CN103087159B - 钠氢泵蛋白及其编码基因和它们的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种钠氢泵蛋白，其中，该钠氢泵蛋白具有SEQ ID No：2所示的氨基酸序列，或者该钠氢泵蛋白具有将SEQ ID No：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加后仍具有钠氢泵蛋白活性的氨基酸序列。此外，还涉及钠氢泵蛋白的编码基因，其中，该基因具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，或者该基因具有编码SEQ ID No：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。还涉及含有钠氢泵基因的重组载体和细胞，以及钠氢泵蛋白及其编码基因含有该基因的重组载体及细胞在培育具有耐盐性和耐碱性转基因生物中的应用。

Description

钠氢泵蛋白及其编码基因和它们的应用
技术领域
本发明涉及一种钠氢泵蛋白，还涉及钠氢泵蛋白的编码基因，以及含有钠氢泵基因的重组载体和细胞，以及钠氢泵蛋白及其编码基因含有该基因的重组载体及细胞在培育具有耐盐性和耐碱性转基因生物中的应用。
背景技术
钠氢泵(Na+/H+antiporter)是细胞中负责Na+/H+交换的一种跨膜运输蛋白，广泛存在于细菌、人和高等植物的质膜及许多真核生物细胞器的膜中。质膜H+-ATPase用水解ATP的能量把H+从细胞质中泵出细胞，产生跨质膜的H+电化学势梯度，提供能量，驱动质膜上的钠氢泵蛋白，使H+顺其电化学势进入细胞，同时Na+逆其电化学势排出细胞。钠氢泵蛋白通过Na+外排来保持细胞内的低Na+水平和pH值的稳定，是生物细胞耐受盐碱的关键因子，另外它在细胞器的发生及离子均衡过程中，还执行体积和渗透调节的功能，是保持细胞离子均衡的关键因子。
发明内容
本发明的发明人基于对钠氢泵的分子生物学研究，意外地发现从嗜碱芽孢杆菌(N16-5，CGMCC NO.0369)中得到了一种钠氢泵蛋白及其编码基因，另一方面还提供了含有钠氢泵基因的重组载体和细胞，以及钠氢泵蛋白及其编码基因含有该基因的重组载体及细胞在培育具有耐盐性和耐碱性转基因生物中的应用。
本发明提供了一种钠氢泵蛋白，其中，该钠氢泵蛋白具有SEQ ID No：2所示的氨基酸序列，或者该钠氢泵蛋白具有将SEQ ID No：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加后仍具有钠氢泵蛋白活性的氨基酸序列。
本发明还提供了一种钠氢泵基因，其中，该基因具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，或者该基因具有编码SEQ ID No：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
另外，本发明还提供了一种重组载体，其中，该重组载体含有本发明提供的钠氢泵基因。
本发明还提供了一种转基因细胞，其中，该转基因细胞含有本发明提供的钠氢泵基因。
本发明还提供了得到的钠氢泵蛋白及其编码基因、含有该基因的重组载体及转基因细胞在培育具有耐盐性和耐碱性转基因生物中的应用。
钠氢泵蛋白在耐盐碱植物培育等方面具有重要的应用潜力。通过克隆得到钠氢泵基因，并通过转基因的操作将微生物来源的钠氢泵基因导入到植物细胞中，获得耐盐碱性提高的转基因植株成为可能。
附图说明
图1显示了重组载体pUC18-Bsp165-NhaC导入的大肠杆菌K12(pUC18-Bsp165-NhaC)的耐碱性的测定结果，其中，将重组载体pUC18-Bsp165-NhaC导入的大肠杆菌K12(pUC18-Bsp165-NhaC)分别接种到pH为8.0、8.5、9.0和9.5(含有50mM的CAPS、HEPES和TRICINE，5N NaOH调节)的LB液体培养基中(100μg/ml氨苄青霉素)，培养12小时后测定OD600，以导入pUC18空载体的大肠杆菌K12为对照(每组三个平行)。
