CN103130879B - 跨膜转运蛋白及其编码基因和它们的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种跨膜转运蛋白，其中，该跨膜转运蛋白具有SEQ ID No：2所示的氨基酸序列，或者该跨膜转运蛋白具有将SEQ ID No：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加后仍具有跨膜转运蛋白活性的氨基酸序列。此外，还涉及该跨膜转运蛋白的编码基因，其中，该基因具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，或者该基因具有编码SEQ ID No：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。还涉及含有该跨膜转运蛋白基因的重组载体和细胞，以及该跨膜转运蛋白及其编码基因含有该基因的重组载体及细胞在培育具有耐碱性转基因生物中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种跨膜转运蛋白，还涉及该跨膜转运蛋白的编码基因，以及含有该跨膜转运蛋白基因的重组载体和细胞，以及该跨膜转运蛋白及其编码基因含有该基因的重组载体及细胞在培育具有耐碱性转基因生物中的应用。
背景技术
维生素B12、柠檬酸等大分子穿越细菌的外膜并不是一件简单的事，细胞必需对物质进行选择性吸收，而且外膜没有任何向胞内拉动大分子的产能细胞器。最新研究表明，这些大分子的运输就是依赖于跨膜转运蛋白(TonB)的外膜转运系统。
这种TonB依赖性运输机(TonB-dependent transporter，TBDT)含有一个beta-barrel结构域和一个luminal结构域，beta-barrel结构域是一串并联片形成允许大分子通过的通道，luminal结构域在细胞允许大分子通过之前一直阻塞barrel。晶体学研究结果显示，TonB与luminal结构域的一端相结合。研究人员推测TonB可能是将luminal结构域从barrel拔出来，或者改变lumina结构域的形状为大分子的通过开辟道路。
发明内容
本发明的发明人基于对跨膜转运蛋白的分子生物学研究，意外地发现从嗜碱单胞菌(Alkalimonas amylolytica N10，CGMCC NO.0463)中得到了一种跨膜转运蛋白(TonB)及其编码基因，另一方面还提供了含有该跨膜转运蛋白基因的重组载体和细胞，以及该跨膜转运蛋白及其编码基因含有该基因的重组载体及细胞在培育具有耐碱性转基因生物中的应用。
本发明提供了一种跨膜转运蛋白，其中，该跨膜转运蛋白具有SEQ IDNo：2所示的氨基酸序列，或者该跨膜转运蛋白具有将SEQ ID No：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加后仍具有跨膜转运蛋白活性的氨基酸序列。
本发明还提供了一种跨膜转运蛋白蛋白基因，其中，该基因具有SEQ IDNo：1所示的核苷酸序列，或者该基因具有编码SEQ ID No：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
另外，本发明还提供了一种重组载体，其中，该重组载体含有本发明提供的编码跨膜转运蛋白的基因。
本发明还提供了一种转基因细胞，其中，该转基因细胞含有本发明提供的编码跨膜转运蛋白的基因。
本发明还提供了跨膜转运蛋白及其编码基因、含有该基因的重组载体及转基因细胞在培育具有耐碱性转基因生物中的应用。
跨膜转运蛋白TonB在耐碱植物培育等方面具有重要的应用潜力。通过克隆得到跨膜转运蛋白TonB基因，并通过转基因的操作将微生物来源的跨膜转运蛋白TonB导入到植物细胞中，获得耐碱性提高的转基因植株成为可能。
附图说明
图1显示了重组载体pUC18-Aan10-tonB导入的大肠杆菌K12(pUC18-Aan10-tonB)的耐碱性的测定结果，其中，将重组载体pUC18-Aan10-tonB导入的大肠杆菌K12(pUC18-Aan10-tonB)分别接种到pH为8.0、8.5、9.0和9.5(含有50mM的CAPS、HEPES和TRICINE，5N NaOH调节)的LB液体培养基中(100μg/ml氨苄青霉素)，培养12小时后测定OD600，以导入pUC18空载体的大肠杆菌K12为对照(每组三个平行)。
图2显示了跨膜转运蛋白缺失的大肠杆菌K12(ΔtonB)以及导入重组载体pUC18-Aan10-tonB的K12(ΔtonB)(pUC18-Aan10-tonB)耐碱性的测定结果，其中，将导入重组载体pUC18-Aan10-tonB的K12(ΔtonB)(pUC18-Aan10-tonB)和跨膜转运蛋白缺失的大肠杆菌K12(ΔtonB)分别接种到pH为8.0、8.5、9.0和9.5(含有50mM的CAPS、HEPES和TRICINE，5N NaOH调节)的LB液体培养基中，培养12小时后测定OD600，以大肠杆菌K12为对照(每组三个平行)。
具体实施方式
以下本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种跨膜转运蛋白，其中，该跨膜转运蛋白具有SEQ IDNo：2所示的氨基酸序列，或者该跨膜转运蛋白具有将SEQ ID No：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加后仍具有跨膜转运蛋白活性的氨基酸序列。优选地，所述跨膜转运蛋白具有SEQ ID No：2所示的氨基酸序列。
