CN1958796A - 一种编码钠氢泵蛋白基因的核苷酸序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种编码钠氢泵蛋白(Na⁺/H⁺antiporter)的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列含有与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列。本发明还提供了包含所述核苷酸序列的重组载体，还涉及包括该重组载体的转化菌株。本发明所述编码钠氢泵蛋白(Na⁺/H⁺antiporter)的核苷酸序列在转化菌株中表达，大大提高了转化菌株的耐盐性。

Description

一种编码钠氢泵蛋白基因的核苷酸序列及其应用

技术领域

本发明涉及一种核苷酸序列及其应用。具体地说，本发明涉及一种编码钠氢泵蛋白基因核苷酸序列、含有该序列的重组载体宿主细胞和转基因生物，其表达的钠氢泵蛋白及它们的应用。

背景技术

钠氢泵(Na⁺/H⁺ antiporter)是细胞中负责Na⁺/H⁺交换的一种跨膜运输蛋白。1974年由Mitchell首次发现(Mitchell，1974.Biochem J.144：87-90)钠氢泵蛋白以来，在细菌、人和高等植物的质膜及许多真核生物细胞器的膜中，陆续发现钠氢泵(Na⁺/H⁺ antiporter)的存在，即钠氢泵蛋白在生物界普遍存在。质膜H⁺-ATPase用水解ATP的能量把H⁺从细胞质中泵出细胞，产生跨质膜的H+电化学势梯度，提供能量，驱动质膜上的钠钾泵蛋白，使H+顺其电化学势进入细胞，同时Na⁺逆其电化学势排出细胞。钠钾泵蛋白通过Na⁺外排来保持细胞内的低Na⁺水平和pH值的稳定，是生物细胞耐受盐碱的关键因子，另外它在细胞器的发生及离子均衡过程中，还执行体积和渗透调节的功能，是保持细胞离子均衡的关键因子(Etana Padan等，2001，Biochimicaet Biophysica Acta，1505：144-157)。

钠氢泵蛋白在医药、发酵、环保、耐盐碱植物培育等方面具有重要的应用潜力(Counillon和Pouyssegur，2000，J Biol Chem 275：1-4)。例如，克隆钠氢泵蛋白基因，并通过钠氢泵蛋白基因转化，获得耐盐性提高的转基因植物，对于盐渍化土壤的利用具有重要意义；克隆钠氢泵蛋白基因，并通过钠氢泵蛋白基因转化微生物，使之能在高Na⁺的环境中完成正常的降解污染物的功能，对于进行污水治理、加强环境保护有广阔前景。

CN 03114801.8通过提取甘蓝型油菜的总RNA，根据拟南芥钠氢泵蛋白氨基酸保守序列设计引物，进行甘蓝型油菜的钠氢泵蛋白cDNA全长克隆，并对所得甘蓝型油菜的钠氢泵蛋白基因进行基因序列信息与同源性分析，并将其转化到烟草细胞中，得到的烟草转基因植株对盐胁迫有抗性，可耐受200毫摩尔/升的氯化钠溶液灌溉。

US 2004040054通过建立盐土生小型藓类Physcomitrella patens的cDNA文库，分离出其钠氢泵蛋白编码基因，并将该基因转化到拟南芥、大豆、油菜、玉米中表达，提高它们的耐盐性。

上述两个专利的钠氢泵蛋白基因来自于植物，一方面分离所述基因的过程还需要建立cDNA文库，另一方面，上述专利所得的耐盐转化株，只在中性条件下具有较高耐盐活性，而在碱性条件下的耐盐活性不高。但是对于需要在盐碱条件进行的生物过程，要求钠氢泵蛋白在碱性条件下仍能保持耐盐活性，使转化有编码该种钠氢泵蛋白基因的转基因生物的耐盐性和耐碱性同时得到提高；即生物过程在盐碱环境中正常进行。现有的钠氢泵蛋白尚不能满足上述要求。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种编码钠氢泵蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列编码碱性条件下高活性的钠氢泵蛋白。

本发明的第二个目的是提供含有上述编码钠氢泵蛋白的核苷酸序列的重组载体。

本发明的第三个目的是提供含有上述重组载体的宿主细胞。

本发明的第四个目的是提供一种新的钠氢泵蛋白。

本发明的第五个目的是提供一种制备转钠氢泵基因生物的方法。

本发明提供了一种编码钠氢泵蛋白的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列含有与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列。

本发明还提供了一种含有本发明提供的核苷酸序列的重组载体。

本发明还提供了一种转化或转导或转染本发明提供的重组载体的宿主细胞。所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。

