CN1243831C - 果糖基氨基酸氧化酶 - Google Patents

Abstract

本发明公开了具有优良的热稳定性的新的果糖基氨基酸氧化酶。此外，还公开了编码此新的果糖基氨基酸氧化酶的果糖基氨基酸氧化酶基因；其中的果糖基氨基酸氧化酶基因插入到载体中的重组DNA；含有此基因的转化体或转导体；以及制备新的果糖基氨基酸氧化酶的方法，其包括在培养基中培养上述的转化体或转导体以及从培养物中收集新的果糖基氨基酸氧化酶。

Description

果糖基氨基酸氧化酶

发明领域

本发明涉及在高温下具有稳定性的新的果糖基氨基酸氧化酶、编码此新的果糖基氨基酸氧化酶的基因、以及制备此氧化酶的方法。

发明背景

在氧存在的条件下，果糖基氨基酸氧化酶通过氧化亚氨基二乙酸或其衍生物(也称为“Amadori化合物”)催化产生二羟乙酸或α-酮醛、α-氨基酸和过氧化氢的反应。果糖基氨基酸氧化酶是在真菌和细菌中发现的。本发明提出了利用这些酶测定食物中包含并在体内产生的Amadori化合物的分析方法(日本专利公开(Kokoku)No.5-33997，日本专利公开(Kokoku)No.6-65300，日本专利公开(Kokai)No.2-195900，日本专利公开(Kokai)No.3-155780，日本专利公开(Kokai)No.4-4874，日本专利公开(Kokai)No.5-192193，及日本专利公开(Kokai)No.6-4686)。

最近，在临床诊断领域中，HbAlc(糖基化血红蛋白)作为血糖控制标记已经吸引了研究者的注意力，其在诊断病理状况和控制糖尿病患者的症状方面具有重要性。作为快速且简单测定HbAlc的方法，本发明提出了利用果糖基氨基酸氧化酶进行的酶促测定方法并进行了实际应用。特别的，此方法包括利用蛋白酶等降解HbAlc，以及随后测定由此而释放的果糖基缬氨酸(亚氨基二乙酸的衍生物，其中缬氨酸的α-氨基进行了糖基化)。在作为此测定方法中的酶的多种果糖基氨基酸氧化酶中，在测定的快速和准确性方面，对底物果糖基缬氨酸具有高活性，而对ε-果糖基赖氨酸(一种Amadori化合物，其中赖氨酸的ε-氨基进行了糖基化)不具有活性的酶是尤其优良的。这样的酶的示例是源自棒状杆菌属细菌的果糖基氨基酸氧化酶。然而，在45℃下热处理10分钟可使上述果糖基氨基酸氧化酶失活90％或更多。由于其低耐热性，当其在试剂盒试剂中作为临床诊断用酶时，果糖基氨基酸氧化酶在其贮存稳定性方面存在问题。

发明简述

本发明的目的是克服传统的果糖基氨基酸氧化酶的这些缺陷，从而提供了在高温度范围内具有高稳定性的果糖基氨基酸氧化酶、编码此氧化酶的基因、以及制备此氧化酶的方法。

通过进行了与上述目的直接相关的广泛研究，我们通过发现，如通过修饰源自棒状杆菌的果糖基氨基酸氧化酶(日本专利公开(Kokai)No.11-155579)可获得在高温度范围内展示高稳定性的新的果糖基氨基酸氧化酶而完成了本发明。

也即，本发明为新的果糖基氨基酸氧化酶，其具有下列物理化学特性：

(a)作用和底物特异性：在氧存在下，通过氧化亚氨基二乙酸或其衍生物而催化产生二羟乙酸或α-酮醛、α-氨基酸和过氧化氢的反应，但不作用于ε-果糖基赖氨酸；

(b)最佳pH范围：7.5-8.5；

(c)稳定pH范围：5.0-10.0；

(d)作用的最佳温度范围：40℃-50℃；

(e)热稳定性：当在50℃下热处理10分钟时，展示出80％或更多的剩余活性；及

(f)分子量：约88,000(利用凝胶过滤确定)；约44,00O(利用SDS-PAGE确定)。

进一步，本发明提供了具有新的果糖基氨基酸氧化酶活性的下列蛋白(a)、(b)或(c)：

(a)包含SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的蛋白；

(b)包含通过对SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列缺失、取代和/或添加一个或几个氨基酸而得到的氨基酸序列并具有新的果糖基氨基酸氧化酶活性的蛋白；或

(c)包含展示出与SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列具有80％或更多同源性的氨基酸序列并具有新的果糖基氨基酸氧化酶活性的蛋白。

进一步，本发明提供了编码具有新的果糖基氨基酸氧化酶活性的下列蛋白(a)、(b)或(c)的基因：

(a)包含SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的蛋白；

(b)包含通过对SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列缺失、取代和/或添加一个或几个氨基酸而得到的氨基酸序列并具有新的果糖基氨基酸氧化酶活性的蛋白；或

(c)包含展示出与SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列具有80％或更多同源性的氨基酸序列并具有新的果糖基氨基酸氧化酶活性的蛋白

进一步，本发明提供了包含编码具有新的果糖基氨基酸氧化酶活性的蛋白的下列DNA(a)、(b)或(c)的基因：

(a)包含SEQ ID NO：4表示的核苷酸序列的DNA；

(b)严格条件下与包含一种核苷酸序列的DNA杂交，并且编码具有新的果糖基氨基酸氧化酶活性的蛋白的DNA，所述核苷酸序列互补于包含SEQ ID NO：4所表示的核苷酸序列的DNA的完整序列或具有其15个或更多核苷酸的一部分；或

(c)与包含DNA SEQ ID NO：4表示的核苷酸序列的DNA的完整序列或具有其15个或更多核苷酸的一部分具有80％或更多同源性，并且编码具有新的果糖基氨基酸氧化酶活性的蛋白的DNA。

进一步，本发明提供了重组DNA，其中上述基因是插入到载体DNA中的。

进一步，本发明提供了含有上述重组DNA的转化体或转导体。

进一步，本发明提供了制备新的果糖基氨基酸氧化酶的方法，该方法包括在培养基中培养上述转化体或转导体并从培养产物中收集新的果糖基氨基酸氧化酶。

附图简述

图1展示了本发明的氧化酶(4型)的最佳pH。

图2展示了本发明的氧化酶(4型)的最佳反应温度范围。

图3展示了本发明的氧化酶(4型)的稳定pH范围。

图4展示了本发明的氧化酶(4型)的热稳定性。

实施本发明的最佳方式

本发明的详细描述如下。

本发明中的新的果糖基氨基酸氧化酶(以下称作“本发明的氧化酶”)是具有下列物理化学特性的果糖基氨基酸氧化酶：

(a)作用和底物特异性：在氧存在下，果糖基氨基酸氧化酶通过氧化亚氨基二乙酸或其衍生物(Amadori化合物)催化下式表示的反应产生二羟乙酸或α-酮醛、α-氨基酸和过氧化氢。

