CN1746309A - 苯胺双加氧酶基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及苯胺双加氧酶基因及其应用。本发明筛选出了一种新的苯胺双加氧酶基因，并将该基因导入受体菌，使所得到的遗传工程菌株获得或者增强降解苯胺的能力。

Description

苯胺双加氧酶基因及其应用

技术领域：

本发明涉及一种新的苯胺双加氧酶基因及该基因在降解苯胺方面的应用。

背景技术：

80％以上的工业废水含有芳香族化合物，其中苯胺及其衍生物化学结构稳定，难以被自然降解，已经成为环境保护的一大难题。

已经在许多菌属的微生物发现能够降解苯胺的菌株。如刘志培，刘双江等人发现了一株高耐受苯胺降解菌株Delftia sp.AN3(liu Z，SJ Liu.，Appl Microbiol Biotechnol，2002；58(5)：679-82.)。但是很多分离的微生物只能在实验室的条件下降解苯胺，但当把它们用于野外生物清除时，效果并不理想。这是由于靠单一化合物富集分离的菌株不能降解实际环境中混合的有机物。为了达到生物清除的目的，就必须使它们具有额外的代谢能力，使它们在含有数种化合物的污染环境中发挥生物清除的作用。

目前认为对苯胺降解的途径是：苯胺降解菌通过苯胺双加氧酶(anilinedioxygenase)将苯胺转化为邻苯二酚，然后邻位或间位开环，经过一系列生化反应将苯胺氧化为二氧化碳和水(van der Meer 1992 Microbiological Reviews，677-694)。而苯胺双加氧酶是此途径中的关键酶，也是降解途径的限制酶，它不仅将毒性较大的苯胺转化为毒性较小的邻苯二酚，同时酶含量的增加也可加快苯胺降解的速度。

到目前为止，世界上只有3个苯胺双加氧酶基因簇得到真正克隆并注释。这可能是由于苯胺双加氧酶的活性极易氧化和苯胺双加氧酶所具有的多组分，多亚基特性。1997年Fukumori & Saint利用功能缺陷株，对Pseudomonas putida UCC2的苯胺双加氧酶进行了功能验证和基因注释、命名。tdnA1，tdnA2分别编码苯胺双加氧酶的大小亚基，假定的大亚基含有保守的[2Fe-2S]R Rieske-tape配体中心，tdnB编码还原酶，tdnQ和tdnT可能与氨基转运释放有关。另外还有一个Lys-tape的正调控基因(tdnR)(Fumiyasu F andChristopher P.S.Nucleotide sequences and regulational analysis of involved inconversion of aniline to catechol in Pseudomonas putida UCC2(pTDN1).J Bacteriol，1997，179：399-408.)。1997年Toshiki Fujii在废水中分离出一株降解苯胺的Acinetobactersp.strain YAA，并建立了质粒基因文库，利用功能筛选得到了一段18.5kb的片段，包括了苯胺双加氧酶atdA和邻苯二酚2，3双加氧酶基因atdB。atdA编码五个组分，tdnA1，tdA2，tdA3，tdA4，tdA5分别编码苯胺双加氧酶的大小亚基，类谷氨酸盐合成酶蛋白，还原酶。(Toshiki F.Masahiro T and Yoshimichi M.Plasmid-enocoded genesspecifying aniline oxidation from Acinetobacter sp.strain YAA.Microbiology，1997，143：93-95.)。2003年Shuichiro Murakami等人从另一株苯胺降解模式菌Frateura Species ANA-18染色体上克隆得到苯胺双加氧酶基因tdn和邻位裂解途径的邻苯二酚1，2双加氧酶基因cat1。Tdn基因也包括tdnQ，tdnT，tdnA1，tdnA2，tdnB以及tdnR。与Pseudomonas putida的tdnQ和Acinetobacter sp的atd基因簇以间位途径降解苯胺不同的是，Frateura Species ANA-18为邻位裂解途径(Shuichiro Murakami et al.Cloning and functional analysis of aniline dioxygenase gene cluster，fromFrateuria species ANA-18，that metabolizes aniline via an ortho-cleavage pathwayof catechol.Biotechnol.biochem，2003，67(11)：2351-2358.)。

发明内容：

本发明的目的是筛选出一种新的苯胺双加氧酶基因，将该基因导入受体菌，使所得到的遗传工程菌株获得或者增强降解苯胺的能力。

本发明的技术方案是：

1.通过嗜酸性丛毛单胞菌株基因文库的构建，用功能筛选的方法克隆得到苯胺双加氧酶(aniline dioxgenase)基因，该基因的序列如SEQ ID NO：1所示，其大小为9288bp；

2.将上述SEQ ID NO：1所示的基因片段连接到具有广寄主范围的特性的质粒中，构建具有完整苯胺双加氧酶基因的重组高频接合转移质粒。；

3.将含苯胺双加氧酶基因的重组质粒导入受体菌，获得能够增强对苯胺的降解或扩大底物降解范围的遗传工程菌株。

所述具有广寄主范围的特性的质粒包括pVK100和pLA2917等；

所述受体菌包括本身具有苯胺降解能力的菌株，如嗜酸性丛毛单胞菌、恶臭假单胞菌和诺卡氏菌等；还包括原先不具有苯胺降解能力的菌株，如原先只能降解苯酚的醋酸钙不动杆菌和假单胞菌等菌株。