本发明还提供了一种钠氢泵蛋白多肽，其中，该钠氢泵蛋白多肽是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽、或其活性片段、或其活性衍生物；或其氨基酸序列中取代、插入、倒位或缺失一个或多个氨基酸而生成的功能相同的突变体或衍生物。

本发明还提供一种制备转钠氢泵基因生物的方法，其中，该方法包括：1)构建本发明提供的重组载体；2)将构建好的所述载体转化或转导或转染到宿主细胞中，制备转基因生物。

本发明从淀粉水解嗜碱单孢菌Alkalimonas amylolytica N10中克隆到在碱性条件下具有高活性的钠氢泵蛋白基因，通过构建含有该基因核苷酸序列表达载体转化大肠杆菌，表达所述钠氢泵蛋白，所得蛋白在pH为9.5以上的碱性环境中，仍保持良好的活性；根据本发明提供的方法，用本发明提供的编码淀粉水解嗜碱单孢菌钠氢泵蛋白及其突变体的基因，制备转基因生物如大肠杆菌，所得转化菌的可在盐浓度达到500毫摩尔/升的固体培养基上生长，而野生型的大肠杆菌在此培养基中不能生存。

附图说明

图1DNA印迹(Southern blot)照片；

图2蛋白质印迹(Western blot)照片；

图3转化本发明钠氢泵蛋白基因的大肠杆菌与空载体转化大肠杆菌的反向膜囊淬灭率随pH变化图；

图4转化本发明钠氢泵蛋白突变体基因的大肠杆菌与空载体转化大肠杆菌的反向膜囊淬灭率随pH变化图。

具体实施方式

本发明提供了一种编码钠氢泵蛋白的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列含有与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列。

所述“编码钠氢泵蛋白的核苷酸序列”是指编码具有钠氢泵活性的多肽的核苷酸序列，如序列表SEQ ID NO.1的核酸序列及其简并序列。该简并序列是指该序列中有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代而产生的序列。本领域技术人员公知组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除Met或Trp分别由ATG或TGG单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2～6个密码子编码(Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989，见950页附录D)，通过修改本发明提供的核酸序列，得到本发明的氨基酸序列。由于公知的密码子简并性，所以与SEQID NO.1核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列，本发明提供的核苷酸序列优选同源性至少80％的核苷酸序列，更优选同源性至少90％的核苷酸序列，最好是所述核苷酸序列具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

分离所述“编码钠氢泵蛋白的核苷酸序列”，可以采用基因文库或cDNA文库或噬菌体展示库等建库方法，然后可以采用公知的方法如功能互补筛选、根据已知氨基酸保守序列设计引物钓取目的基因、单克隆抗体筛选表达文库等公知的方法得到。本发明优选通过构建基因文库和功能互补筛选，从嗜碱杆菌Alkalimonas amylolytica N10分离得到编码钠氢泵基因(nhaD)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种含有本发明提供的核苷酸序列的重组载体。优选所述载体为重组质粒pL8、pA2或pETA2(见实施例1-3)。

在本发明中，所述“载体”可选用本领域已知的各种载体，如市售的各种质粒，粘粒，噬菌体及反转录病毒等。本发明优选大肠杆菌pUC18质粒。

本发明还提供了一种转化或转导或转染本发明提供的重组载体的宿主细胞。所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。优选可以是大肠杆菌，枯草杆菌，酵母，或各种动植物细胞。更优选所述宿主细胞为大肠杆菌。

本发明提供的钠氢泵蛋白多肽，具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽、或其活性片段、或其活性衍生物；或其氨基酸序列中添加、取代、插入、倒位或缺失一个或多个氨基酸而生成的功能相同的突变体或衍生物。

在本发明中，“钠氢泵蛋白多肽”是指具有钠氢泵活性的多肽，如具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽、或其活性片段、或其活性衍生物；或其氨基酸序列中添加、取代、插入、倒位或缺失一个或多个氨基酸而生成的功能相同的突变体或衍生物。所述多肽均具有与天然钠氢泵蛋白相同的功能，本发明提供的钠氢泵蛋白多肽还包括对SEQ ID NO.2中一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸得到的钠氢泵蛋白多肽。例如，为本领域所公知的，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能如II.Neurach和R.L.Hill在“蛋白质”一书中的描述(学术出版社，纽约，1979，见第14页图6)，比较广泛的替代有：Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Ser/Thr，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu，Asp/Gly以及反向替代。又如本发明中实施例描述的突变体，蛋白序列的327位甘氨酸Gly发生变异为丝氨酸Ser，其钠氢泵功能仍存在。