图2显示了重组载体pUC18-BspN165-NhaC导入的大肠杆菌K12(pUC18-BspN165-NhaC)的耐盐性的测定结果，其中，将重组载体pUC18-BspN165-NhaC导入的大肠杆菌K12(pUC18-BspN165-NhaC)分别接种到含有0、2％、4％、6％和8％的NaCl的LB液体培养基中(100μg/ml氨苄青霉素)，培养12小时后测定OD600，以导入pUC18空载体的大肠杆菌K12为对照(每组三个平行)。
图3显示了钠氢泵缺失的大肠杆菌KNabc以及导入重组载体pUC18-Bsp165-NhaC的KNabc(pUC18-Bsp165-NhaC)耐碱性的测定结果，其中，将导入重组载体pUC18-Bsp165-NhaC的KNabc(pUC18-Bsp165-NhaC)和钠氢泵缺失的大肠杆菌KNabc分别接种到pH为8.0、8.5、9.0和9.5(含有50mM的CAPS、HEPES和TRICINE，5N NaOH调节)的LB液体培养基中，培养12小时后测定OD600，以大肠杆菌K12为对照(每组三个平行)。
图4显示了钠氢泵蛋白缺失的大肠杆菌KNabc以及导入重组载体pUC18-BspN165-NhaC的KNabc(pUC18-BspN165-NhaC)耐盐性的测定结果，其中，将导入重组载体pUC18-BspN165-NhaC的KNabc(pUC18-BspN165-NhaC)和钠氢泵蛋白缺失的大肠杆菌KNabc分别接种到含有0、2％、4％、6％和8％的NaCl的LB液体培养基中，培养12小时后测定OD600，以大肠杆菌K12为对照(每组三个平行)。
具体实施方式
以下本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种钠氢泵蛋白，其中，该钠氢泵蛋白具有SEQ ID No：2所示的氨基酸序列，或者该钠氢泵蛋白具有将SEQ ID No：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加后仍具有钠氢泵蛋白活性的氨基酸序列。优选地，所述钠氢泵蛋白具有SEQ ID No：2所示的氨基酸序列。
相应地，本发明还提供了一种钠氢泵基因，其中，该基因具有SEQ IDNo：1所示的核苷酸序列，或者该基因具有编码SEQ ID No：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。优选地，所述基因具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。
本发明提供的钠氢泵基因是从嗜碱芽孢杆菌(N16-5，CGMCC NO.0369)中克隆得到的。
此外，本发明还提供了一种重组载体，其中，该重组载体含有本发明提供的钠氢泵基因。
在本发明中，所述“载体”可选用本领域已知的各种载体，如市售的各种质粒，粘粒，噬菌体及反转录病毒等。本发明优选大肠杆菌pUC18质粒。
本发明还提供了一种转基因细胞，其中，该转基因细胞含有本发明提供的钠氢泵基因。所述转基因细胞为原核细胞或真核细胞，优选可以是大肠杆菌、枯草杆菌或烟草BY2细胞，最优选大肠杆菌。
此外，本发明还提供了本发明提供的钠氢泵蛋白及其编码基因、及含有钠氢泵基因的重组载体和转基因细胞在培育具有耐盐性和耐碱性转基因生物中的应用。所述生物为植物或微生物。
实施例1
编码钠氢泵的核苷酸序列的克隆
(1)嗜碱芽孢杆菌(N16-5，CGMCC NO.0369)总DNA的提取和纯化