上述本身具有苯胺降解能力的受体菌导入本发明的含苯胺双加氧酶基因的重组质粒后，可增强对苯胺的降解能力；

上述原先不具有苯胺降解能力的受体菌导入本发明的含苯胺双加氧酶基因的重组质粒后，可获得降解苯胺的能力。

因此本发明的苯胺双加氧酶基因有益效果是：导入受体菌所得到的遗传工程菌株能够获得降解苯胺的能力，或者增强降解苯胺的能力。

以下表1是苯胺双加氧酶基因及其阅读框(OREs)编码的产物

                      表1

	氨基酸同源性(％)	基因	功能	菌株	参考文献
						tdnQ	95％82％60％	tdnQtdnQatdA1	氨基转运苯胺双加氧酶组分氨基转运	P.putida UCC22Frateuria sp.ANA-18Acinetobacter sp.YAA	(1)(2)(3)
tdnT	85％59％	tdnTtdnT	氨基转运苯胺双加氧酶组分	P.putida UCC22Frateuria sp.ANA-18	(1)(2)
						tdnA1	96％82％53％	tdnA1tdnA1atdA3	苯胺双加氧酶大亚基苯胺双加氧酶大亚基苯胺双加氧酶α亚基	P.putida UCC22Frateuria sp.ANA-18Acinetobacter sp.YAA	(1)(2)(3)
tdnA2	92％72％	tdnA2tdnA2	苯胺双加氧酶小亚基苯胺双加氧酶小亚基	P.putida UCC22Frateuria sp.ANA-18	(1)(2)
						tdnB	85％67％	tdnBtdnB	苯胺双加氧酶还原酶组分苯胺双加氧酶还原酶组分	P.putida UCC22Frateuria sp.ANA-18	(1)(2)
tdnR	92％74％30％	tdnRtdnRtdnR	LysR-tye调控子LysR-tye调控子LysR-tye调控子	P.putida UCC22Frateuria sp.ANA-18Acinetobacter sp.YAA	(1)(2)(3)

表中参考文献如下：

(1)Fumiyasu F and Christopher P.S.Nucleotide sequences and regulationalanalysis of involved in conversion of aniline to catechol in Pseudomonas putidaUCC2(pTDN1).J Bacteriol，1997，179：399-408.

(2)Toshiki F.Masahiro T and Yoshimichi M.Plasmid-enocoded genes specifyinganiline oxidation from Acinetobacter sp.strain YAA.Microbiology，1997，143：93-95.

(3)Shuichiro Murakami et al.Cloning and functional analysis of anilinedioxygenase gene cluster，from Frateuria species ANA-18，that metabolizesaniline via an ortho-cleavage pathway of catechol.Biotechnol.biochem，2003，67(11)：2351-2358.

具体实施方式：

以下实施例中所举的质粒、菌株等只是用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发明的实质内容加以限制。实际上，用本发明发现的基因和方法，本领域技术人员可以得到其它多种具有苯胺降解能力的遗传工程菌株。

实施例1AD9菌株基因文库的构建

采用细菌总DNA提取的常规方法，提取嗜酸性丛毛单胞菌Delftia acidovorans AD9的总DNA：

用SDS-蛋白酶K裂解，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)沉淀细胞碎片和多糖，再用异丙醇沉淀来提取总DNA(Wilson K.Preparation of genomic DNA from bateria.AusubulFM，Bent R(eds)，Current Protocols in molecular biology，New York：J Wiley，1987)。

1)取AD9单菌落接种于5ml相应的培养基中，在合适的温度下培养。

2)取1.0ml培养菌液于1.5ml离心管，13,000rpm离心2min，弃上清。

3)沉淀重悬于1.0ml 0.85％NaCl中。

4)室温13,000rpm离心2min，弃上清。

5)沉淀重悬于550μl 1×TE中。

6)加17μl溶菌酶(35mg/ml)，37℃温育30min。

7)加3μl蛋白酶K(20mg/ml)，37C温育30min。

8)加30μl 10％SDS，37℃温育30min。

9)加100μl 5mol/L NaCl充分混匀。

10)加80μl CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃水浴10min。

11)加等体积(0.7-0.8ml)氯仿/异戊醇(24∶1)，轻轻振荡混匀。

12)室温，13,000rpm离心10min。

13)将上清液转移到一新1.5ml离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)轻轻振荡混匀。

14)重复第12)步。

15)将上清液转移到一新1.5ml离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1)轻轻振荡混匀。

16)重复第12)步。

17)将上清液转移到一新1.5ml离心管中，加入0.6体积异丙醇，混匀后室温静置60min。

18)20℃13,000rpm离心20min。

19)弃上清，加500μl 70％乙醇，轻轻颠倒数次(洗盐)。

20)4℃15,000rpm离心20min。

21)重复洗盐两次。

22)倒置离心管，干燥DNA沉淀10-15min。

23)DNA沉淀溶于100μl 1×TE缓冲液，-20℃保存备用。

用适量的限制性内切酶HindIII对50～100μg总DNA，37℃水浴中进行部分酶切，酶切片段于0.4％的琼脂糖胶上电泳，用溴化乙锭染色后，于紫外线下切下含8～21kb片段的琼脂糖胶，放入1.5ml的离心管中，加入3～4倍体积的Binding Buffer 55～65℃水浴7min直到胶彻底溶解，置于DNA/琼脂糖溶解液到回收柱室温下10,000rpm离心1min，加入用无水乙醇稀释的Wash Buffer 750μl，室温下10,000rpm离心1min，加30～50μl超纯水到离心柱中，10,000rpm离心1min，回收DNA。将回收的8-21kb酶切片段(0.3-0.9μg)、T4连接酶(3U)、载体pUC19(1.0μg)，4℃连接过夜，反应体积为10μl，将连接产物电击转化大肠杆菌Jm109，获得AD9菌株基因文库。