本发明所述“衍生物”指与SEQ ID NO.2所示的多肽或其突变体有氨基酸序列上的差异，也可以有不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。所述诱导变异体可以通过各种技术得到，如辐射或诱变剂等产生的随机突变，也可以通过如定点突变法或其他已知分子生物学的技术。所述“衍生物”还包括具有天然L型氨基酸的残基(如D型氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β-氨基酸、γ-氨基酸等)的类似物。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明所述钠氢泵蛋白多肽可以是本发明提供的核苷酸序列编码的多肽。可以通过遗传工程或分子生物学手段，将本发明所提供的核苷酸序列克隆到基因工程菌(如大肠杆菌等)，表达本发明涉及的钠氢泵蛋白。此外根据本发明提供的氨基酸序列，可以采用固相技术直接合成本发明提供的钠氢泵蛋白，固相技术直接合成本发明提供的钠氢泵蛋白可以在常规的条件进行。

本发明还提供一种制备转钠氢泵基因生物的方法，其中，该方法包括：1)构建本发明提供的重组载体；2)将构建好的所述载体转化或转导或转染到宿主细胞中，制备转基因生物。

本发明提供的核苷酸序列通常可以用PCR扩增法、重组法、或人工合成的方法获得。例如，本领域技术人员根据本发明所提供的核苷酸序列，可以很容易利用PCR进行扩增获得有关序列。序列较长时，可以进行两次或多次PCR扩增，然后将所得片段按正确次序拼接。

一旦获得了有关核苷酸序列，就可以用重组法大批量的获得有关核苷酸序列。通常将所得核苷酸序列克隆入载体，再转入基因工程菌中，然后通过常规的方法从增殖后的宿主细胞分离得到有关核苷酸序列。

此外，还可用公知的人工化学合成的方法来合成有关核苷酸序列。

下面的实施例将对本发明作进一步的描述。

实施例1淀粉水解嗜碱单孢菌Alkalimonas amylolytica N10编码钠氢泵蛋白核苷酸序列的克隆

(1)淀粉水解嗜碱单孢菌Alkalimonas amylolytica N10总DNA的提取和纯化。

本发明采用专性嗜碱革兰氏阴性菌，分离自中国内蒙古盐碱湖的淀粉水解嗜碱单孢菌Alkalimonas amylolytica N10，该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(保藏日期为2000年6月28日保藏号为CGMCC 0463)。

取淀粉水解嗜碱单孢菌Alkalimonas amylolytica N10的新鲜湿菌体20克，悬于10毫升50毫摩尔/升Tris缓冲液中(pH8.0)，加入少量溶菌酶和8毫升0.25毫摩尔/升乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)，混匀后于37℃放置20分钟，然后加入2毫升10％十二烷基硫酸钠(SDS)，55℃放置5分钟，分别用等体积酚、氯仿各抽提一次，取最后一次抽提的上清溶液，加入2倍体积乙醇，沉淀DNA。将沉淀回收的DNA先后用70体积％乙醇溶液和无水乙醇洗涤后，将所得DNA溶于0.5毫升TE缓冲液(pH8.0，10毫摩尔/升Tris，1毫摩尔/升EDTA)，加入10毫克/毫升RNA酶(RNase)3微升，37℃保温1小时，分别用等体积酚、氯仿各抽提一次，取上清液加入2倍体积乙醇，沉淀回收DNA，先后用70体积％乙醇溶液和无水乙醇洗涤后，真空干燥DNA沉淀，用去离子水溶解，得总DNA溶液。DNA溶液的紫外分光光度计测定结果为A₂₆₀/A₂₈₀＝1.98，A₂₆₀/A₂₃₀＝2.18。

(2)大肠杆菌钠氢泵(Na⁺/H⁺ antiporter)蛋白完全缺失突变体E.coliKNabc和部分缺失突变体E.coli EP432的制备以及E.coli KNabc的NaCl最小抑制浓度的测定。

敲除(基因敲除方法参考Li等，1999，FEBS Letters，456，13-16)正常大肠杆菌的3个Na⁺/H⁺ antiporter基因(ΔnhaA、ΔnhaB和ΔchaA)，得到的突变子大肠杆菌钠氢泵(Na⁺/H⁺ antiporter)蛋白完全缺失突变株E.coliKNabc，3个Na⁺/H⁺ antiporter基因被3个抗生素(氯霉素Cm、卡那霉素Km和红霉素6-Em)取代。同样方法敲除正常大肠杆菌的2个Na⁺/H⁺ antiporter基因(ΔnhaA和ΔnhaB)，分别用2个抗生素(卡那霉素和氯霉素)取代，得到的突变子大肠杆菌钠氢泵(Na⁺/H⁺ antiporter)蛋白部分缺失突变株E.coliEP432。