在此式中，R1表示-OH，-[CH(OH)_n]-CH₂OH或-(CH₂)_n-CH₃，n表示0-4的整数，R2表示α-氨基酸的侧链残基。只要其可用于快速而简单的检测在诊断糖尿病中重要的血糖对照标记HbA1c，那么具有上述作用和底物特异性的任何酶都可用于本发明中。这样的酶优选本发明中对果糖基缬氨酸具有高活性的氧化酶，并且尤其优选本发明中对果糖基缬氨酸具有高活性而不作用于或很难作用于ε-果糖基赖氨酸的氧化酶。这些具有上述作用和底物特异性的酶的示例包括源自棒状杆菌属细菌的果糖基氨基酸氧化酶(日本专利公开(Kokoku)No.6-65300)等。

(b)最佳pH范围：7.5-8.5

通过在37℃下并在每一pH下利用缓冲溶液如McIlvaine缓冲液(pH4.0-6.0)、100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0-8.5)或100mM碳酸氢钠碳酸盐缓冲液(pH9.0-10.0)进行酶反应发现了最佳pH。

(c)稳定pH范围：5.0-10.0

在每一pH下，利用缓冲溶液如McIlvaine缓冲液(pH3.0-6.0)、100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0-8.5)或100mM碳酸氢钠碳酸盐缓冲液(pH9.0-10.0)，通过测定在37℃下处理10分钟时酶的剩余活性发现了其稳定pH范围。

(d)作用的最佳温度范围：40℃-50℃

利用在下文中描述的活性测定方法中的反应溶液，在多种温度下测定酶的活性，从而发现了作用的最佳温度范围。

(e)热稳定性：当在50℃下热处理10分钟时，保留80％或更多的活性

利用100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0-8.5)在50℃处理10分钟后，测定酶的剩余活性。本发明中的酶是与传统的酶不同的新颖酶，尤其是由于其高温度范围内的高稳定性。本发明中的氧化酶为这样的酶的示例，其在上述处理条件下展示出50％或更高，优选80％或更高，尤其优选90％或更高的剩余活性。

(f)分子量：约88,000(利用凝胶过滤确定)；约44,000(利用SDS-PAGE确定)

按照标准方法，通过利用Sephadex G-200进行柱凝胶过滤和通过利用multi-ge110/20(Daiichi Pure Chemicals)进行SDS-PAGE分别发现了其分子量。

如上所述，本发明中的氧化酶在物理化学特性方面与任何已知的果糖基氨基酸氧化酶不同，因此是新的果糖基氨基酸氧化酶。尤其由于此氧化酶具有不作用于ε-果糖基赖氨酸且具有高热稳定性的特性，所以其显著优于已知的酶。因此，鉴于氧化酶具有优良的贮存稳定性，所以其可包含在试剂盒试剂中作为临床诊断用酶。

本发明中的氧化酶示例包括那些源自通过筛选天然生物体获得的多种生物体以及通过对传统的果糖基氨基酸氧化酶进行修饰而获得的氧化酶。特定示例是本发明中的下列氧化酶(a)、(b)或(c)：

(a)含有SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的果糖基氨基酸氧化酶；

(b)包含通过对SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列缺失、取代和/或添加一个或几个氨基酸而得到的氨基酸序列的果糖基氨基酸氧化酶；或

(c)包含展示出与SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列具有80％或更多同源性的氨基酸序列的果糖基氨基酸氧化酶。

“缺失、取代和/或添加一个或几个氨基酸”指缺失、取代和/或添加任意数量的氨基酸，例如1-20，优选1-10，以及更优选1-5。

此外，只要与SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的同源性为80％或更多，那么“展示出80％或更多同源性”就没有特别限制。这样的同源性为，如80％或更多，优选90％或更多，以及最优选95％或更多。

含有编码本发明中的新的果糖基氨基酸氧化酶的果糖基氨基酸氧化酶基因示例(下文称作“本发明中的基因”)包括编码本发明的上述氧化酶(a)、(b)或(c)以及编码本发明的氧化酶的含有下列DNA(a)、(b)或(c)基因：

(a)含有SEQ ID NO：4表示的核苷酸序列的DNA；

(b)在严格条件下与包含一种核苷酸序列的DNA杂交，并且编码具有新的果糖基氨基酸氧化酶活性的蛋白的DNA，所述核苷酸序列互补于包含SEQ ID NO：4所表示的核苷酸序列的DNA的完整序列或其具有15个或更多核苷酸的一部分；或

(c)与包含DNA SEQ ID NO：4表示的核苷酸序列的DNA的完整序列或其具有15个或更多核苷酸的一部分具有80％或更多同源性，并且编码具有新的果糖基氨基酸氧化酶活性的蛋白的DNA。

此处，“在严格条件下杂交的DNA”指利用以DNA作为探针的方法，如菌落杂交、噬菌斑杂交或southern印记杂交获得的DNA。这些DNA的特定示例包括可通过在65℃下利用固定化有源自菌落或噬菌斑的DNA或DNA片段的滤膜进行杂交并在65℃下对滤膜进行冲洗而鉴定DNA。可按照分子生物学实验方法(WILEY Interscience，1989)等中现有的方法进行杂交。在严格条件下进行杂交的DNA的一个示例为与作为探针的DNA具有特定百分比或更高同源性的DNA。在本发明中，“含有展示出与核苷酸序列的完整序列或具有其15个或更多核苷酸的一部分具有80％或更多同源性的DNA”的同源性为，如80％或更多，优选90％或更多，以及最优选95％或更多。

下一步，描述了获取本发明中的氧化酶和本发明中的基因的方法。

本发明中的氧化酶可通过筛选源自微生物、动物或植物的酶来从自然界获得。也可利用如基因工程技术或突变处理等方法对具有与本发明中的酶不同的物理化学特性的果糖基氨基酸氧化酶(下文称作“具有不同特性的氧化酶”)进行修饰来获取本发明中的氧化酶。具有与本发明中的酶不同特性的氧化酶为，如上述已知的氧化酶等。其也可为通过筛选获得的新果糖基氨基酸氧化酶，以及通过利用基因工程技术等进行修饰获得的果糖基氨基酸氧化酶。已知的氧化酶的示例优选源自棒状杆菌属细菌的果糖基氨基酸氧化酶(日本专利公开(Kokoku)NO.6-65300)。

用于对具有不同特性的氧化酶的物理化学特性进行修饰的方法的示例包括：利用如紫外线、X-射线或放射性射线等对微生物等进行照射以产生氧化酶；或将微生物与诱变试剂如乙基甲烷磺酸、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍或亚硝酸进行接触；获取产生了本发明中的修饰后的氧化酶的微生物；并随后从已获得的微生物体中获取本发明中的氧化酶。