电击转化E.coli感受态细胞制作：

1)挑取E.coli JM109单菌落在LB培养基中，225rpm，37℃过夜培养。

2)取2％v/v菌液重新接种于一新100ml LB培养基中，300rpm，37℃摇菌至OD6000.5-0.7(4-5×10⁷cells/ml)。

3)冰上冷却20min，以下操作尽可能在接近0℃下进行，并且所有容器均需冰上冷却。

4)菌液转入两只50ml离心管中，4℃，4000xg，离心15min，弃上清。

5)加入50ml 10％甘油重悬菌体。

6)4℃，4000xg，离心15min，弃上清。

7)加入25ml 10％甘油重悬菌体。

8)4℃，4000xg，离心15min，弃上清。

9)加入10ml 10％甘油重悬菌体。

10)4℃，4000xg，离心15min，弃上清。

11)加入100-200μl 10％甘油(预冷)重悬菌体(细胞终浓度1-3x10¹⁰cells/ml)，40μl/管分装，液氮速冻后保存于-70℃冰箱中。

电击转化法建立基因文库

1)取两管E.coli JM109感受态细胞(40μl)于冰上溶化。

2)分别加入1-2μl连接产物或空载体质粒，轻轻混匀，置于冰上约1min。

3)设置电击程序(pre-set protocol-E.coli)。

4)将混合液转入预冷的0.2cm电击杯中，盖上盖，放入电击池中。

5)电击(Pulse)。

6)取出电击杯，立即加入1ml LB培养基，轻轻混匀。

7)将菌液转移到预冷的1.5ml离心管中，225rpm，37℃培养1h。

8)记录电击参数，时间常数必须接近5milliseconds。

9)培养菌液涂布氨苄青霉素平板，37℃培养。

实施例2功能筛选苯胺双加氧酶的方法

将转化的细菌涂布于加入X-gal，IPTG和Amp的LB固体培养基上，20小时后得到白色的重组子菌落约10,000个，再将它们转入加入300g/L苯胺和Amp的LB固体培养基上，20小时后观察变为棕色的菌落为含有苯胺双加氧酶基因的克隆。阳性克隆提质粒，酶切验证，测序。

用碱裂解法提取质粒DNA：

a)将挑选的阳性克隆菌落接种到5ml液体LB培养基中，37℃200rpm振摇过夜。

b)取1.5ml培养液于Eppendorf离心管中，12,000rpm离心2min。

c)完全倒掉上清，用100μl溶液I(50mmol/L蔗糖，10mmol/L EDTA pH8.0，25mmol/LTris-HCl pH8.0)悬浮沉淀菌体，冰上放置5min。

d)加入现配的200μl溶液II(1％SDS，0.2mol/L NaOH)，上下颠倒数次混匀，冰上放置5min。

e)加入150μl溶液III(5mol/L KAc+11.5ml冰醋酸，补加水至100ml)，上下颠倒数次，冰上放置5min。

f)加入500μl酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，上下颠倒数次混匀。

g)12,000rpm离心10min，吸取上清，加入2倍体积预冷的无水乙醇，-70℃放置20min。

h)12,000rpm离心15min，弃上清，用70％的乙醇洗涤沉淀。

i)冷冻抽干后，加入50μl TE溶解质粒DNA。

j)取2μl质粒DNA，用HindIII酶切检测目的片段。

实施例3苯胺双加氧酶基因的序列

从基因文库中筛选到6株阳性重组噬菌体，其中阳性重组子pDA2 DNA中包含全部苯胺双加氧酶基因及其启动子，对阳性重组子pDA2 DNA进行部分酶切，得到9288bp的HindIII部分酶切片段，并对连接的片段进行测序。该片段含有6个完整的开放阅读框(ORF)ORF1～ORF6的推导氨基酸分别与P.putitaUCC2苯胺双加氧酶的6个亚基tdnQ，T，A1，A2，B，R的同源性见表1，ORF1～ORF6暂命名为tdnQ，T，A1，A2，B，R。DNA核苷酸测序由上海基康公司完成，核苷酸和氨基酸分析软件主要为DNAman和美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的Blast程序。

实施例4苯胺双加氧酶基因高频接合转移质粒的构建

用碱裂解法提取质粒DNA将含有Delftia acidovorans AD9的苯胺双加氧酶完整基因HindIII片段(9288bp)，通过T4 DNA连接酶连接到具有广寄主范围的特性的质粒pVK100中，构建含苯胺双加氧酶基因的重组质粒pVA。