E.coli Knabc在pH为7.5的LB固体培养基培养时，其钠离子的最小抑制浓度是0.12摩尔/升，其锂离子的最小抑制浓度是5毫摩尔/升。当一个质粒携带Na⁺/H⁺ antiporter基因转入E.coli KNabc时，这个菌株对钠离子或锂离子的抗性能力提高，利用这个功能互补的方法可以克隆到编码的Na⁺/H⁺antiporter的基因。本发明采用含有0.2摩尔/升的NaCl或者10毫摩尔/升LiCl的固体平板培养来筛选阳性克隆。

(3)钠氢泵基因的克隆

取上述的总DNA溶液10微升(约50微克DNA)，用限制酶Sau3AI部分酶切，琼脂糖凝胶回收3-8kb的DNA片断。取5微克Sau3AI酶解DNA片段与1微克经BamHI酶解并脱磷酸化的质粒pUC18 DNA在20微升连接体系进行连接反应。连接体系在16℃反应16小时，转化感受态大肠杆菌KNabc后，在0.2摩尔NaCl或者10毫摩尔/升LiCl固体平板上筛选。从10毫摩尔/升LiCl固体平板上筛选得到一个含有钠氢泵基因的重组质粒。根据电泳结果证实插入DNA片段大小约为3.6kb。含该DNA片段的重组质粒称为pL8，含此重组质粒pL8的重组大肠杆菌称为大肠杆菌KNabcL8。采用Sanger双脱氧法对此DNA片段进行了测序。测序结果表明插入片段含有一个长1440bp的开放阅读框架(ORF)，即SEQ ID NO.1，编码一个由480个氨基酸组成的蛋白质(SEQ ID NO.2)。

实施例2钠氢泵基因突变体的制备

定点突变(金冬雁等译的分子克隆实验指南，1998，科学出版社)获得实施例1所得野生型钠氢泵基因的突变体，该突变体的核苷酸序列如SEQ IDNO.3。与野生型相比，该突变体基因的核苷酸序列在979位g突变为a，三联体密码子ggt变为agt，相应的氨基酸序列(如SEQ ID NO.4所示)327位氨基酸Gly变为Ser。按照实施例1所述的方法，制备含该突变DNA片段的重组质粒pZ2，含此重组质粒pZ2的重组大肠杆菌称为大肠杆菌KNabcZ2。

实施例3克隆载体和表达载体的构建

(1)克隆载体pA2和pA2N3的构建

根据SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列(nhaD序列)，设计引物，并在PCR引物上加上SacI和XbaI酶切位点，正向引物为NhaD-F-SacI(5’ACTG GAGCTCAAATAGCCCAGATTGG3’)，反向引物为NhaD-R-XbaI(5’ATCG TCTAGAGGTTTAGTCGTAGATATG3’)。以菌株N10的总DNA或质粒pL8为模板，利用常规PCR方法扩增全长nhaD序列，将PCR产物和pGEM3Zf(+)都用SacI和XbaI双酶切，连接，构建成pA2载体，测序证实pA2插入的扩增序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列完全一致。pA2N3构建与pA2类似，只是以质粒pZ2为模板，测序证实pA2N3插入的扩增序列与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列完全一致。

(2)表达载体pETA2和pETA2N3的构建

根据SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列(nhaD序列)，设计引物，并在PCR引物上加上XbaI和XhoI酶切位点，正向引物(5’-GGTTCTAGACGCTAAACGCTGTGCTACAA-3’)，反向引物(5’-TGCCTCGAGGTCGTAGATATGAAACAAGTCTGC-3’)。以质粒pL8为模板，利用常规PCR方法扩增全长nhaD序列，将PCR产物和pET21b(+)都用XbaI和XhoI双酶切，连接，构建成pETA2载体，测序证实pA2插入的扩增序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列完全一致。pETA2N3构建与pETA2类似，只是以质粒pZ2为模板，测序证实pETA2插入的扩增序列和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列(nhaD序列)完全一致。

实施例4DNA印迹法(Southern blot)杂交检测NhaD基因

将筛选到含有NhaD基因的pL8质粒用BamHI酶切，回收来源于NhaD基因的片段，用非放射性的地高辛进行标记，制备成DNA探针(用Roche公司的地高辛标记试剂盒)。同时选择两种不同的限制性内切酶将淀粉水解嗜碱单孢菌Alkalimonas amylolytica N10菌株和E.coli的基因组进行完全酶切，经1％的琼脂糖凝胶电泳后，转移到硝酸纤维素膜上，用上面制备好的探针进行DNA印迹法(Southern blot)测试(参见金冬雁等译的分子克隆实验指南，1998，科学出版社)，如图1所示，泳道1和泳道3为大肠杆菌的染色体DNA，泳道2和泳道4为淀粉水解嗜碱单孢菌Alkalimonas amylolyticaN10的基因组DNA，泳道5为pL8质粒DNA；结果证实重组质粒pL8中插入的DNA片段来自淀粉水解嗜碱单孢菌Alkalimonas amylolytica N10的染色体DNA。