相应地，本发明还提供了一种编码跨膜转运蛋白的基因，其中，该基因具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，或者该基因具有编码SEQ ID No：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。优选地，所述基因具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。
本发明提供的跨膜转运蛋白(TonB)基因是从嗜碱单胞菌(Alkalimonasamylolytica N10，CGMCC NO.0463)中克隆得到的。
此外，本发明还提供了一种重组载体，其中，该重组载体含有本发明提供的编码跨膜转运蛋白的基因。
在本发明中，所述“载体”可选用本领域已知的各种载体，如市售的各种质粒，粘粒，噬菌体及反转录病毒等。本发明优选大肠杆菌pUC18质粒。
本发明还提供了一种转基因细胞，其中，该转基因细胞含有本发明提供的跨膜转运蛋白基因。所述转基因细胞为原核细胞或真核细胞，优选可以是大肠杆菌、枯草杆菌或烟草BY2细胞，最优选大肠杆菌。
此外，本发明还提供了所述跨膜转运蛋白及其编码基因、及含有跨膜转运蛋白基因的重组载体和转基因细胞在培育具有耐碱性转基因生物中的应用。优选地，所述跨膜转运蛋白具有SEQ ID No：2所示的氨基酸序列，或者该跨膜转运蛋白具有将SEQ ID No：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加后仍具有跨膜转运蛋白活性的氨基酸序列。更优选地，所述跨膜转运蛋白TonB具有SEQ ID No：2所示的氨基酸序列。所述跨膜转运蛋白的编码基因具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，或者该基因具有编码SEQ ID No：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。更优选地，所述基因具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。优选情况下，所述生物为植物或微生物。
实施例1
编码跨膜转运蛋白(TonB)的核苷酸序列的克隆
(1)嗜碱单胞菌(Alkalimonas amylolytica N10，CGMCC NO.0463)总DNA的提取和纯化
取嗜碱单胞菌(Alkalimonas amylolytica N10，CGMCC NO.0463)的新鲜湿菌体20克，悬于10毫升50毫摩尔/升Tris缓冲液中(pH 8.0)，加入少量溶菌酶和8毫升0.25毫摩尔/升乙二胺四乙酸(EDTA)(pH 8.0)，混匀后于37℃放置20分钟，然后加入2毫升10％十二烷基硫酸钠(SDS)，55℃放置5分钟，分别用等体积酚、氯仿各抽提一次，取最后一次抽提的上清溶液，加入2倍体积乙醇，沉淀DNA。将沉淀回收的DNA先后用70体积％乙醇溶液和无水乙醇洗涤后，将所得DNA溶于0.5毫升TE缓冲液(pH 8.0，10毫摩尔/升Tris，1毫摩尔/升EDTA)，加入10毫克/毫升RNA酶(RNase)3微升，37℃保温1小时，分别用等体积酚、氯仿各抽提一次，取上清液加入2倍体积乙醇，沉淀回收DNA，先后用70体积％乙醇溶液和无水乙醇洗涤后，真空干燥DNA沉淀，用去离子水溶解，得总DNA溶液。DNA溶液的紫外分光光度计测定结果为A260/A280＝1.818，A260/A230＝2.052。
(2)跨膜转运蛋白基因的克隆
分析嗜碱单胞菌(Alkalimonas amylolytica N10，CGMCC NO.0463)的基因组信息后，设计跨膜转运蛋白基因的上下游引物，其中上游引物为5’-TATGACCATGATTACCATGCTTAACAATAAAATG-3’，下游引物为5’-CAGGTCGACTCTAGATTACTCCGCTGCG-3’。通过高保真的核酸聚合酶Pyrobest(Takara)，以上述提取的嗜碱单胞菌(Alkalimonas amylolytica N10，CGMCC NO.0463)基因组为模板扩增出跨膜转运蛋白TonB基因的全长。通过1％琼脂糖凝胶电泳检测目的基因的大小，并将PCR产物送至诺赛基因公司测序，最后得到774bp的如SED ID NO：1所示的核苷酸序列。
实施例2编码跨膜转运蛋白的基因功能验证
(1)重组克隆载体pUC18-Aan10-tonB的构建
利用Cycle-pure Kit纯化上述得到的PCR产物。利用Fast clone Kit将纯化的PCR产物和pUC18连接，将构建好的重组载体pUC18-Aan10-tonB通过化学转化法导入到大肠杆菌K12 BW25113中。通过含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板的筛选以及PCR验证得到含有重组载体pUC18-Aan10-tonB插入的阳性克隆大肠杆菌K12(pUC18-Aan10-tonB)，经测序证实pUC18-Aan10-tonB插入的扩增序列与跨膜转运蛋白的核苷酸序列完全一致。
(2)大肠杆菌K12 BW25113跨膜转运蛋白缺失体的构建