实施例5工程菌株的构建及苯胺降解能力的测定

将含苯胺双加氧酶基因的重组质粒pVA与野生型菌株AD9或苯酚降解菌(A.calcoaceticus PHEA-2)进行接合，将含有苯胺双加氧酶基因的重组质粒pVA供体菌和受体菌(野生型菌株AD9或苯酚降解菌(A2)分别少量培养在LB培养基中过夜，次日分别转接入5ml的LB培养基中培养2h，分别取出1.5ml菌液离心，去上清，再用生理盐水悬浮并离心，重复一次，将离心的菌体悬浮于100μl的生理盐水中，取出30μl按供体：受体为1∶1的比例混合，两两混合和不混合的做对照。然后分别滴在LB平板上，将平板置于一个潮湿的器皿中，30℃培养6～8hr，用牙签将它们分别挑起放入1ml LB液体中，悬浮并摇匀，以10^-3～10^-5的稀释度稀释后，铺于含有Tc的A15平板上，30℃培养过夜后挑取单菌落，从限制性平板上选择具有Tc抗性的接合子，经过数次抗性转接筛选后，选取抗性稳定的接合子(PVAD-4及PVAA-10)测定其苯胺的降解能力。PCR检测接合子是否含有目的基因——苯胺双加氧酶酶基因。

通过测试重组菌株对苯酚的降解和耐受能力，从几十株转有苯胺双加氧酶基因的重组接合子中筛选到降解苯胺能力增强的PVAD-4，具体筛选方法及降解特性如下：从野生型Delftia acidovorans AD9和重组接合子PVAD-4的平板上，挑取单菌落接种在20ml的LB培养液中，30℃200rpm过夜摇培，分别以2％的接种量接种到100ml含500mg/l苯胺的MS液体培养基中，同时以不加菌的相同培养基作为对照，30℃200rpm摇培，每隔3h取5ml样品测定苯胺的含量。测定结果表明，发现在500mg/L苯胺的MS培养液中，重组接合子PVAD-4在9h内基本上将苯胺全部降解掉，野生型AD9则需18h才能完全降解溶液中的苯胺。

重组接合子PVAA-10接种量接种到以苯胺或苯酚(2mmol/L)为唯一碳源的MS液体培养基上，显示出良好生长的能力。研究表明重组接合子除具有利用苯酚作为碳源生长的特性外，并获得降解苯胺能力的新性状。

序列表

<110>中国农业科学院生物技术研究所

<120>苯胺双加氧酶基因及其应用

<130>04-01

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>9288

<212>DNA

<213>嗜酸性丛毛单胞菌(Delftia acidovorans)