实施例5蛋白质印迹法(Western blot)杂交检测NhaD表达

将构建好的表达载体转入E.coli C43(DE3)，在37℃下液体LB培养基中培养。当菌浓度达到OD₆₀₀为0.6时，用0.7毫摩尔/升异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导过夜。制备反向膜囊(参考Ambudkar等的方法：Ambudkar.1984.J.Biol.Chem.259：6142-6146)，将细胞膜用20％甘油、50毫摩尔/升Tris-HCl(pH8.0)和300毫摩尔/升NaCl溶液构成的缓冲液悬浮，用Lowry法定量。抽提膜蛋白质终浓度采用10毫克/毫升上述的缓冲液稀释，加入终浓度为1重量％十二烷基麦芽糖苷(lauroyl maltoside)(LM)，0.2毫摩尔/升苯甲基磺酰氟(PMSF)，搅拌2个小时，超速离心，40000重力加速度，90分钟，收集超离上清，用镍柱纯化，MicroBCA试剂盒定量(Pierce，美国)，样品做蛋白质印迹法(Western blot)测试(参见金冬雁等译的分子克隆实验指南，1998，科学出版社)。样品用12％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，转移到硝酸纤维素膜，用INDIA抗组氨酸(anti-His)探针检测(Pierce，美国)。如图2所示，泳道1为标准蛋白分子量Marker；泳道2、泳道4和泳道6为野生型NhaD；泳道3、泳道5和泳道7为突变体NhaDG327S；泳道2和泳道3上样量为10微克，泳道4和泳道5上样量为20微克；泳道6和泳道7上样量为50微克；结果显示钠氢泵基因(nhaD或突变nhaD)在重组菌中得到了表达。

实施例6.钠氢泵性质的测定

重组质粒转入E.coli EP432，提取转化子的反向膜囊(参考Ambudkar等的方法：Ambudkar.1984.J.Biol.Chem.259：6142-6146)，Na⁺/H⁺泵活性通过吖啶橙的荧光淬灭来检测(参考Goldberg等，的方法：Goldberg等，1987.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：2615-2619)。待测反应体系为2毫升，含有50毫摩尔/升1，3双三(羟甲基)甲胺基丙烷(1，3-Bis[tria(hydroxymethyl)methylamino]propane)(Roche，瑞士)缓冲液、140毫摩尔/升胆碱盐酸盐(choline chloride)、5毫摩尔/升氯化镁、1微摩尔/升吖啶橙(AO)，和60微克反向膜囊.和不同浓度梯度的NaCl(0-1.0摩尔/升)，pH梯度7.0-9.5。

活性测定表明野生型NhaD有Na⁺/H⁺ antiporter和Li⁺/H⁺ antiporter活性，不具有K⁺/H⁺ antiporter活性。该钠氢泵蛋白具有特殊的性质，pH8.5以上时才有活性，最适pH大于9.5，并且其最适活性在600毫摩尔/升NaCl(如图3所示，三角形代表野生型NhaD，圆圈是空载体。空心表示在10毫摩尔/升NaCl条件，实心表示在600毫摩尔/升NaCl条件)。突变体NhaD-G327S在pH8.5时有活性，最适活性在pH9，10毫摩尔/升NaCl(如图4所示，正方形表示突变体，圆圈是空载体。空心表示在10毫摩尔/升NaCl条件，实心表示在600毫摩尔/升NaCl条件)。在pH为9时，突变体钠氢泵的活性明显高于野生型，但在pH9.5，600毫摩尔/升NaCl时小于野生型，这也说明野生型钠氢泵可在碱性和高浓度的盐环境中保持活性。

实施例7钠氢泵功能互补实验

将实施例3构建好的两种表达载体以及空载体分别转入E.coli Knabc中，在液体LB培养基中37℃下培养24小时，挑取种子液在含不同NaCl浓度梯度的LB固体培养基(0-1.0摩尔/升)中37℃下培养24小时，以含无插入片断的空载体的转化E.coli Knabc为对照，结果表明，该转化编码钠氢泵蛋白及其突变体基因的E.coli Knabc最高耐受盐(NaCl)浓度达0.5摩尔/升，而含空质粒的E.coli Knabc的最高耐盐(NaCl)浓度仅为0.18摩尔/升。

               SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院微生物研究所

<120>一种编码钠氢泵蛋白基因的核苷酸序列及其应用

<130>I5643ZKW

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1440

<212>DNA

<213>淀粉水解嗜碱单孢菌N10(Alkalimonas amylolytica N10)

<400>1

ctccgttgcg tgtcgtggtt ggctggtttg ctgtgtctgc tattcagcac accggttttt    60

gctgcatccg ccgctccact tgatttaaca agctcccttg ttggttttgt ctgtattgct    120

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ttccccgctt tggttaatta cctgatcccg gctgcggtca tgagcttttt tgtcgagaaa    720

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gctgagtggg acaccttgtt atttttctat ggaatcgtga tgtgtgtggg cgggttaggc    1080

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gtgcttgcga tgcagcctga gatgtcgcat ggtcattggt tgctgatcac cttaaccgct    1260

ggtgttggtg gcagtttgct gtcgatagga tccgccgctg gcgtggcatt gatggggcag    1320

gcgcgaggtt attacacctt ttttggacac ctgaagtggg cgccggtgat tttcattggc    1380

tacattgcca gcattgcagt gcatttgtgg ctaaatgcag acttgtttca tatctacgac    1440

<210>2

<211>480

<212>PRT

<213>淀粉水解嗜碱单孢菌N10(Alkalimonas amylolytica N10)

<400>2

Leu Arg Cys Val Ser Trp Leu Ala Gly Leu Leu Cys Leu Leu Phe Ser

1               5                   10                  15

Thr Pro Val Phe Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Asp Leu Thr Ser Ser