然而，一般来讲，可通过利用基因工程技术修饰编码具有不同特性的氧化酶等的基因来获取本发明中的氧化酶。作为编码具有与本发明中的酶不同特性的氧化酶的基因，只要通过修饰利用此基因可获得本发明中的氧化酶，那就可选用编码任何果糖基氨基酸氧化酶的任何基因。

利用常规的和通用的基因克隆方法获得了编码与本发明中应用的氧化酶具有不同特性的氧化酶基因。例如，利用标准方法，如分子生物学实验方法(WILEY Interscience，1989)等中现有的方法从能够生产具有不同特性的氧化酶的微生物体和多种细胞中提取染色体DNA或mRNA。进一步，可以mRNA为模板合成cDNA。构建了以此获得的染色体DNA或cDNA文库。下一步在上述具有不同特性的上述氧化酶的氨基酸序列基础上合成了合适的探针DNA，随后利用此探针筛选染色体DNA或cDNA文库；或在上述氨基酸序列基础上制备了适当的引物DNA，利用适当的多聚酶链式反应(PCR法)如3’RACE或5’RACE法对含有靶基因片段的DNA进行扩增，随后将它们连接在一起，这样就获得了含有全长靶基因的DNA。这样获得的编码具有不同特性的氧化酶的基因的优选示例为源自棒状杆菌属细菌的果糖基氨基酸氧化酶基因(日本专利公开(Kokai)NO.11-155579)。在操作方面，可按照标准方法将这些基因优选的连接到多种载体上。例如，利用如QIAGEN(Qiagen)从含有编码具有不同特性的氧化酶且源自分离的棒状杆菌属物种菌株2.4.1的基因的重组质粒pFA5 DNA(日本专利公开(Kokai)NO.11-155579)中提取和纯化这些基因。此外，本发明中应用的载体DNA示例包括质粒载体DNA如pUC119(Takara Shuzo)、pBR322(TakaraShuzo)和pMAL-C2(NEW England Labs)以及细菌噬菌体载体DNA如λENBL3(Stratagene)和λDASH II(FUNAKOSHI)。特别的，例如优选pBluescript II SK⁺(Stratagene)。

其次，可对编码利用上述方法获得的具有不同特性的氧化酶的基因进行修饰以获得本发明中的氧化酶。特别的，在本发明中，对编码具有不同特性的氧化酶的基因进行修饰造成了这些基因所翻译的具有不同特性的氧化酶的氨基酸序列改变。因此，在本发明中的氧化酶之外，获得了具有不同特性的未修饰的氧化酶和多种具有不同物理化学特性的果糖基氨基酸氧化酶。

没有对用于进行修饰且编码具有不同特性的氧化酶的基因进行特别限制。本发明的一个实施方案为编码具有不同特性的、源自棒状杆菌属物种菌株2.4.1(日本专利公开(Kokai)NO.11-155579，SEQ IDNO：3)的基因。进一步，另一方案为具有进行了修饰的核苷酸序列的基因，从而不具有或具有适于在宿主生物体内进行基因表达的氨基酸残基的添加、缺失或取代。

作为上述基因的修饰方法，可以选用任何已知方法。这些方法的示例包括可使上述重组质粒pFA5DNA(日本专利公开(Kokai)NO.11-155579)与突变化学试剂如羟胺或亚硝酸进行接触的方法，或点突变法，如涉及利用PCR法这一已知的技术进行随机化修饰的突变方法、利用商业试剂盒引起定点取代或缺失突变的定点诱变、以及可选择性切割重组质粒DNA并去除或添加并连接选定的寡核苷酸的寡核苷酸诱变法。紧接上述处理，利用QIAGEN脱盐柱(Qiagen)等对重组DNA进行纯化，从而得到了多种重组DNA。

例如，利用这样获得的多种重组DNA对大肠杆菌K12，优选大肠杆菌JM109或DH5α(皆由TOYOBO制备)，或XL1-Blue(FUNAKOSHI)进行转化或转导，这样就获得了包含具有多种修饰的果糖基氨基酸氧化酶基因片段的重组DNA的转化体或转导体。至于转化体，例如具有本发明的靶物理化学特性(在高温度范围内具有稳定性)的转化体(产生本发明中的氧化酶的菌株)是选自已获得的转化体(其含有重组体质粒DNA，而此质粒DNA含有多种突变果糖基氨基酸氧化酶基因)。

其次，为了筛选产生本发明中的氧化酶的菌株，例如，可选用下列方法。首先，利用无菌绒布等从上文获得的转化体已在其上形成了菌落的LB琼脂培养基中获取了多个复制物，随后将它们转移到新鲜的琼脂培养基上进行培养。当琼脂培养基上复制平铺的菌落达到足够大小时，将在裂解试剂如溶菌酶中浸过的膜铺到培养基上。随后，将培养基在37℃下静置1小时进行裂解。此时，裂解后的粗酶液吸附到了膜上。将吸附有粗酶液的膜在55℃下静置1小时后，将膜置于用含有底物果糖基甘氨酸、过氧化物酶、TOOS及4-氨基安替比林的0.1M磷酸钾缓冲溶液(pH8.0)浸没的膜上，随后观察紫色产生的程度。利用类似的方法也对产生未修饰的、具有不同特性的氧化酶的菌株进行紫色产生检验。因此，通过对比紫色的产生就可对靶转化体进行筛选。

可利用这种方式获得能够产生本发明中的氧化酶的转化体。示例为本发明中含有SEQ ID NO：2所表示的氨基酸序列的氧化酶，其是利用上述修饰方法对源自具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列棒状杆菌属细菌的果糖基氨基酸氧化酶(日本专利公开(Kokoku)NO.6-65300)进行修饰获得的。如果必要，可利用能够产生本发明中的氧化酶的转化体通过上述修饰方法对本发明中的基因进一步进行重复修饰，这样就能够得到具有高热抗性的、本发明的修饰后氧化酶和能够产生氧化酶的转化体。特别的，在本发明中，本发明中的氧化酶也包括，例如含有通过对SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列缺失、取代和/或添加一个或多个氨基酸而获得的氨基酸序列的果糖基氨基酸氧化酶，以及含有展示出与SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列具有80％或更多同源性氨基酸序列的果糖基氨基酸氧化酶。一个特定示例为在实施例中描述的本发明的氧化酶(3型)。3型氧化酶通过对氨基酸残基进行取代而具有源自SEQ ID NO：2所表示的氨基酸序列并具有90％或更多同源性。进一步，这样获得的产生本发明的氧化酶的转化体示例为可产生本发明的氧化酶(4型)的大肠杆菌(E.coli)DH5α(pFAH5)，当在50℃下热处理10分钟时其具有90％的剩余活性，并且其具有SEQ ID NO：2所表示的氨基酸序列。