<400>1

1    TTATATCTCA AAGGATCCAG AAAGCTGCCA GTTGAAGTGG TGGCACCAAG TCTGGGAATG

61   ATCTGGCAGG TTTCGATCTC CAGCCCAGAC CGGGAACGGG CGTTTCAGGC GTTGGAGGTG

121  GCCACCCTGT TTGCCCTGCG CCGCGCGGTG CGCAATGGCT CGGTCTGGAT TGAGCACAGC

181  CTGAGCTTTC GGGGTCGTGC GCGCTTGTTC TTCACGGACG AGCGTTGGCA GGCAGAGTCC

241  AAGAAACACT ATGCCCGTCT ATCGTTACCC AGCAAGGCTG CCACTTTCTT GAAGCCTTTG

301  CTGGCCAGAG TAACTGCCGG TGTCGATGCG GTGGCCGCTG CAGCCCGCAG TGGCGTACTG

361  CGCGTGGATG ATGAACTCCA TTTGTCGCCA TTGCCCGCAG AGGACGAAGA CCCAGAAGTG

421  ACCAAGCTGC GCGCGGCTTT GGATCACCGC ATCGGTGAGG TTCAATTGCC GGAAGTGATT

481  CTGGCCGTTG ACGCCCAGGT GCGCTTTAGC TGGATCATGC TCGGACGTGA GCCGCGCTCT

541  ACCGACGAGC TGCTGATGGT CTATGCCGGC ATCATGGCCC ACGGCACCAG TCTGACTGCG

601  GTCGAATGCG CGCGCATGAT TCCGCAATTG TCTGCCACCA GCATTCGCCA GGCCATGCGC

661  TGGGCGCGGG ACGAACGGCG TCTGAGCCAG GCCTGCCAGG CTGTGCTGGA ATTCATGCAG

721  CGACACCCGA TTGCCGCCAC CTGGGGGCGG TCCGATTTGG CATCTTCTGA CATGATGACC

781  ATGGAGACCA CCAAACGGGT GTGGCAAGCC CGGCTTGATC CTCGGCGCAA CACACCTTCC

841  ATTGGAATCT ACTCCCATGT AAAAGACCGG TGGGGCATCT TCCATGCGCA GCCCTTTGTG

901  CTCAATGAGC GCCAGGCGGG CGTGGCCATT GAAGGTGTCA TCCGCCAAGA AAAGCTGGAG

961  ACCAGCCAGC TTGCTGTGGA TACCCATGGC TACACCGACT TTGCCATGTC ACATGCCCGT

1021 TTGCTTGGTT TTGATCTTTG CCCGCGGTTG AAGGAACTCA AACAGCGCCA CCTCTTTGTG

1081 CCACGCGGCA CCAAAGTGCC CGCAGAAATC GCTGCGGTGT GCGAAGCCAA TGTCGACGTC

1141 GCTTTGATCG AAAAGCATTG GGATAGTCTG GTGCACCTGG CAGCCTCGGT CATGAGCGGA

1201 CATGCCAGTG CGGTGGCAGC TCTTGCGCGG TTCGGTTCTG CCGCCCAGGG CGATCCAATC

1261 TATGAGGCTG GCGTGCAATT GGGGCGGTTG CTGCGTACGG CGTTTTTGGC TGACTACTTT

1321 GTCAAGGACG CTTTCAGGAA CGAGTTGCGC CGGGTGCTCA ATCGGGGCGA GGCTGTTAAC

1381 GCCCTCAAGC GCGCCATTTA TACCGGCCGG ATCAGCCCGG CGCAGGCCAA ACGTGTCGAT

1441 GAAATGCAGG CTGTGGCCGA TGCGTTGAGC CTGATGGCCA ACATCGTGAT GGCGTGGAAT

1501 ACCTCACAGA TGCAGGCGGT CCTGGATCGC TGGTCGAACC GCCGCCAGGT CATTCCACCG

1561 GAACTGATCG GGAAGATTGC GCCCACCAGG CTGGAGAGCA TCAACTTGCG GGGTGTGTTT

1621 CGCTTCCCGG TTGACCGCTA TGCTGACCAA ATCCTGCCTT CGCGGCCAAA TGCATCGATA

1681 ACTGGCACCA ATGGATGAAA CCGACCACGG TTTGACGCCA CGAATCGCAG ATTTGAAAGT

1741 GAACAGGAAA GTCAATGAAA TCAACGATCT ACCAACACCA CCTCCGCGCC AGTGCTAGCT

1801 TTTCGTACCG TCACTTATTG CACTGAAAAC GAGGAGACCC CGACCAGGTG CGGCCGGACG

1861 GCGCGCGCTG CCATCGCAGC GCTGACCACG TTGACGTTCA GTGCGGTGAG CCAGTCCGAG

1921 CGGCCTGAAG CCGCGCCGTC GTCGAGGTAG GTGCAGGCGA GATTGACGAG GTGGTCGACG

1981 CGACCGAAAT GCTGTGCGAC TTCGGCCACG CAGCGTTCGA GCTGGCCATC GTCGGTCAGA

2041 TCGACCGGCC AGAAGCGAGC CGAATCCCCG ACCTTCGCGA CCGCGCGAGC GCCGCCTTCC

2101 GCGTCGATGT CGAAGACGCA AACCTTGACG CCATACGCGC TGAGCACATC GACGACCGCC

2161 GCGCCAATGA TGGTGGCTCC TCCCGTAACG ATGGCGACTT TGCCTTCCAG GCCTTTCATG

2221 GCAAACCCCT CATGCAAGTT GATGTCGATC GGACAGCAGG CCGGTCACGA TCACGTGGAC

2281 GCGGCAACCC CTCGGAGAGG CCACGCGCCA GCCGTTCCAT GCGCGCGCTG CCAGCCGTCA

2341 GACCGGGCGC ATAAAGGGCC GCAATTCACC CTGTGTTGAT GCTCGCGTAG CTCGGCTGGG