            20                  25                  30

Leu Val Gly Phe Val Cys Ile Ala Ile Phe Val Val Ala Tyr Val Leu

        35                  40                  45

Val Met Gly Glu Glu Lys Leu His Met Arg Lys Ser Lys Pro Val Leu

    50                  55                  60

Val Ala Ala Gly Leu Ile Trp Ile Leu Ile Gly Trp Val Tyr Ile Ser

65                  70                  75                  80

Arg Asp Ile Pro Asp Val Thr Glu Ala Ala Phe Arg His Asn Leu Leu

                85                  90                  95

Glu Phe Ala Glu Leu Met Leu Phe Leu Leu Val Ala Met Thr Tyr Ile

            100                 105                 110

Asn Ala Leu Glu Glu Arg Arg Leu Phe Asp Ala Leu Arg Ala Trp Met

        115                 120                 125

Ile Arg Lys Gly Phe Ser Tyr Gln Asn Leu Phe Trp Ile Thr Gly Phe

    130                 135                 140

Leu Ser Phe Phe Ile Ser Pro Ile Ala Asp Asn Leu Thr Thr Ala Leu

145                 150                 155                 160

Leu Met Cys Ala Val Val Met Lys Val Ala Glu Gly Asp Lys Arg Phe

                165                 170                 175

Ile Asn Leu Cys Cys Val Asn Ile Val Ile Ala Ala Asn Ala Gly Gly

            180                 185                 190

Ala Phe Ser Pro Phe Gly Asp Ile Thr Thr Leu Met Val Trp Gln Ala

        195                 200                 205

Gly Leu Val Arg Ile Asp Glu Phe Leu Val Leu Phe Phe Pro Ala Leu

    210                 215                 220

Val Asn Tyr Leu Ile Pro Ala Ala Val Met Ser Phe Phe Val Glu Lys

225                 230                 235                 240

Arg Gln Pro Ser Ala Val Tyr Glu Asp Val Glu Leu Lys Arg Gly Ala

                245                 250                 255

Leu Arg Ile Leu Thr Leu Phe Leu Leu Thr Val Ala Thr Ala Val Leu

            260             265                     270

Cys His Ser Leu Leu His Leu Pro Pro Val Leu Gly Met Met Met Gly

        275                 280                 285

Leu Gly Tyr Leu Gln Phe Phe Gly Tyr Phe Leu Arg Met Thr Leu Pro

    290                 295                 300

Gly Ser Leu Ala Arg Lys Arg Ala Met Ala Glu Arg Glu Gly Asp Gln

305                 310                 315                 320

Glu Lys Leu Lys Arg Leu Gly Gly Val Val Pro Phe Asp Val Phe Ser

                325                 330                 335

Arg Val Ser Arg Ala Glu Trp Asp Thr Leu Leu Phe Phe Tyr Gly Ile

            340                 345                 350

Val Met Cys Val Gly Gly Leu Gly Phe Leu Gly Tyr Leu Gly Leu Met

        355                 360                 365

Ser Asp Leu Leu Tyr Glu Gly Trp Asn Pro Thr Ser Ala Asn Ile Leu

    370                 375                 380

Leu Gly Val Ile Ser Ala Val Ile Asp Asn Ile Pro Val Met Phe Ala

385                 390                 395                 400

Val Leu Ala Met Gln Pro Glu Met Ser His Gly His Trp Leu Leu Ile

            405                 410                 415

Thr Leu Thr Ala Gly Val Gly Gly Ser Leu Leu Ser Ile Gly Ser Ala

            420                 425                 430

Ala Gly Val Ala Leu Met Gly Gln Ala Arg Gly Tyr Tyr Thr Phe Phe

        435                 440                 445

Gly His Leu Lys Trp Ala Pro Val Ile Phe Ile Gly Tyr Ile Ala Ser

    450                 455                 460

Ile Ala Val His Leu Trp Leu Asn Ala Asp Leu Phe His Ile Tyr Asp

465                 470                 475                 480

<210>3

<211>1440

<212>DNA

<213>淀粉水解嗜碱单孢菌N10(Alkalimonas amylolytica N10)

<400>1

ctccgttgcg tgtcgtggtt ggctggtttg ctgtgtctgc tattcagcac accggttttt    60

gctgcatccg ccgctccact tgatttaaca agctcccttg ttggttttgt ctgtattgct    120

atttttgtcg tcgcttatgt gttggtgatg ggcgaagaaa aacttcatat gcgtaaatcc    180

aagccggtgt tggtcgctgc tggtttaatc tggatcctta ttggctgggt ttacatcagc    240

cgtgatattc cggatgtcac cgaggcagca tttcgccata acctgcttga attcgctgag    300

ctaatgctat tccttttggt cgcaatgaca tacatcaacg cgctggaaga acggcgatta    360

tttgatgcat tgcgggcttg gatgatacgt aagggcttta gttaccagaa tctattttgg    420

atcaccggct tcctgtcgtt ctttatttct ccaattgctg acaacctgac cacagccttg    480

ttgatgtgtg ctgtggtgat gaaagtggcc gaaggagata aacgttttat caacctctgc    540

tgtgtcaata ttgtcattgc tgctaatgcg ggtggtgcct tcagtccgtt tggcgatatc    600

accacgctga tggtgtggca ggccggcctg gttcgcattg atgagttcct ggtgttgttc    660

ttccccgctt tggttaatta cctgatcccg gctgcggtca tgagcttttt tgtcgagaaa    720

aggcaaccat ccgcagtcta cgaagatgtc gagttaaaac gtggcgcgct gcgtattctt    780

actttatttc tgttgactgt tgcgacggct gtgctgtgcc atagcttact gcatttaccc    840

cctgttctgg gcatgatgat gggcctcggt tacctgcagt tcttcggcta tttcctgcgc    900

atgaccttgc ctggatcgtt agcacgtaaa agggcaatgg ccgagcgtga aggcgatcag    960

gagaaactga agcgcctcag tggcgtggtg cctttcgatg ttttcagccg tgtatcgcgg    1020

gctgagtggg acaccttgtt atttttctat ggaatcgtga tgtgtgtggg cgggttaggc    1080

tttctgggct atcttggttt gatgtctgat ttattgtacg agggctggaa tccgacctcg    1140

gccaacattc tgctgggcgt catctcagcg gtcatcgata acatcccagt gatgttcgca    1200

gtgcttgcga tgcagcctga gatgtcgcat ggtcattggt tgctgatcac cttaaccgct    1260

ggtgttggtg gcagtttgct gtcgatagga tccgccgctg gcgtggcatt gatggggcag    1320

gcgcgaggtt attacacctt ttttggacac ctgaagtggg cgccggtgat tttcattggc    1380

tacattgcca gcattgcagt gcatttgtgg ctaaatgcag acttgtttca tatctacgac    1440

<210>4

<211>480

<212>PRT

<213>淀粉水解嗜碱单孢菌N10(Alkalimonas amylolytica N10)

<400>4

Leu Arg Cys Val Ser Trp Leu Ala Gly Leu Leu Cys Leu Leu Phe Ser

1               5                   10                  15

Thr Pro Val Phe Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Asp Leu Thr Ser Ser

