaggcatcaaatccgcagaattaaacagttctgcggttctgctcgttttgtgtttaatcgggcgttgacttggtaaaatgagcaatacgaagtagcctattgagaacaataggagctagtaggaattctcgccttttatagcggagagtacgtcaatcaatatctcctagactatattaacaaaatttttctcttcccccttgaaatttccagatagagatctaataattactttctattactatagttatttctaattacaataatgaggagttattcaatgaaaattcgtcctttacacgacaaagtaattttaaagcgtgaagaaatcgaaactaaatctgcaggtggtatcgttttaactggctctgcggcaactaaatctactcgtggtactgtgattgctgttggca

(2)副猪嗜血杆菌(H.parasuis)双组分系统qseC突变体的构建

首先用P1/P2和P3/P4引物扩增qseC上臂序列和qseC下臂序列，用P237和P238引物(如表1中所示)以载体p34s-Gm作为模板扩增GmR抗性标记基因，以上述三个片段作为模板，用引物P1和P4进行重叠PCR扩增，所获得PCR产物经过切胶回收纯化后用于自然转化。所述特异性引物其核苷酸序列如表1所示。自然转化方法：将受体菌接种于TSA平板，含5％CO₂培养箱37℃培养24h，之后用TSB把菌体从平板中冲洗下来，用TSB培养基把菌体浓度调整为10⁹cfu/ml；取20μL菌液置于TSA平板上，加入10μL上述PCR产物，用接种环混合后置于培养箱中37℃培养5h，之后用TSB再次把菌体洗下，离心，去上清后加入100μL TSB培养基悬浮菌体，然后把菌液涂布在含有Gm的TSA平板上，37℃培养2天，同时用TE buffer做阴对照。

扩增获得的GmR抗性标记基因的序列如下：

cgaattgacataagcctgttcggttcgtaaactgtaatgcaagtagcgtatgcgctcacgcaactggtccagaaccttgaccgaacgcagcggtggtaacggcgcagtggcggttttcatggcttgttatgactgtttttttgtacagtctatgcctcgggcatccaagcagcaagcgcgttacgccgtgggtcgatgtttgatgttatggagcagcaacgatgttacgcagcagcaacgatgttacgcagcagggcagtcgccctaaaacaaagttaggtggctcaagtatgggcatcattcgcacatgtaggctcggccctgaccaagtcaaatccatgcgggctgctcttgatcttttcggtcgtgagttcggagacgtagccacctactcccaacatcagccggactccgattacctcgggaacttgctccgtagtaagacattcatcgcgcttgctgccttcgaccaagaagcggttgttggcgctctcgcggcttacgttctgcccaggtttgagcagccgcgtagtgagatctatatctatgatctcgcagtctccggcgagcaccggaggcagggcattgccaccgcgctcatcaatctcctcaagcatgaggccaacgcgcttggtgcttatgtgatctacgtgcaagcagattacggtgacgatcccgcagtggctctctatacaaagttgggcatacgggaagaagtgatgcactttgatatcgacccaagtaccgccacctaacaattcgttcaagccgagatcggcttc

构建的副猪嗜血杆菌(H.parasuis qseC)突变体，通过敲除盒的构建，自然转化，抗性平板筛选，获得带有庆大霉素抗性的阳性菌落，对阳性克隆进行PCR鉴定，结果如图1所示，用Gm检测引物对突变体进行鉴定，只有qseC突变株能扩出约750bp的Gm基因条带，而野生菌株扩增不出任何条带，证明qseC突变体带有Gm抗性基因，同时，用qseC敲除盒的上臂片段的上游引物和Gm基因的下游引物对突变体进行确认，qseC敲除盒的上游片段大小约500bp，Gm抗性基因的片段大小约700bp，理论上突变体应该能扩增出约1200bp左右的特征条带，从图中可以看到只有qseC突变株能扩增出约1200bp左右的敲除盒条带，而野生菌株不能扩增出相应的特征条带，证明qseC突变体构建成功。

实施例2副猪嗜血杆菌(H.parasuis)遗传重组方法可靠性的验证

为了进一步确认遗传重组方法的可靠性，本研究进一步构建qseB、cpxA、cpxR、arcA和arcB突变体(扩增引物见表1的P5～P24)，用KanR基因替代Gm抗性基因，按照实施例1的方法,首先用特异性的引物扩增目的基因上臂序列和下臂序列，用设计的引物KM-F和KM-R(见表1中所示)扩增KanR基因，再以上述三个片段作为模板，进行重叠PCR扩增。所获得PCR产物经过切胶回收纯化后用于自然转化。自然转化方法：将受体菌接种于TSA平板，含5％CO₂培养箱37℃培养24h，之后用TSB把菌体从平板中冲洗下来，用TSB培养基把菌体浓度调整为10⁹cfu/ml；取20μL菌液置于TSA平板上，加入10μL上述PCR产物，用接种环混合后置于培养箱中37℃培养5h，之后用TSB再次把菌体洗下，离心，去上清后加入100μL TSB培养基悬浮菌体，然后把菌液涂布在含有KanR的TSA平板上，37℃培养2天，同时用TE buffer做阴对照。