2401 GTAGCTATCC GCTTCCTGCA GTGCCTATCC GCAAAGTGCT TCTTCTTGCG CTCGATGCGT

2461 GTGTATTGCC GGTGGCCCTG TGGCGGAGCG TGGGTCGTCC CGGCAGCAGC GGCGCACGAG

2521 CAAGTGCGGC GCGCGCTCCT GCGGCCGGCA ACCTCTCCTA GCGGCCCGCT GGGCCTGCAG

2581 ATCGAGACGT CCCTGGGGGG ATCTTCGCAG CACCGGCGAA CGCCGGCTCC TTGCTGCGGC

2641 GCACCATTCT CAATATTGCG AAACGAAATC GCGGCGGTGG TGTTTACGCA TCATTTTTGA

2701 TCTATGACAA TAAAAAAAGA CGGTGAATTT GAAGGGTTTT CCCCTAGATC ATCAAGTATC

2761 GCCGACTAAT TAGCCGCAAA TAACCTAGGA GACGCGATGA GCGGGAAATT CATTGAAAAG

2821 CACGGCATCT GGTCGGATAC CCAGAAAGCC GCAGCAGCAG ACGTCCTGAA TAAAATTGAG

2881 AAAGCGGGGC TGCAGATGGT TCGGTTGTCT TGGCCGGATC AGTACGGACT GCTGCGCGGA

2941 AAAATGCTGT CGGTCGCCGC GCTCAGGTCG GCATTCGCCA GCGGCTCAGA GATCACGATG

3001 GCGCCGTTCT TCTTCGATAC CGCCAGCGCC ATCGTTTTCA ACCCTTTCTC CGCAGACGGC

3061 GGCCTCGGCA GCGCCGAACT GGCCGGCAGC CCCAATGTCG TGATGGTTCC GGACCCCACC

3121 ACCTTTCGCA TCCTGCCCTG GGCGGACCGC ACCGGCTGGA TGCTGGCCGA CCTTTACATG

3181 ACCAGCGGGC GCCCGTTCGC GTTGAGTCCG CGCGCCATCC TGAAAAAGGC GCTGGCCGAG

3241 ATGCAGGACC TGGGCTACGA CTACCAGGCC GGCCTCGAGG TCGAGTGGTA TCTGACGCGC

3301 ATCGTCGATC CCTGCCTGGA GCCCGAAACC CTTGGCGGCC CCGGAACGCC TGCGGCGCCT

3361 CCCAAGGTGA TGCCGGTGGC CAAAGGGTAT TCGTACCTGC TGGAGAACCA CCTGGACGAG

3421 GTCGAGCCCA TCATGGCCGA GGTGCGCCAG CACCTGTTGG CCCTGGGGAT GCCCCTGCGC

3481 AGCATCGAGG ACGAGTGGGC GCCGAGCCAG ATGGAGACCA CCTTCGACGT GATGCCCGGC

3541 CTGGACGTGG CGGACACGAT GGTGCTGTTC CGCAACGCGG TCAAGCAGGT CTGCCGTCGG

3601 CGAGGCTATC TCGCGAGCTT CATGTGCAAG CCCGCCATCC AAGGCTTTTT AGCCTCCGGC

3661 TGGCACCTCC ACCAGTCACT CACGGCGCGG GACTCGGGCG CCAACGCCTT CATTCCGCAG

3721 CCGGGCGAGG CGCTCTCGGC GCTGGGGCGC TCCTACGTCG GCGGGCTGCT CGAGCATGCC

3781 TGCGCAGCGT CGAGCTTCAC CACGCCGACG ATCAACGGCT ACCGCCGTCG CCGCCCGTAT

3841 TCGCTGGCGC CAGATCGCGT GACCTGGGCC AAGGACAACC GCGCCGCGAT GGCGCGTGTC

3901 ATCTCCGCAC CCGGCGACCC GGCCAGCCGG GTGGAGAACC GGATCGGCGA GCCGGCGGCC

3961 AACCCCTATC TCTACCTGGC TTCCCAGGTG TTTTCCGGGA TCGACGGCAT CCGCCGCCAA

4021 CTCGATCCGG GGCCGCTGCA GGAAACACCC TATGCGGCGG ACGTCACCAT CCTGCCTCAT

4081 AACCTGTCCG AGGCGCTGGA GGTTCTGGAA ACCTCGAAAT TCTTCCGTGA GGCATTCGGC

4141 GAGGAATTCA TCCGTTATTG GATGCATTTG CGGCGCAGCG AATGGAAAAG GTTTGTTGAC

4201 GCCGAAGGGC AGGTTGATTT CTCGGGTGAT CCGGTTACCA ACTGGGAGCA TCGTGAATAT

4261 TTCGAGCTTT TCTGATGACT GTCATGAAGA AGTACGCAGT TATATGGTGC TCGGATGCAT

4321 CGGGCGACCT GGATTTGCAG GAAAAAATGA TCTCGGCCTT TGGCCGGGAA AATGAAGAAT

4381 GGGAGATTTT CTGATGACTG CCATGAAGAA GTACGCAGTT ATATGGTGCT CGGATGCATC

4441 GGGTGACTTG GAGTTGCAGG AAAAAATGAT CTCGGCCTTT GGCCGGGAAA ATGAAGAATG

4501 GGAGATTATC CAGCCTGTTG AAAATGATTT TCTCGAGAAG GCATTCGATT ATTCAGGGCA

4561 TGTCATCAGC GGCAGTCCCA AGTCGGTGAT CGATGACGCG CGGACGCCCC TGGTGAGCAA

4621 CCTGCTGGCG TTCCTGCGAG GTGCGGCGCA GCGTGGCGAG GGGCCGGTGG TCGGGCTTTG

4681 CTTCGGCGCC CAGGCCATCG CGGCCGCATT GGGCGGGCAG GTCGGGAGAA ATCCGTCCGG

4741 TCGCTTCAAG CTGGGTGCGG ACCGGCTGGA ATGGAGCAAC GAGGCCCAGG TGCTGTTTGG