            20                  25                  30

Leu Val Gly Phe Val Cys Ile Ala Ile Phe Val Val Ala Tyr Val Leu

        35                  40                  45

Val Met Gly Glu Glu Lys Leu His Met Arg Lys Ser Lys Pro Val Leu

    50                  55                  60

Val Ala Ala Gly Leu Ile Trp Ile Leu Ile Gly Trp Val Tyr Ile Ser

65                  70                  75                  80

Arg Asp Ile Pro Asp Val Thr Glu Ala Ala Phe Arg His Asn Leu Leu

                85                  90                  95

Glu Phe Ala Glu Leu Met Leu Phe Leu Leu Val Ala Met Thr Tyr Ile

            100                 105                 110

Asn Ala Leu Glu Glu Arg Arg Leu Phe Asp Ala Leu Arg Ala Trp Met

        115                 120                 125

Ile Arg Lys Gly Phe Ser Tyr Gln Ash Leu Phe Trp Ile Thr Gly Phe

    130                 135                 140

Leu Ser Phe Phe Ile Ser Pro Ile Ala Asp Asn Leu Thr Thr Ala Leu

145                 150                 155                 160

Leu Met Cys Ala Val Val Met Lys Val Ala Glu Gly Asp Lys Arg Phe

                165                 170                 175

Ile Asn Leu Cys Cys Val Asn Ile Val Ile Ala Ala Asn Ala Gly Gly

            180                 185                 190

Ala Phe Ser Pro Phe Gly Asp Ile Thr Thr Leu Met Val Trp Gln Ala

        195                 200                 205

Gly Leu Val Arg Ile Asp Glu Phe Leu Val Leu Phe Phe Pro Ala Leu

    210                 215                 220

Val Asn Tyr Leu Ile Pro Ala Ala Val Met Ser Phe Phe Val Glu Lys

225                 230                 235                 240

Arg Gln Pro Ser Ala Val Tyr Glu Asp Val Glu Leu Lys Arg Gly Ala

                245                 250                 255

Leu Arg Ile Leu Thr Leu Phe Leu Leu Thr Val Ala Thr Ala Val Leu

            260                 265                 270

Cys His Ser Leu Leu His Leu Pro Pro Val Leu Gly Met Met Met Gly

        275                 280                 285

Leu Gly Tyr Leu Gln Phe Phe Gly Tyr Phe Leu Arg Met Thr Leu Pro

    290                 295                 300

Gly Ser Leu Ala Arg Lys Arg Ala Met Ala Glu Arg Glu Gly Asp Gln

305                 310                 315                 320

Glu Lys Leu Lys Arg Leu Ser Gly Val Val Pro Phe Asp Val Phe Ser

                325                 330                 335

Arg Val Ser Arg Ala Glu Trp Asp Thr Leu Leu Phe Phe Tyr Gly Ile

            340                 345                 350

Val Met Cys Val Gly Gly Leu Gly Phe Leu Gly Tyr Leu Gly Leu Met

        355                 360                 365

Ser Asp Leu Leu Tyr Glu Gly Trp Asn Pro Thr Ser Ala Asn Ile Leu

    370                 375                 380

Leu Gly Val Ile Ser Ala Val Ile Asp Asn Ile Pro Val Met Phe Ala

385                 390                 395                 400

Val Leu Ala Met Gln Pro Glu Met Ser His Gly His Trp Leu Leu Ile

                405                 410                 415

Thr Leu Thr Ala Gly Val Gly Gly Ser Leu Leu Ser Ile Gly Ser Ala

            420                 425                 430

Ala Gly Val Ala Leu Met Gly Gln Ala Arg Gly Tyr Tyr Thr Phe Phe

        435                 440                 445

Gly His Leu Lys Trp Ala Pro Val Ile Phe Ile Gly Tyr Ile Ala Ser

    450                 455                 460

Ile Ala Val His Leu Trp Leu Asn Ala Asp Leu Phe His Ile Tyr Asp

465                 470                 475                 480

Claims (12)

1.一种编码钠氢泵蛋白的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列含有与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列含有与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列具有SEQID NO.1所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求1所述的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列编码淀粉水解嗜碱单孢菌的钠氢泵蛋白。

5.一种含有权利要求1-4任意一项所述核苷酸序列的重组载体。

6.根据权利要求5所述的重组载体，其中，所述载体为重组质粒pL8、pA2或pETA2。

7.一种转化或转导或转染有权利要求5或6所述重组载体的宿主细胞。

8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。

9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞为大肠杆菌。

10.一种钠氢泵蛋白多肽，其中，该钠氢泵蛋白多肽是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽、或其活性片段、或其活性衍生物；或其氨基酸序列中取代、插入、倒位或缺失一个或多个氨基酸而生成的功能相同的突变体或衍生物。

11.根据权利要求10所述的钠氢泵蛋白多肽，其中，该钠氢泵蛋白多肽由权利要求1-4任意一项所述核苷酸序列编码的多肽。

12.一种制备转钠氢泵基因生物的方法，其中，该方法包括：

1)构建权利要求5或6所述的重组载体；

2)将构建好的所述载体转化或转导或转染到宿主细胞中，制备转基因生物。

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