取嗜碱芽孢杆菌(N16-5，CGMCC NO.0369)的新鲜湿菌体20克，悬于10毫升50毫摩尔/升Tris缓冲液中(pH 8.0)，加入少量溶菌酶和8毫升0.25毫摩尔/升乙二胺四乙酸(EDTA)(pH 8.0)，混匀后于37℃放置20分钟，然后加入2毫升10％十二烷基硫酸钠(SDS)，55℃放置5分钟，分别用等体积酚、氯仿各抽提一次，取最后一次抽提的上清溶液，加入2倍体积乙醇，沉淀DNA。将沉淀回收的DNA先后用70体积％乙醇溶液和无水乙醇洗涤后，将所得DNA溶于0.5毫升TE缓冲液(pH 8.0，10毫摩尔/升Tris，1毫摩尔/升EDTA)，加入10毫克/毫升RNA酶(RNase)3微升，37℃保温1小时，分别用等体积酚、氯仿各抽提一次，取上清液加入2倍体积乙醇，沉淀回收DNA，先后用70体积％乙醇溶液和无水乙醇洗涤后，真空干燥DNA沉淀，用去离子水溶解，得总DNA溶液。DNA溶液的紫外分光光度计测定结果为A260/A280＝1.818，A260/A230＝2.052。
(2)钠氢泵基因的克隆
分析嗜碱芽孢杆菌(N16-5，CGMCC NO.0369)的基因组信息后，设计钠氢泵基因的上下游引物，其中上游引物为5’-TATGACCATGATTACGTGATTGCTTTGAAAG-3’，下游引物为5’-CAGGTCGACTCTAGACTAATATAAGGTCAC-3’。通过高保真的核酸聚合酶Pyrobest(Takara)，以上述提取的嗜碱芽孢杆菌(N16-5，CGMCC NO.0369)基因组为模板扩增出钠氢泵基因的全长。通过1％琼脂糖凝胶电泳检测目的基因的大小，并将PCR产物送至诺赛基因公司测序，最后得到2058bp的如SED ID NO：1所示的核苷酸序列。
实施例2编码钠氢泵的基因功能验证
(1)重组克隆载体pUC18-pUC18-Bsp165-NhaC的构建
利用Cycle-pure Kit纯化上述得到的PCR产物。利用Fast clone Kit将纯化的PCR产物和pUC18连接，将构建好的重组载体pUC18-Bsp165-NhaC通过化学转化法导入到大肠杆菌K12 BW25113中。通过含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板的筛选以及PCR验证得到含有重组载体pUC18-Bsp165-NhaC  插入的阳性克隆大肠杆菌K12(pUC18-Bsp165-NhaC)，经测序证实pUC18-Bsp165-NhaC插入的扩增序列与钠氢泵的核苷酸序列完全一致。
(2)大肠杆菌K12 BW25113钠氢泵缺失体的构建
通过设计含有待敲除基因的上下游同源臂的DNA片段的引物扩增打靶基因，利用大肠杆菌入噬菌体具有和宿主不同的λRed重组系统将目的基因快速准确的敲除。通过敲除大肠杆菌K12 BW2511的钠氢泵基因，得到大肠杆菌K12 BW25113钠氢泵基因完全缺失的突变体E.coli KNabc。
(3)重组载体pUC18-Bsp165-NhaC导入的大肠杆菌K12(pUC18-Bsp165-NhaC)的耐碱性的测定
将重组载体pUC18-Bsp165-NhaC导入的大肠杆菌K12(pUC18-Bsp165-NhaC)分别接种到pH为8.0、8.5、9.0和9.5(含有50mM的CAPS、HEPES和TRICINE，5N NaOH调节)的LB液体培养基中(100μg/ml氨苄青霉素)，培养12小时后测定OD600，以导入pUC18空载体的大肠杆菌K12为对照(每组三个平行)，结果如图1所示。
(4)重组载体pUC18-BspN165-NhaC导入的大肠杆菌K12(pUC18-BspN165-NhaC)的耐盐性的测定
将重组载体pUC18-BspN165-NhaC导入的大肠杆菌K12(pUC18-BspN165-NhaC)分别接种到含有0、2％、4％、6％和8％的NaCl的LB液体培养基中(100μg/ml氨苄青霉素)，培养12小时后测定OD600，以导入pUC18空载体的大肠杆菌K12为对照(每组三个平行)，结果如图2所示。
(5)钠氢泵缺失的大肠杆菌KNabc以及导入重组载体pUC18-Bsp165-NhaC的KNabc(pUC18-Bsp165-NhaC)耐碱性的测定