4801 CCCTCAGGTC GGCGCAGGCC CCACCGTGCT GGTGCAAAGC CACGGCGAAT GCGTGACCAC

4861 CCTGCCGCCG GGCGGCGTTC AGCTGGCGTC CTCGCAGACG ATCCCGCACG AAGTTTTCCT

4921 GGTGAATGGG CAGTTCCTGG GTATCCAGGG GCACCCGGAA GTGGATCGGC AGTTCCTGCA

4981 GCAGAAGTTC ATGGCCTACC ACCGTGCGTT GTTCGACGAC GACGAATGGG TCCGCGTGCA

5041 GCAGGAATCG CAGCAGGCCC TGGATCCCGA GCGCGTGATC GCGTTGGGGC GGCGCCTGCT

5101 CGACGCGGGG CGCCTTCCCG CGACACCGCA GGACATTTCG GCCTTGCCGG CCTAAGGCCA

5161 TAGGCAATCG AAGAGGAACA AGGAAACCCC CATGACAAAC ACCGCCAAGA TATCCGTCCT

5221 TCCACGGACG CCCGCCGCCC AGGGCGACTG GGATGATCTG GTCCAGGAAG ATCGGGTGCA

5281 TCGTCGCCTC TATACCGACG AAGCCATCTT CTCCCGCGAG ATGAACAACA TCTTCGCGGC

5341 CACTTGGGTC TATCTGGCCC ACGAGAGCGA AATCCCCGAG CCCAACGATT TCAAGCAAGC

5401 CTGGATCGGT GTGCGCGAGG TCATCGTCGC GCGTGATGAA GCAGGCGTCA TCCGCGTCTT

5461 TTCCAACCGC TGCTCGCACC GCGGCGCGAG CGTCTGCCGT GAACATCGGG GTAACGCCGC

5521 CGGCTTCACC TGCCCCTACC ACGGCTGGCG TTTCGACAAC CGAGGCCAGT TGTTCGGCAT

5581 CCCGGGCAAG AACGCCTACG GTCCGACCTT CAAGTCCCGC GACATGCACC TGGCGCGGCC

5641 GGCGCAGGTG GATTCGTACA AGGGCTTCGT GTTCGCCACG CTGAACCCCG ACGCGCCACC

5701 GCTCTTGGAC CACCTCGGCA ACGCGGCGCG CTACCTCGAC GACTGGATCG ATCACAACGG

5761 CGGGGCCTCG AACCTGCGCC TGGCAGGCGT GCAGCGCTTT CACCTGGCCT GCAACTGGAA

5821 GCTGATCTGG GACAACGCCG GCGACGGCTA CCACGTCCCC TTCTCGCACC AGTCGCTGCT

5881 GGTCATGACG AACGCGCGCT ATGGCGGCGG CGACATGGCC TACTTCGCCG ATGCCGATCG

5941 CTCCAAGATG ACCAACAGCG CGCTGGACAA CGGCCACACC GTGATCGACC AGCGCCCGGA

6001 GATGCACGGC GAATCGGCCT GGCGCCTGCA GCGCCCGCAG CCCGGACGCG AGCCCTACGA

6061 GGATCACGTG GCGAGCATCT ACGGGGACCA GGCGCAGCAG GTGCTCGACA CCACCGTCGG

6121 CGCGGGGATG AACCTCAACA TCTTTCCCAA CCTGGCCTTG ATCGGCAACC AGGTGCAGGT

6181 GATCCAGCCG CTGGCCGTCG CCTCCACGGG CGTGCACTGG TACGCGACGC AGCGCAAGGA

6241 TGCCGATCCG GAGGTGAACA CCATGCGCTT GCGCACCCAG GAGGATTTCC CGGTGATGGG

6301 CGAGATGGAC GACGCCGCCA ACTTCGAGGA GTGCCAGCGC GGGTTGTGCA ACAGCCCCGA

6361 GGACGAGTGG GTCGACATGA GCCGGCACCA CGAGTCCGGC AAAGACGTGC CGGTCGAGGA

6421 CGGAATCATC CGCGGACCGG TGACCACCGA CCTGCACATG CGCAACTACT ACGCGCAGTG

6481 GAAGCGCCTG ATGCAGGCAG AGCCAACGCT GCGCATGGAC AAGGGGAGGC TGGCATGAGC

6541 ACAGCGACGC AGCAACCCGC CGCTGGGCGG CAAGGGTACC GCCATCAACC GCCATCGCTG

6601 TATGTGGTCG CATCGTTCTA CGACTGGCTG GTGGACGTCT CCGCCGACCT GGCCCGGGCG

6661 GTGGTGCGCG AGCCCGGCAC CGTCGAGGCG GCGCGTGAGC GCGACATCGT CCGAATGCTG

6721 ACCGTGGAGG CGAGGCTGCT GGACCAGGGG GCGCTCACGC AGGACGCATA CGTCCAGTGG

6781 CTGGCACTGT TCGCCGAAGA ATGCGCCTAC TGGATTCCTG CTGTCTCGCC CGCTCCGGAC

6841 CCGAGATGCA GCGTCACGCT GGAATTCCAC GACAGGCGCC GCCTCCTGGA CCGGGTGACG

6901 CGGCTGGGAA CGGGGCTGGC CTTCTCGCAG TTCCCGACCT CTCGTACCGC TCGCCAGTTC

6961 AGCGGACTCG AGGTGTGGGC GAGCCCAGGG CGCTCGGACG AATGGCGTGC GCGCTACAGC

7021 TTCACGCTGG TCGAGTCGCG CGAGGGCCAC GGTCGCGTGC TGGCGGGCTG GAATGGTTTC

7081 GTTCTGCGCG AGACGGAAGC TGGCCTGAGC ATCGTGCTCA AGCAGGTCAA TCTGATCGAC

7141 AGCGACCGCC CCCAGGGCAA CAACTCGTTC TTCCTCTGAA GGCGGCGTCA ATGGCGAAGC