通过设计含有待敲除基因的上下游同源臂的DNA片段的引物扩增打靶基因，利用大肠杆菌入噬菌体具有和宿主不同的λRed重组系统将目的基因快速准确的敲除。通过敲除大肠杆菌K12 BW2511的跨膜转运蛋白基因，得到大肠杆菌K12 BW25113跨膜转运蛋白基因(ΔtonB)完全缺失的突变体E.coli K12(ΔtonB)，跨膜转运蛋白基因被卡那霉素基因取代。
(3)重组载体pUC18-Aan10-tonB导入的大肠杆菌K12(pUC18-Aan10-tonB)的耐碱性的测定
将重组载体pUC18-Aan10-tonB导入的大肠杆菌K12(pUC18-Aan10-tonB)分别接种到pH为8.0、8.5、9.0和9.5(含有50mM的CAPS、HEPES和TRICINE，5N NaOH调节)的LB液体培养基中(100μg/ml氨苄青霉素)，培养12小时后测定OD600，以导入pUC18空载体的大肠杆菌K12为对照(每组三个平行)，结果如图1所示。
(4)跨膜转运蛋白缺失的大肠杆菌K12(ΔtonB)以及导入重组载体pUC18-Aan10-tonB的K12(ΔtonB)(pUC18-Aan10-tonB)耐碱性的测定
将导入重组载体pUC18-Aan10-tonB的K12(ΔtonB)(pUC18-Aan10-tonB)和跨膜转运蛋白缺失的大肠杆菌K12(ΔtonB)分别接种到pH为8.0、8.5、9.0和9.5(含有50mM的CAPS、HEPES和TRICINE，5N NaOH调节)的LB液体培养基中，培养12小时后测定OD600，以大肠杆菌K12为对照(每组三个平行)，结果如图2所示。
从图1中可以看出，导入重组载体pUC18-Aan10-tonB的大肠杆菌K12在pH为8.0、8.5、9.0和9.5的LB液体培养基中(100μg/ml氨苄青霉素)，12小时后测定OD600明显高于导入pUC18空载体的大肠杆菌K12，这也证明了编码跨膜转运蛋白的基因(Aan10-tonB)的导入能够提高大肠杆菌K12的耐碱性。
从图2中可以看出，导入重组载体pUC18-Aan10-tonB的大肠杆菌K12(ΔtonB)在pH 8.0，8.5，9.0和9.5(含有50mM CAPS，HEPES和TRICINE，5N NaOH调节)的LB液体培养基中，12小时后测定OD600明显高于导入大肠杆菌跨膜转运蛋白的缺失体K12(ΔtonB)，这也证明了编码跨膜转运蛋白的基因(Aan10-tonB)的导入能够提高大肠杆菌K12(ΔtonB)的耐碱性。
综上所述，本申请提供的跨膜转运蛋白基因在耐碱生物的培育等方面具有重要的应用潜力。通过克隆编码跨膜转运蛋白的基因，并通过转基因的操作将微生物来源的跨膜转运蛋白导入到植物细胞中，获得耐碱性提高的转基因植株成为可能。
Claims (7)
1.一种跨膜转运蛋白，其特征在于，该跨膜转运蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No：2所示的氨基酸序列。
2.一种编码跨膜转运蛋白的基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列为编码SEQ ID No：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的基因，其中，该基因的核苷酸序列为SEQ IDNo：1所示的核苷酸序列。
4.一种重组载体，其特征在于，该重组载体含有权利要求2或3所述的基因。
5.一种转基因细胞，其特征在于，该转基因细胞含有权利要求2或3所述的基因。
6.根据权利要求5所述的转基因细胞，其中，所述转基因细胞为原核细胞或真核细胞。
7.权利要求1所述的跨膜转运蛋白、权利要求2或3所述的基因、权利要求4所述的重组载体、权利要求5或6所述的转基因细胞在培育具有耐碱性转基因大肠杆菌中的应用。
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| Comparative analysis of membranous proteomics of shewanella decolorationis S12 grown with azo compound of FE(III) citrate as sole terminal electron acceptor;Wang bo等;《Appl microbiol biotechnol》;20101231;第86卷;1513-1523 * |
| Exploring membrane and cytoplasm proteomic responses of alkalimonas amylolytica N10 to differet external pHs with combination strategy of de novo peptide sequencing;Wang Q.等;《proteomics》;20091231;第9卷;1254-1273 * |
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| 王全会 等.嗜碱菌Alkalimonas amylolytica N10在不同pH条件下的膜蛋白差异表达研究.《微生物学报》.2006,第46卷(第2期),263-268. |
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