此外，本发明的基因的示例为上述本发明的氧化酶(4型)的基因(SEQ ID NO：4)。如上所述，含有包含编码SEQ ID NO：2的SEQ IDNO：4的基因的质粒pFAH5保藏(最开始的保藏日期：2000年11月22日)在国际专利生物保藏中心Depositary(IPOD)，通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，日本(Centra16，1-1-1，Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)，保藏号为FERM BP-7378。本发明中的基因的进一步的示例为编码本发明中的氧化酶，例如含有通过对SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列缺失、取代和/或添加一或多个氨基酸而获得的氨基酸序列的果糖基氨基酸氧化酶，以及含有展示出与SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列具有80％或更多同源性的氨基酸序列的果糖基氨基酸氧化酶。本发明的基因的另一个示例为包含在严格条件下与包含一种核苷酸序列的DNA杂交，并且编码具有新的果糖基氨基酸氧化酶活性的蛋白的DNA，所述核苷酸序列互补于包含SEQ IDNO：4所表示的核苷酸序列的DNA的完整序列或其具有15个或更多核苷酸的一部分，或者包含与包含DNA SEQ ID NO：4表示的核苷酸序列的DNA的完整序列或其具有15个或更多核苷酸的一部分具有80％或更多同源性，并且编码具有新的果糖基氨基酸氧化酶活性的蛋白的DNA。“具有15个或更多核苷酸的一部分”的特定示例包括SEQ ID NO：1-14的核苷酸序列，其为SEQ ID NO：4的部分序列。此外，另一含有展示出80％或更多同源性的核苷酸序列的DNA示例为包含利用定位于SEQ IDNO：3的151位核苷酸上游的核苷酸序列取代定位于SEQ ID NO：4的151位核苷酸上游的核苷酸序列而从SEQ ID NO：4得到的核苷酸序列的DNA，因为它编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

其次，本发明中的氧化酶是通过在培养基中培养能够产生本发明中的氧化酶的微生物并从培养物中收集果糖基氨基酸氧化酶来制备的。只要其能够产生本发明中的氧化酶，任何微生物可用来生产本发明中的氧化酶。这样的微生物的示例包括上文获得的且能够产生本发明中的氧化酶的转化体或转导体。例如，本发明中的氧化酶可利用能够产生本发明中的氧化酶且优选属于大肠杆菌属的转化体菌株来制备。上述微生物可利用固体培养法进行培养，但优选利用液体培养法进行培养。此外，用于培养上述微生物的培养基含有，如一或多种氮源，如酵母提取物、蛋白胨、肉提取物、玉米浆或大豆浸出物或小麦酒曲，其中添加有一或多种无机盐如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化铁、硫酸铁或硫酸锰。如果必要，培养基可适当的进一步添加糖、维生素等。此外，可适当调节培养基的初始pH为7-9。此外，优选通过具有通气和搅拌的浸没培养、振荡培养、静态培养等在30-42℃下，优选37℃培养6-24小时。为了从培养后的培养物中收集本发明中的氧化酶，应用了通用的测定法对收集的酶进行测定。例如，利用如过滤和离心并随后冲洗等方法从培养物溶液中分离微生物体。优选从微生物体中收集本发明中的氧化酶。在这种情况下，可完整使用微生物体。优选的，如通过利用多种破裂措施如超声波、弗氏压碎器、或dyno-mill进行微生物体破碎的方法、利用细胞壁裂解酶如溶菌酶裂解微生物细胞壁的方法或利用表面活性剂如Triton X-100从微生物体中提取酶的方法来从微生物体中收集本发明中的氧化酶。

为了从获得的粗酶液中分离本发明中的氧化酶，可选用通常用于酶纯化的方法来进行分离。例如，优选结合使用硫酸胺盐析、有机溶剂沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析、吸附层析和电泳。以这种方式，本发明中的氧化酶的纯化程度可达到在SDS-PAGE中几乎为一条单独的电泳条带。此外，按照它们的应用，适当结合利用上述方法，可以得到在纯化程度上有差别的酶样品。

测定本发明中的酶的活性的重要方法的示例包括用于测定酶反应中产生的过氧化氢量的方法以及用于测定酶反应中消耗的氧的量的方法。作为一个示例，下文展示了测定过氧化氢量的方法。在下文中，除非特别指出，果糖基甘氨酸用作测定本发明中的酶活性的底物。1单位(1U)酶效价定义为当以果糖基甘氨酸为底物进行测定时每分钟产生1μmol过氧化氢所需的酶量。

A.试剂制备

(1)试剂1：POD-4-AA溶液

将1.0kU过氧化物酶(TOYOBO，TYPE III)和100mg 4-氨基安替比林(Tokyo Kasei Kogyo)溶解在0.1M磷酸钾缓冲溶液(pH8.0)中并稀释到1L。

(2)试剂2：TOOS溶液

将500mg TOOS(DOJINDO)溶解在离子交换水中并稀释到100mL。

(3)试剂3：底物溶液(150mM，终浓度：5mM)

将357mg果糖基甘氨酸溶解在离子交换水中并稀释到10ml。当利用果糖基缬氨酸和ε-果糖基赖氨酸作为底物时，这种情况下应用的溶液是通过将417mg果糖基缬氨酸或462mgε-果糖基赖氨酸溶解在离子交换水中并稀释到10ml制得的。

B.测定方法

在添加了酶液并与溶液混合后，在37℃下加热(预热)5分钟。随后，向其中添加100ul试剂3并混合均匀。利用分光光度计(U-2000A，Hitachi)测定555nm下的吸光度。待测定的值是在混合后1-3分钟时间内每分钟555nm处吸光度值的变化。此外，除了添加的是100μl离子交换水而不是试剂3外，利用与上述相似的方法制备了对照溶液。随后，通过利用以前制备的过氧化氢标准溶液而不是试剂3以及利用离子交换水而不是酶溶液进行的检验制作了一个图来展示其与产生的色素体积的关系。利用此图，计算了在37℃下每分钟产生的过氧化氢的量(微摩尔)并将此值定义为酶溶液中的活性单位。

实施例

利用下列实施例对本发明进行更特别的描述。这些实施例没有用来限制本发明的技术领域的意图。

(A)制备重组质粒

分别制备了具有不同特性的氧化酶基因(具有SEQ ID NO：3的核苷酸序列的基因，编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的基因)的重组质粒DNA以及具有氧化酶基因的重组质粒DNA，其中已经对此基因编码氨基末端的核苷酸序列区进行了修饰以适于大肠杆菌利用密码子，从而提高基因在大肠杆菌中的表达量。为了制备下述的本发明中的氧化酶，可应用任何质粒。利用具有修饰的氧化酶基因的重组质粒DNA在大量生产本发明中的氧化酶方面是有效的。