7201 GGGCGCAATC CCTCACCATC ACCGACGTCA CGGCCCAGGG GAGCGACGCC ATCCTGCTCA

7261 GCCTGCGCGT GGACGATGAG CAGCAGCCGA AGTTCACGTT CCAGCCGGGC CAGTACCTGA

7321 CGCTGGCGGT CGAAGTGCAG GGCGACGAGC ACTGGCGCTG CTACTCGATC ACCAGCGAGC

7381 CCGTGACAGG GCAGCCGATC AGCGTGCTGG TGCGCCGCGT TGCCGGCGGC CGCGTCTCGA

7441 ACTGGCTGTG CGACAACGCC CGGCCGGGCC GGCAGTTGCA GGTTCTTCCC CCCGCCGGGC

7501 ACTTCACCCT GGCGCGGCCC GGGCAGCCGC TGCTGCTGTA CGCCGGCGGC AGCGGCATCG

7561 CACCGGTGTT CGCGCTGGCT CGCGAGGCGC TGGCGCGCGG TGCGGCGCGC GTGCGGCTCT

7621 TCTACGCCAA CCGCGACCGG GCCACGGCCA TGCTGTTGGC CGAGTTGCAG GCGTTGCAGG

7681 ATGCCGCTGC GGGGCGCCTG GAGATCGTCC ACTGGTATGA CGCCGAGCAG GGCCTTCCTA

7741 CGCAGGCCGT TCTGGTGGCG CAGGCGCAGG GGCTGGACCA GGCCGACGCC TACATGTGCG

7801 GTCCGGAACC CTTCATGCAC GCCGTGGGCG CCAGTCTCCA GGTCGCCGGG TTCGATGCCC

7861 AGCGTGTGCA CCGGGAGGAC TTCGGCGCCG CCGTGGAAGG TGCGAGCGAG GAAGCCGCAG

7921 GTGATGGCCC CGAGGCGCTG CTCACGGTCC TGATGAAAGG CCAGACCCAC GCCGTGCCGG

7981 TGCGTGCCGG CGAACTTCTG CTGTCCGCCA TGCTGCGCGC CGGACTGCCA GCGCCGCACG

8041 CCTGCCGCGT CGGCGAATGC GCCTCGTGCA TGTGCCGCCT GCAGGCCGGC GAGGTGCAGC

8101 GCTTGGACAG TTCGGTGCTC GACGAGGACG ACGTGGCCGC GGGCTGGTTG CTCGCTTGCC

8161 GCACCCGTGC CGCCAGCCCT GCGCTGCAGG TGCGATTTTC ATGACGCTGG ATGCTTGCAG

8221 GCAGCCACGA GCCACCCAAG GAGCACCATT CATGACCCGA GATGGTCCGA CCACTCCCCA

8281 ATGGGATTTG ATCCGAGCAT TCCTGGCGCT GGAACGGCAT GGCAGCTACG AAGTGGCTGC

8341 GGAGCTGGAA GGCATCGACG ACTCGACGCT GCGCCGCCGT ATCCGGCTGC TCGAGCAACA

8401 CTTCGGCCGC GCTCTGTTCG TGCGCGCAGA GGGCGGCTGG AGAGCCTCTG CCGACCTGAA

8461 TGCGCTGATT TCCGCCGCGC AGCGCATGGA GGAGGCTGCC CGCAGCTTCT GCCAGGACCA

8521 CCACGCAGGC GCCGGTGTCA TCCGAATCAG CGTGATGGAC GTCTTTGCGC AGCGTTTCGC

8581 CCCGGTGTTT GCCGCGCTCA GCGAGAAGTA CCCGAAGCTG GTGTTCACCA TCACCACCGA

8641 GGCGCATTTC GTCAATCTGG AACAGGACCA AGTGGACATC GCCGTGCGCT TGGCCAGACC

8701 GGAGCGCAAC AGCAACGCCC TGCACGTGCG CAAGCTCGGC GATGTTGCCG TCGGCGCCTA

8761 TGCCAGCGAT GCTTATCTGA AGCGCACTAC TGAGCTGGCG CATGAGAAGC ACCAACTGCT

8821 GGCGATGAAC CTGCAGTTCT TCCACCAGGA CCACCACTTC ATCTATGCCT CCCTGGACTG

8881 GTCGCGCTTC GGGCTGTCCG GGCAGGTGCG ACTTCAGTCC GACAGCTTCG CGCCGCTGGC

8941 GCAGCTGTGC GCACTTGGAC AGGGATTGGC GCTGCTGCCG AAGTTTCTCG CGGCAGAGTA

9001 TCCGCAGCTG GTTGCGCACC CGTCGAATGT CTTTGTCGAC ACGCAACTTT GGCTGGTCAG

9061 CCGCTTCGAC ATCCATGCGG CATGGCAGCG CGATCTGGCC GACATGCTGC AGGCGGAAAT

9121 GGCGCGGTGG CCGCAATGAG TGCATCGCCA ATGCAAGCGA CCGCAGTTCT TGGGCCGAGC

9181 AGCGTTTGCG TGGTGCAGAC GGGGGAGACC TACGCATGCT CCCCCGGAGA AAGCTTGCAT

9241 GCCTGCAGGT CGACTCTAGA GGATCCCCGG GTACCGAGCT CGAATTCA

Claims (9)

1.SEQ ID NO：1所示的DNA序列。

2.一种重组质粒，特征是含有SEQ ID NO：1所示的基因。

3.权利要求2所述的重组质粒，是含有所述基因片段的具有广寄主范围的特性的重组高频接合转移质粒。

4.权利要求2或3所述的重组质粒的制备方法，是将SEQ ID NO：1所示的基因连接到具有广寄主范围的特性的质粒中。

5.权利要求4所述的重组质粒的制备方法，所述广寄主范围的特性的质粒包括pVK100和pLA2917。

6.权利要求2或3所述的重组质粒的用途，是用于制备降解苯胺工程菌。

7.一种降解苯胺的工程菌，特征是含有权利要求2或3所述的重组质粒。

8.一种降解苯胺工程菌的制备方法，是将权利要求2或3所述的重组质粒转化至受体菌。

9.权利要求8所述的降解苯胺工程菌的制备方法，所述受体菌包括嗜酸性丛毛单胞菌、恶臭假单胞菌、诺卡氏菌、醋酸钙不动杆菌和假单胞菌。