将导入重组载体pUC18-Bsp165-NhaC的KNabc(pUC18-Bsp165-NhaC)和钠氢泵缺失的大肠杆菌KNabc分别接种到pH为8.0、8.5、9.0和9.5(含有50mM的CAPS、HEPES和TRICINE，5N NaOH调节)的LB液体培养基中，培养12小时后测定OD600，以大肠杆菌K12为对照(每组三个平行)，结果如图3所示。
(6)钠氢泵蛋白缺失的大肠杆菌KNabc以及导入重组载体pUC18-BspN165-NhaC的KNabc(pUC18-BspN165-NhaC)耐盐性的测定
将导入重组载体pUC18-BspN165-NhaC的KNabc(pUC18-BspN165-NhaC)和钠氢泵蛋白缺失的大肠杆菌KNabc分别接种到含有0、2％、4％、6％和8％的NaCl的LB液体培养基中，培养12小时后测定OD600，以大肠杆菌K12为对照(每组三个平行)，结果如图4所示。
从图1中可以看出，导入重组载体pUC18-Bsp165-NhaC的大肠杆菌K12在pH为8.0、8.5、9.0和9.5的LB液体培养基中(100μg/ml氨苄青霉素)，12小时后测定OD600明显高于导入pUC18空载体的大肠杆菌K12，这也证明了钠氢泵基因(Bsp165-NhaC)的导入能够提高大肠杆菌K12的耐碱性。
从图2中可以看出，导入重组载体pU18-BspN165-NhaC的大肠杆菌K12(pUC18-BspN165-NhaC)在有0、2％、4％、6％和8％的NaCl的LB液体培养基中(100μg/ml氨苄青霉素)中培养12小时后测定OD600明显高于以导入pUC18空载体的大肠杆菌K12，这也证明了钠氢泵基因(Bsp165-NhaC)的导入能够提高大肠杆菌K12的耐盐性。
从图3中可以看出，导入重组载体pUC18-Bsp165-NhaC的大肠杆菌KNabc在pH 8.0，8.5，9.0和9.5(含有50mM CAPS，HEPES和TRICINE，5N NaOH调节)的LB液体培养基中，12小时后测定OD600明显高于导入大肠杆菌钠氢泵的缺失体KNabc，这也证明了钠氢泵基因(Bsp165-NhaC)的导入能够提高大肠杆菌KNabc的耐碱性。
从图4中可以看出，导入重组载体pUC18-BspN165-NhaC的KNabc(pUC18-BspN165-NhaC)在含有0、2％、4％、6％和8％的NaCl的LB液体培养基中培养12小时后测定OD600，明显高于钠氢泵蛋白缺失的大肠杆菌KNabc，这也证明了钠氢泵基因(Bsp165-NhaC)的导入能够提高大肠杆菌KNabc的耐盐性。
综上所述，本申请提供的钠氢泵基因在耐盐碱生物的培育等方面具有重要的应用潜力。通过克隆得到钠氢泵基因，并通过转基因的操作将微生物来源的钠氢泵导入到植物细胞中，获得耐盐碱性提高的转基因植株成为可能。

Claims (7)

1.一种钠氢泵蛋白，其特征在于，该钠氢泵蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo：2所示。
2.一种钠氢泵基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列为编码SEQ IDNo：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的基因，其中，该基因的核苷酸序列如SEQ IDNo：1所示。
4.一种重组载体，其特征在于，该重组载体含有权利要求2所述的基因。
5.一种转基因细胞，其特征在于，该转基因细胞含有权利要求2所述的基因。
6.根据权利要求5所述的转基因细胞，其中，所述转基因细胞为原核细胞或真核细胞。
7.权利要求1所述的钠氢泵蛋白、权利要求2所述的基因、权利要求4所述的重组载体、权利要求5所述的转基因细胞在培育具有耐盐性和耐碱性转基因微生物中的应用。
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