(1)制备重组质粒pFA5 DNA

将含有上述氧化酶基因(含有SEQ ID NO：3所表示的核苷酸序列的基因)的重组质粒的大肠杆菌DH5α(pFA5)接种到20mlLB培养基(1％ Bacto-Trypton，0.5％酵母提取物，及0.25％NaCl)中，随后在37℃下振荡培养20小时，以此来获得培养物。上述大肠杆菌DH5α(pFA5)保藏(最开始的保藏日期：1997年11月21日)在国际专利生物保藏中心Depositary(IPOD)，通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，日本(Central 6，1-1-1，Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)，保藏号为FERM BP-6182。将培养物在7000rpm下离心5分钟收集细菌，从而获得了菌体。随后利用QIAGEN tip-100(Qiagen)从菌体中提取并随后纯化重组质粒pFA5 DNA，这样获得了100μg重组质粒pFA5 DNA。

(2)制备在氨基末端侧链上具有修饰的核苷酸序列的重组质粒pFAN5 DNA

利用Sawaday Technology的客户合成服务获得了具有在SEQ IDNO：3的氨基末端核苷酸序列信息基础上设计用于大肠杆菌密码子使用的SEQ ID NO：4部分序列或其互补链，SEQ ID NO：5-12的核苷酸序列的寡核苷酸，以及具有设计来利用PCR法扩增SEQ ID NO：3的羧基末端的SEQ ID NO：13和14的核苷酸序列的寡核苷酸。利用T4多核苷酸激酶(Takara Shuzo)分别对SEQ ID NO：5-12的序列进行磷酸化。同时，以具有SEQ ID NO：3的核苷酸序列的pFA5 DNA为模板、以SEQID NO：13和14为引物、以及Ex Taq多聚酶(Takara Shuzo)进行PCR反应，以此制备编码C末端侧的基因片段。此外，利用Nde I(Daiichi Pure Chemicals)和BamH I(Takara Shuzo)对片断进行消化。此外，利用Nde I对pUTE 500k’DNA(在Journal ofBiotechnology  52(1996)11-20中有描述)进行消化后，通过BAP处理进行脱磷酸化(此处所用试剂由Takara Shuzo生产)。将适量的利用上述方法获得的6磷酸化寡核苷酸、源自pFA5DNA的基因片断以及pUTE500k’DNA混合，随后利用连接试剂盒ver.2(Takara Shuzo)进行连接。将获得的质粒命名为pFAF5。此外，利用BamH I和Bgl II对质粒进行消化，并将其插入到在利用BamH I切割后利用BAP处理的pBluescript II SK⁺中。产物命名为pFAN5。随后，利用(1)中描述的方法制备了100μg pFAN5 DNA。

(B)制备本发明中的氧化酶及能够产生本发明中的氧化酶的转化体

(1)修饰方法(给予热抗性)

利用上述的100μg重组质粒pFAN5 DNA中的20μg重组质粒，按照D.M.Morrison(Enzymology，68，326-331，1979)中的方法对XL1-RED(STRATAGENE)(当进行增殖时，其可在质粒复制中产生错误，这样可很容易进行修饰)进行转化，这样获得了大约5000株转化体菌株。为了从所有克隆中收集质粒DNA，将QIAGEN sol I(Qiagen)接种到琼脂培养基上，利用涂布器将所有菌落耙到一起，然后利用吸管进行收集。随后，利用标准的QIAGEN法获得了100μg修饰后的重组质粒pFAN5DNA。按照D.M.Morrison(Method inEnzymology，68，326-331，1979)中的方法，利用20ug pFAN5 DNA对大肠杆菌DH5a(TOYOBO)进行转化，随后获得了大约1000株具有修饰的质粒的转化体菌株。

(2)筛选可产生本发明的氧化酶的菌株

首先，利用无菌绒布在新琼脂培养基上复制平铺上述获得的所有转化体，随后在30℃下培养过夜。将浸泡在10mg/ml溶菌酶(Sigma)中的Hybond-N⁺(Amersham)置于获得的复制菌落上，同时要避免其间进入气泡，随后在37℃下静置30分钟。然后，从琼脂培养基中去除Hybond-N⁺，然后将其置于新的琼脂培养基上，其表面(粗酶液粘附其上)要置于前面，然后在55℃下处理1小时。同时，将Hybond-N⁺浸没于含有2mM果糖基甘氨酸、1mg/ml过氧化物酶(TOYOBO)、1mg/ml4-氨基安替比林(Tokyo Kasei)和10mg/ml TOOS(DOJINDO)的0.1M磷酸钾缓冲液(pH8.0)中。将这样制备得到的Hybond-N⁺置于以前的Hybond-N⁺上，其已经置于菌落上的表面朝里，并随后在30℃下静置。然后，筛选出所有菌落中的展示出高水平显色的菌株。

将这样获得的10株显色菌株与液体在2ml LB培养基(添加有50μg氨苄青霉素)中进行培养，随后可产生包含在质粒中的修饰的果糖基氨基酸氧化酶。培养结束后，利用超声波将获得的培养产物破裂。在47℃下对0.5ml粗酶提取物处理10分钟，随后在12000rpm下离心5分钟，以此来收集上清液。对上清液和未处理的粗酶提取物的活性进行测定，这样就可计算得到剩余的活性比率(上清液中的活性/未处理粗酶液中的活性)。同样的，进行培养、提取、热处理和活性测定操作。对比修饰的氧化酶和具有不同特性的未修饰的氧化酶的剩余活性比率。因此，获得了具有改进的25％剩余活性的修饰的果糖基氨基酸氧化酶(1型)和产生氧化酶的大肠杆菌。

(3)修饰的积累

按照(A)(1)中描述的方法，从产生上步获得的(修饰后的)氧化酶(I型)的菌株中制备质粒DNA。按照(1)中的方法重新导入突变。随后，以以前获得的(修饰后的)氧化酶(I型)作为进行比较的对照，按照(2)中的方法进行筛选。当在47℃下进行10分钟热处理时，利用这样的方法获得的大肠杆菌产生的进一步修饰的果糖基氨基酸氧化酶(2型)展示出改进的70％的剩余活性比率。

利用可产生上述的进一步修饰的氧化酶(2型)的大肠杆菌重复了与上文类似的步骤。当在50℃下进行10分钟热处理时，利用这样的方法获得的大肠杆菌产生的本发明的氧化酶(3型)展示出改进的80％的剩余活性比率。利用可产生本发明中的氧化酶(3型)的大肠杆菌重复了与上文类似的步骤。当在50℃下进行10分钟热处理时，利用这样的方法获得的大肠杆菌DH5α(pFAH5)产生的本发明的氧化酶(4型)展示出改进的90％的剩余活性比率。编码本发明中的氧化酶(4型)的基因的质粒pFAH5保藏在国际专利生物保藏中心Depositary(IPOD)，通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，日本(Central 6，1-1-1，Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)，保藏号为FERM BP-7378。

(4)鉴定修饰发生的位点

收集含有修饰的果糖基氨基酸氧化酶基因的质粒，随后利用370ADNA序列分析系统(Applied Biosystems)确定核苷酸序列。在核苷酸序列基础上，对修饰后的氨基酸残基进行鉴定。