通过卡那霉素抗性平板筛选，结果如图2至图4所示，利用目的基因敲除盒的上游片段的正向引物和KanR的反向引物进行检测，目标基因敲除盒上游片段约500bp而KanR基因约1000bp左右，因此理论上突变体应该能扩增出1500bp左右的特征条带，从图中可以看到，相应突变体均能扩增出敲除盒特征条带，而野生菌株则不能，证明突变体构建成功。

表1 PCR扩增过程中所用引物

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种基于自然转化的副猪嗜血杆菌高效遗传重组方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

1)以副猪嗜血杆菌基因组为模板，设计重组目标基因的上臂扩增引物对和下臂扩增引物对，分别扩增获得目标基因上臂片段和目标基因下臂片段，其中所述的上臂扩增引物对的上游引物中包含USS序列；

2)扩增获得抗性标记基因，所述的抗性标记基因的前端序列与目标基因上臂片段后端序列存在部分重叠，所述的抗性标记基因的后端序列与目标基因下臂片段前端存在部分重叠片段，以目标基因上臂片段的上游扩增引物和目标基因下臂片段的下游扩增引物进行重叠PCR扩增，获得依次排列有USS序列、目标基因上臂片段、抗性标记基因和目标基因下臂片段的重组片段PCR产物；

3)将步骤2)获得重组片段与受体副猪嗜血杆菌进行自然转化，经过对抗性标记基因的筛选，获得副猪嗜血杆菌的重组突变体；

步骤3)中所述的自然转化，具有步骤如下：将受体副猪嗜血杆菌接种于TSA平板，含5％CO₂培养箱37℃培养24h，之后用TSB把菌体从平板中冲洗下来，用TSB培养基把菌体浓度调整为10⁹cfu/ml；取20μL菌液置于TSA平板上，加入1μg步骤2)获得的重组片段PCR产物，用接种环混合后置于培养箱中37℃培养5h，之后用TSB再次把菌体洗下，离心，去上清后加入100μL TSB培养基悬浮菌体，然后把菌液涂布在含有Gm的TSA平板上，37℃培养2天，完成自然转化，同时用TE buffer做阴对照。

2.根据权利要求1所述的基于自然转化的副猪嗜血杆菌高效遗传重组方法，其特征在于：步骤1)中所述的USS序列为ACCGCTTG。

3.根据权利要求1所述的基于自然转化的副猪嗜血杆菌高效遗传重组方法，其特征在于：步骤1)中所述的目标基因为副猪嗜血杆菌的qseC、qseB、arcA、arcB、cpxR和cpxA基因。

4.根据权利要求1所述的基于自然转化的副猪嗜血杆菌高效遗传重组方法，其特征在于：步骤2)中所述的抗性标记基因为GmR抗性标记基因或KanR抗性标记基因中的一种。

5.权利要求1～4任一项所述的基于自然转化的副猪嗜血杆菌高效遗传重组方法在构建副猪嗜血杆菌双组分系统突变体中应用。

6.根据权利要求1所述的基于自然转化的副猪嗜血杆菌高效遗传重组方法，其特征在于：具体步骤如下：

1)以副猪嗜血杆菌基因组为模板，设计重组qseC基因的上臂扩增引物对和下臂扩增引物对，分别扩增获得qseC基因上臂片段和qseC基因下臂片段，其中所述的上臂扩增引物对的上游引物中包含USS序列；所述的上臂扩增引物对为：

P1(qseC-up-F)如SEQ NO ID：1所示；

P2(qseC-up-R)如SEQ NO ID：2所示；

所述的下臂扩增引物对为：

P3(qseC-down-F)如SEQ NO ID：3所示；

P4(qseC-down-R)如SEQ NO ID：4所示；

2)扩增获得GmR抗性标记基因，所述的GmR抗性标记基因的前端序列与qseC基因上臂片段后端序列存在部分重叠，所述的GmR抗性标记基因的后端序列与qseC基因下臂片段前端存在部分重叠片段，以qseC基因上臂片段的上游扩增引物P1(qseC-up-F)和qseC基因下臂片段的下游扩增引物P4(qseC-down-R)进行重叠PCR扩增，获得依次排列有USS序列、目标基因上臂片段、抗性标记基因和目标基因下臂片段的重组片段PCR产物；

3)将步骤2)获得重组片段与受体副猪嗜血杆菌进行自然转化，经过对抗性标记基因的筛选，获得副猪嗜血杆菌的重组qseC突变体。

7.根据权利要求6所述的基于自然转化的副猪嗜血杆菌高效遗传重组方法，其特征在于：步骤1)中所述的USS序列为ACCGCTTG，

步骤3)中所述的自然转化，具有步骤如下：将受体副猪嗜血杆菌接种于TSA平板，含5％CO₂培养箱37℃培养24h，之后用TSB把菌体从平板中冲洗下来，用TSB培养基把菌体浓度调整为10⁹cfu/ml；取20μL菌液置于TSA平板上，加入1μg步骤2)获得的重组片段PCR产物，用接种环混合后置于培养箱中37℃培养5h，之后用TSB再次把菌体洗下，离心，去上清后加入100μL TSB培养基悬浮菌体，然后把菌液涂布在含有Gm的TSA平板上，37℃培养2天，完成自然转化，同时用TE buffer做阴对照。