因此，本发明中的氧化酶(4型)基因展示出具有SEQ ID NO：4表示的核苷酸序列。此外，如SEQ ID NO：2所示，预测的氨基酸序列是通过利用甘氨酸取代60位的苏氨酸、利用甘氨酸取代188位的丙氨酸、利用亮氨酸取代244位的蛋氨酸、利用丝氨酸取代257位的天冬酰胺、利用蛋氨酸取代261位的亮氨酸而从SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列衍生获得的。同样的，证明本发明中的氧化酶(3型)是通过利用甘氨酸取代60位的苏氨酸、利用甘氨酸取代188位的丙氨酸、利用亮氨酸取代244位的蛋氨酸、利用蛋氨酸取代261位的亮氨酸而从SEQID NO：1表示的氨基酸序列衍生获得的。

(C)本发明中的氧化酶的制备及其物理化学特性

如上所述获得了产生本发明的氧化酶(4型)的转化体并将大肠杆菌DH5α(pFAH5)接种到10L LB-amp培养基中，随后在1L/min通气量和600rpm搅拌速度条件下，在30℃下利用罐发酵器振荡培养24小时。在7000rpm下将获得的10L培养物溶液离心10分钟以收集细菌，随后将细菌悬浮在1L 50mM磷酸钾缓冲溶液(pH8.0)中。随后，利用超声波使菌体破裂并在10000rpm下离心10min以收集上清液，这样就制得了粗酶溶液。向此5kU粗酶溶液中添加氯化钾，使其终浓度达到0.1M。将此溶液吸附到已经利用含有0.1M氯化钾的50mM磷酸钾缓冲溶液(pH8.0)平衡过的1L DEAE-Sephacel柱层析上，随后利用1L相同的缓冲溶液冲洗。然后，各利用10L含有0.2M氯化钾的50mM磷酸钾缓冲溶液(pH8.0)及含有0.4M氯化钾的50mM磷酸钾缓冲溶液(pH8.0)对酶活性部分进行梯度洗脱。活性部分的比活性为2.4U/OD280nm。

本发明中获得的氧化酶(4型)的物理化学特性如下。

(1)作用和底物特异性

以果糖基甘氨酸、果糖基缬氨酸和ε-果糖基赖氨酸为底物，利用上述的酶活性测定法测定了本发明中的酶的活性。本发明中的氧化酶作用于果糖基甘氨酸和果糖基缬氨酸，但不作用于ε-果糖基赖氨酸。

(2)最佳pH

在37℃的每一pH下，利用缓冲溶液如McIlvaine缓冲液(pH4.0-6.0)、100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0-8.5)或100mM碳酸氢钠碳酸盐缓冲液(pH9.0-10.0)进行酶反应。结果得到的相对活性如图1所示。如图1中所示，本发明中的氧化酶的最佳pH为7.5-8.5。

(3)作用的最佳温度范围

在多个温度下，利用与文中描述的酶活性测定方法中应用的反应溶液组成相同的反应溶液来测定酶活性。结果如图2所示。如图2所示，本发明中的氧化酶的最佳作用温度为40-50℃。

(4)稳定pH范围

在每个pH下，利用缓冲溶液如McIlvaine缓冲液(pH3.0-6.0)、100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0-8.5)或100mM碳酸氢钠碳酸盐缓冲液(pH8.5-10.0)在37℃下进行10min处理后，测定了本发明中的氧化酶的剩余活性。剩余活性结果如图3所示。如图3所示，本发明中的氧化酶的稳定pH为5.0-10.0。

(5)热稳定性

当利用100mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)在每个温度下进行10min处理时，热稳定性结果如图4所示。本发明中的氧化酶在45℃左右保持稳定。

(6)分子量

按照标准方法，通过利用Sephadex G-200进行的柱凝胶过滤法(在含有0.1M氯化钾的50mM磷酸钾缓冲溶液(pH8.0)中)和通过利用multi-gel10/20(Daiichi Pure Chemicals)进行的SDS-PAGE发现了其分子量。本发明中的氧化酶的分子量约为88,000(利用凝胶过滤确定)或约为44,000(利用SDS-PAGE确定)。

(7)等电点

按照标准方法，利用等电聚焦法测定得到本发明中的氧化酶的等电点约为pH4.2。

工业实用性

按照本发明，提供了当作为临床诊断试剂中的酶时具有较高热稳定性的新的果糖基氨基酸氧化酶、编码此酶的基因、其中的基因插入到载体DNA中的重组DNA、包含此基因的转化体等、以及制备氧化酶的方法。因此，本发明是在工业上是有用的。

本说明书包含作为本申请优先权文件的日本专利申请No.2000-360590和2001-243049的说明书中公开的部分或全部内容。此处引用的所有出版物、专利和专利申请在此处都全文引用作为参考文献。

                         序列表

<110>龟甲万株式会社

<120>新的果糖基氨基酸氧化酶

<130>PH-1294-PCT

<140>

<141>

<150>JP 2000-360590

<151>2000-11-28

<150>JP-2001-243049

<151>2001-08-10

<160>14

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>372

<212>PRT

<213>棒状杆菌(Corynebacterium sp.)

<400>1

Met Ser Ser Thr Ala Thr Lys His Val Ala Val Ile Gly Gly Gly Ile

1               5               10                  15

Leu Gly Val Ser Thr Ala Val His Leu Leu Arg Gln Gly Ala Thr Val

            20              25                  30

Thr Leu Leu Thr Glu Gln Gly Leu Ala Ser Glu Ala Thr Gly Arg Ser

        35              40                  45

Leu Ser Trp Leu Asn Ser Ala Gly Glu Arg Ser Thr Pro Tyr His Gln

    50              55                  60

Leu Arg Ile Ala Gly Val Asp Arg Tyr Arg Thr Leu Phe Ala Ala Asp

65              70                  75                  80

Pro Ser Arg Glu Trp Leu Gln Phe Gly Gly Gly Leu Met Trp Asn Ala

            85                  90                  95

Ala Gly Glu Ser Glu Val Thr Lys Ala Arg His Ala Tyr Glu Lys Ser

        100                 105                 110

Ile Gly Tyr Asp Ser Gln Leu Leu Ala Pro Glu Glu Ile Gly Ser Val

        115                 120                 125

Thr Pro Gly Ile Asp Ala Ser Ala Val Pro Glu Asn Ala Ile Phe Asn

    130                 135                 140

Pro Gly Glu Gly Trp Val Ser Leu Pro Asp Leu Val Asn Phe Leu Met

145                 150                 155                 160

Glu Glu Phe His Ala Leu Gly Gly Gln Leu Val Leu Asn Ala Gly Lys

                165                 170                 175

Ala Ser Val Met Val Glu Gly Gly Arg Ala Thr Ala Val Glu Thr Ala

            180                 185                 190

Thr Gly Glu Thr Tyr Pro Ala Asp Ala Val Leu Val Ala Cys Gly Ala

        195                 200                 205

Ala Thr Pro Ala Val Val Lys Pro Leu Gly Val Glu Ile Pro Asn Gly

    210                 215                 220

Ser Pro Val Ser Met Leu Val Val Thr Lys Pro Val Glu His Gln Val

225                 230                 235                 240

Ala Ala Val Met Asn Thr Pro Arg Ala Ala Val Arg Pro Asn Pro Gly

                 245                250                 255

Asn Thr Phe Ala Leu Asp His Asp Trp Tyr Glu Gly His Ile Thr Glu

            260                 265                 270

His Ala Asp Gly Ser Phe Thr Ile Pro Asp Asp Val Val Gln Glu Leu

        275                 280                 285

Ala Asp Glu Ser Ser Lyg Leu Ile Ala Gly Asn Pro Glu Leu Lys Pro

    290                 295                 300

Ala Ser Trp Lys Ile Gly Tyr Lys Pro Ile Pro Gly AsP Gly Glu Pro

305                 310                 315                 320

Val Phe Gly Glu Leu Gly Arg Val Pro Gly Cys Phe Val Ala Phe Thr

                325                 330                 335

His Ser Gly Ala Thr Leu Gly Leu Ile Ala Gly Glu Leu Leu Ser Gly

            340                 345                 350

Glu Ile Leu Thr Gly Asp Lys His Pro Met Phe Ala Thr Phe Arg Pro

        355                 360                 365

Gly Arg Phe Ser

    370

<210>2

<211>372

<212>PRT

<213>棒状杆菌(Corynebacterium sp.)

<400>2

Met Ser Ser Thr Ala Thr Lys His Val Ala Val Ile Gly Gly Gly Ile

1               5                   10                  15

Leu Gly Val Ser Thr Ala Val His Leu Leu Arg Gln Gly Ala Thr Val

            20                  25                  30

Thr Leu Leu Thr Glu Gln Gly Leu Ala Ser Glu Ala Thr Gly Arg Ser

        35                  40                  45

Leu Ser Trp Leu Asn Ser Ala Gly Glu Arg Ser Ala Pro Tyr His Gln

    50                  55                  60

Leu Arg Ile Ala Gly Val Asp Arg Tyr Arg Thr Leu Phe Ala Ala Asp

65                  70                  75                  80

Pro Ser Arg Glu Trp Leu Gln Phe Gly Gly Gly Leu Met Trp Asn Ala

                85                  90                  95

Ala Gly Glu Ser Glu Val Thr Lys Ala Arg His Ala Tyr Glu Lys Ser

            100                 105                 110

Ile Gly Tyr Asp Ser Gln Leu Leu Ala Pro Glu Glu Ile Gly Ser Val

        115                 120                 125

Thr Pro Gly Ile Asp Ala Ser Ala Val Pro Glu Asn Ala Ile Phe Asn

    130                 135                 140

Pro Gly Glu Gly Trp Val Ser Leu Pro Asp Leu Val Asn Phe Leu Met

145                 150                 155                 160

Glu Glu Phe His Ala Leu Gly Gly Gln Leu Val Leu Asn Ala Gly Lys

                165                 170                 175

Ala Ser Val Met Val Glu Gly Gly Arg Ala Thr Gly Val Glu Thr Ala

            180                 185                 190

Thr Gly Glu Thr Tyr Pro Ala Asp Ala Val Leu Val Ala Cys Gly Ala

        195                 200                 205

Ala Thr Pro Ala Val Val Lys Pro Leu Gly Val Glu Ile Pro Asn Gly

    210                 215                 220

Ser Pro Val Ser Met Leu Val Val Thr Lys Pro Val Glu His Gln Val

225                 230                 235                 240

Ala Ala Val Leu Asn Thr Pro Arg Ala Ala Val Arg Pro Asn Pro Gly

                245                 250                 255

Ser Thr Phe Ala Met Asp His Asp Trp Tyr Glu Gly His Ile Thr Glu

            260                 265                 270

His Ala Asp Gly Ser Phe Thr Ile Pro Asp Asp Val Val Gln Glu Leu

        275                 280                 285

Ala Asp Glu Ser Ser Lys Leu Ile Ala Gly Asn Pro Glu Leu Lys Pro

    290                 295                 300

Ala Ser Trp Lys Ile Gly Tyr Lys Pro Ile Pro Gly Asp Gly Glu Pro

305                 310                 315                 320

Val Phe Gly Glu Leu Gly Arg Val Pro Gly Cys Phe Val Ala Phe Thr

                325                 330                 335

His Ser Gly Ala Thr Leu Gly Leu Ile Ala Gly Glu Leu Leu Ser Gly

            340                 345                 350

Glu Ile Leu Thr Gly Asp Lys His Pro Met Phe Ala Thr Phe Arg Pro

        355                 360                 365

Gly Arg Phe Ser

    370

<210>3

<211>1116

<212>DNA

<213>棒状杆菌(Corynebacterium sp.)

<400>3

atgtcctcca ccgctaccaa gcatgtcgcc gtcattggcg gcggcatcct gggcgtctcc 60

accgccgtcc acctgctccg ccaaggcgca acagtcaccc tcttgaccga acagggcctc 120

gccagcgaag ccacgggccg gtccttgtcc tggctcaact ccgccgggga acgctccact 180

ccctatcacc agctgcgcat cgctggcgtt gaccggtacc gcacgctgtt cgccgccgat 240

cccagccggg aatggttgca gttcgggggc gggctcatgt ggaacgccgc cggggaaagt 300

gaggtcacca aagcccggca cgcctacgag aagtccatcg gctacgactc ccaactgctg 360

gcccctgaag aaatcggctc ggtcacgcca ggcatcgacg ccagtgccgt cccggagaac 420

gcaatcttca atcctggcga gggctgggtc agcctgccgg acctggtgaa cttcctgatg 480

gaggaattcc acgccctggg cggccagttg gtcctcaacg caggtaaagc ctcggtgatg 540

gtcgagggcg gccgggctac cgcggtcgaa accgccaccg gtgaaaccta ccccgcggac 600

gccgttctcg tagcctgcgg tgccgcgacg ccggccgtcg taaaaccgct cggggtcgag 660

ataccgaacg gttccccggt ctccatgctg gttgttacca agcccgtgga gcaccaggtc 720

gcggcagtga tgaatacgcc gcgcgctgcc gtgcgaccca atccgggtaa cacttttgcc 780

ttggatcacg actggtatga agggcacatc actgagcacg cggacggttc gttcaccatc 840

ccggatgatg tcgtccagga attggcagac gagtcatcca agctgatcgc aggaaacccc 900

gagctcaagc cggcatcgtg gaagatcggt tacaagccga tcccgggcga cggcgaacca 960

gtcttcgggg aactcggccg agtaccgggc tgcttcgtgg ctttcaccca ctcaggtgcc 1020

accctgggcc tcatcgcagg cgaattgctc tccggggaga tcctgacggg ggacaagcac 1080

cccatgttcg ccacgttccg gccgggccgg ttctcc                           1116

<210>4

<211>1116

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：人工合成的序列

<400>4

atgagcagca ctgctaccaa acatgtggcg gttattggtg gaggtattct gggtgttagc 60

actgcggttc atctgctgcg tcaaggtgca actgttaccc tgctgaccga acagggtctg 120

gcgagcgaag cgaccggtat atccctgtcc tggctcaact ccgccgggga acgctccgct 180

ccctatcacc agctgcgcat cgctggcgtt gaccggtacc gcacgctgtt cgccgccgat 240

cccagccggg aatggttgca gttcgggggc gggctcatgt ggaacgccgc cggggaaagt 300

gaggtcacca aagcccggca cgcctacgag aagtccatcg gctacgactc ccaactgctg 360

gcccctgaag aaatcggctc ggtcacgcca ggcatcgacg ccagtgccgt cccggagaac 420

gcaatcttca atcctggcga gggctgggtc agcctgccgg acctggtgaa cttcctgatg 480

gaggaattcc acgccctggg cggccagttg gtcctcaacg caggtaaagc ctcggtgatg 540

gtcgagggcg gccgggctac cggcgtcgaa accgccaccg gtgaaaccta ccccgcggac 600

gccgttctcg tagcctgcgg tgccgcgacg ccggccgtcg taaaaccgct cggggtcgag 660

ataccgaacg gttccccggt ctccatgctg gttgttacca agcccgtgga gcaccaggtc 720

gcggcagtgc tgaatacgcc gcgcgctgcc gtgcgaccca atccgggtag cacttttgcc 780

atggatcacg actggtatga agggcacatc actgagcacg cggacggttc gttcaccatc 840

ccggatgatg tcgtccagga attggcagac gagtcatcca agctgatcgc aggaaacccc 900

gagctcaagc cggcatcgtg gaagatcggt tacaagccga tcccgggcga cggcgaacca 960

gtcttcgggg aactcggccg agtaccgggc tgcttcgtgg ctttcaccca ctcaggtgcc 1020

accctgggcc tcatcgcagg cgaattgctc tccggggaga tcctgacggg ggacaagcac 1080

cccatgttcg ccacgttccg gccgggccgg ttctcc                           1116

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：人工合成的序列

<400>5

tatgagcagc actgctacca aaca                                    24

<210>6

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：人工合成的序列

<400>6

tgtggcggtt attggtggag gtattctggg tgttagca                     38

<210>7

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：人工合成的序列

<400>7

ctgcggttca tctgctgcgt caaggtgcaa ctgttaccct gc                42

<210>8

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：人工合成的序列

<400>8

tgaccgaaca gggtctggcg agcgaagcga ccggta                       36

<210>9

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：人工合成的序列

<400>9

accaataacc gccacatgtt tggtagcagt gctgctca                     38

<210>10

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：人工合成的序列

<400>10

gcagcagatg aaccgcagtg ctaacaccca gaataccacc                 40

<210>11

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：人工合成的序列

<400>11

gaccctgttc ggtcagcagg gtaacagttg caccttgac                  39

<210>12

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：人工合成的序列

<400>12

gatctaccgg tcgcttcgct cgcca                                 25

<210>13

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：人工合成的序列

<400>13

gaagccacgg gcggatccct gtcctggctc aactccgcc                  39

<210>14

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：人工合成的序列

<400>14

gggaattcca tatgctagga gaaccggccc ggccggaa                   38

Claims (6)

1.具有果糖基氨基酸氧化酶活性的下列蛋白(i)或(ii)：

(i)包含SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的蛋白；或

(ii)包含通过对SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列缺失、取代和/或添加一个或几个氨基酸而得到的氨基酸序列并具有果糖基氨基酸氧化酶活性的蛋白；

其中所述蛋白具有下列物理化学特性：

(a)作用和底物特异性：在氧存在下，通过氧化亚氨基二乙酸或其衍生物而催化产生二羟乙酸或α-酮醛、α-氨基酸和过氧化氢的反应，但不作用于ε-果糖基赖氨酸；

(b)最佳pH范围：7.5-8.5；

(c)稳定pH范围：5.0-10.0；

(d)作用的最佳温度范围：40℃-50℃；

(e)热稳定性：当在50℃下热处理10分钟时，展示出80％或更多的剩余活性；及

(f)分子量：利用凝胶过滤确定为88,000；利用SDS-PAGE确定为44,000。

2.编码具有果糖基氨基酸氧化酶活性的下列蛋白(i)或(ii)的基因：

(i)包含SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的蛋白；或

(ii)包含通过对SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列缺失、取代和/或添加一个或几个氨基酸而得到的氨基酸序列并具有果糖基氨基酸氧化酶活性的蛋白；

其中所述蛋白具有下列物理化学特性：

(a)作用和底物特异性：在氧存在下，通过氧化亚氨基二乙酸或其衍生物而催化产生二羟乙酸或α-酮醛、α-氨基酸和过氧化氢的反应，但不作用于ε-果糖基赖氨酸；

(b)最佳pH范围：7.5-8.5；

(c)稳定pH范围：5.0-10.0；

(d)作用的最佳温度范围：40℃-50℃；

(e)热稳定性：当在50℃下热处理10分钟时，展示出80％或更多的剩余活性；及

(f)分子量：利用凝胶过滤确定为88,000；利用SDS-PAGE确定为44,000。

3.包含下列DNA(i)或(ii)的基因：

(i)包含SEQ ID NO：4表示的核苷酸序列的DNA；或

(ii)在包括65℃下杂交和洗涤的严格条件下与包含一种核苷酸序列的DNA杂交，并且编码具有果糖基氨基酸氧化酶活性的蛋白的DNA，所述核苷酸序列互补于包含SEQ ID NO：4所表示的核苷酸序列的DNA的完整序列；

其中所述蛋白具有下列物理化学特性：

(a)作用和底物特异性：在氧存在下，通过氧化亚氨基二乙酸或其衍生物而催化产生二羟乙酸或α-酮醛、α-氨基酸和过氧化氢的反应，但不作用于ε-果糖基赖氨酸；

(b)最佳pH范围：7.5-8.5；

(c)稳定pH范围：5.0-10.0；

(d)作用的最佳温度范围：40℃-50℃；

(e)热稳定性：当在50℃下热处理10分钟时，展示出80％或更多的剩余活性；及

(f)分子量：利用凝胶过滤确定为88,000；利用SDS-PAGE确定为44,000。

4.一种重组DNA，其中权利要求2或3中的基因插入到载体DNA中。

5.含有权利要求4中的重组DNA的转化体或转导体。

6.制备果糖基氨基酸氧化酶的方法，该方法包括在培养基中培养权利要求5中的转化体或转导体并从培养产物中收集果糖基氨基酸氧化酶。

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