CN1484703A - 新颖的葡萄糖脱氢酶和生产该脱氢酶的方法 - Google Patents

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Abstract

在培养基中培养伯克霍尔德氏菌属并具有产生葡萄糖脱氢酶能力的微生物，并且从培养基和/或微生物细胞中收集葡萄糖脱氢酶，能得到新颖的葡萄糖脱氢酶，它是具有高底物特异性的酶，生产成本低，不受测试样本中溶解氧的任何影响，具有特别高的热稳定性。

Description

新颖的葡萄糖脱氢酶和生产该脱氢酶的方法
技术领域
本发明涉及新颖的葡萄糖脱氢酶和生产该酶的方法、编码该酶的DNA、包含编码该酶的DNA的重组载体、用该重组载体转化的转化体、产生该酶的新微生物、使用包括该酶、转化体或微生物的酶电极的葡萄糖传感器、和葡萄糖测定试剂盒。
背景技术
使用与特定底物特异性反应的酶的生物传感器在各种工业领域处于活跃的发展中。至于葡萄糖传感器，它是生物传感器的一种，具体而言，测量方法和利用这类方法的装置主要在医药领域处于活跃的发展中。
自从Clark和Lyonas于1962年首先报道了包含葡萄糖氧化酶与氧电极组合的生物传感器，葡萄糖传感器已有约40年的历史(L.C.Clark，J.和Lyonas，C.“Electrode systems for continuous monitoring incardiovascular surgery.”Ann.N.Y.Acad.Sci.，105：20-45)。
因而，采纳葡萄糖氧化酶作为葡萄糖传感器的酶已有很长的历史。这是因为葡萄糖氧化酶显示很高的葡萄糖底物特异性和优良的热稳定性，这种酶进一步能够被大规模生产，它的生产成本低于其他酶。
底物特异性高意味着这种酶不与除葡萄糖以外的其他糖反应，这便产生这样一个优点，能够实现精确的测量，测量值没有误差。
进而，热稳定性优良意味着能够防止关于热使酶变性和其酶活性失活的问题，这便产生这样一个优点，能够在长时间阶段内进行精确的测量。
不过，尽管葡萄糖氧化酶具有高底物特异性和优良的热稳定性，并且能够在低成本下生产，仍然面临这样一个问题，该酶受溶解氧的影响，如下所述，这会影响测量结果。
同时，除了葡萄糖氧化酶以外，利用葡萄糖脱氢酶的葡萄糖传感器也已得到发展。这种酶也在微生物中被发现。
例如，存在已知得自杆菌属的葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.1.47)和得自隐球菌属的葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.1.119)。
前者葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.1.47)是催化β-D-葡萄糖+NAD(P)+D-δ-葡糖酸内酯+NAD(P)H+H+反应的酶，后者葡萄糖脱氢酶(EC1.1.1.119)是催化D-葡萄糖+NADP+ D-δ-葡糖酸内酯+NADPH+H+反应的酶。上述得自微生物的葡萄糖脱氢酶已有市售。
这些葡萄糖脱氢酶具有这样一个优点，它们不受溶解在测量样本中的氧的影响。这便产生这样一个优点，能够实现精确的测量，不会导致测量结果的误差，即使测量是在氧分压低的环境中测量的或者使用需要大量氧的高浓度样本进行测量也是如此。
不过，尽管葡萄糖脱氢酶不受溶解氧的影响，仍然面临热稳定性差和底物特异性弱于葡萄糖氧化酶的问题。
因此，需要克服葡萄糖氧化酶和葡萄糖脱氢酶的缺点的酶。
本发明的发明人报道了他们关于使用从温泉附近的土壤收集的样本研究葡萄糖脱氢酶的结果：Sode K.，Tsugawa W.，Yamazaki T.，Watanabe M.，Ogasawara N.和Tanaka M.，Enzyme Microb.Technol.，19，82-85(1996)；Yamazaki T.，Tsugawa W.和Sode K.，Appli.Biochemi.and Biotec.，77-79/0325(1999)；Yamazaki T.，TsugawaW.和Sode K.，Biotec.Lett.，21，199-202(1999)。
不过，在这些研究的阶段尚未鉴别具有生产酶的能力的细菌菌株。
发明内容
本发明的一个目的是提供克服已知葡萄糖氧化酶和葡萄糖脱氢酶的缺点的酶，也就是这样一种酶，它显示高的底物特异性和优良的热稳定性，能够在低成本下生产，并且不受溶解在测量样本中的氧的影响。
进而，本发明的另一目的是提供生产上述酶的方法、利用该酶特征的蛋白质和产生该酶的新微生物。
本发明的另一目的是提供编码上述酶的DNA、含有编码该酶的DNA的重组载体和用该重组载体转化的转化体。
本发明的另一目的是提供使用包括上述酶、转化体或微生物的酶电极的葡萄糖传感器和包括上述酶的葡萄糖测定试剂盒。
本发明的发明人成功地从温泉附近的土壤中分离了洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkhorderia cepacia)，它产生实现上述目的的酶，从而完成了本发明。
因而，本发明提供下列各项。
(1)生产葡萄糖脱氢酶的方法，包括下列步骤：在培养基中培养具有葡萄糖脱氢酶产生能力的伯克霍尔德氏菌属微生物，从培养基和/或微生物细胞中收集葡萄糖脱氢酶。
(2)根据(1)的生产葡萄糖脱氢酶的方法，其中该微生物是洋葱伯克霍尔德氏菌。
(3)根据(1)或(2)的生产葡萄糖脱氢酶的方法，其中该葡萄糖脱氢酶具有下列性质：
(i)该酶具有催化葡萄糖脱氢反应的作用；
(ii)该酶由这样的亚单位组成，它们在还原条件下、在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示约60kDa的分子量和约43kDa的分子量；
(iii)该酶在使用TSK Gel G3000SW(Tosoh公司)的凝胶过滤色谱中显示约380kDa的分子量；和
(iv)该酶显示45℃左右的最佳反应温度(Tris-HCl缓冲液，pH8.0)。
(4)根据(3)的生产葡萄糖脱氢酶的方法，其中显示约43kDa分子量的亚单位是一种电子转移蛋白。
(5)根据(4)的生产葡萄糖脱氢酶的方法，其中该电子转移蛋白是细胞色素C。
(6)葡萄糖脱氢酶，它能够被伯克霍尔德氏菌属微生物产生。
(7)根据(6)的葡萄糖脱氢酶，其中该微生物是洋葱伯克霍尔德氏菌。
(8)根据(6)或(7)的葡萄糖脱氢酶，其中该葡萄糖脱氢酶具有下列性质：
(i)该酶具有催化葡萄糖脱氢反应的作用；
(ii)该酶由这样的亚单位组成，它们在还原条件下、在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示约60kDa的分子量和约43kDa的分子量；
(iii)该酶在使用TSK Gel G3000SW(Tosoh公司)的凝胶过滤色谱中显示约380kDa的分子量；和
(iv)该酶显示45℃左右的最佳反应温度(Tris-HCl缓冲液，pH8.0)。
(9)根据(8)的葡萄糖脱氢酶，其中显示约43kDa分子量的亚单位是一种电子转移蛋白。
(10)根据(9)的葡萄糖脱氢酶，其中该电子转移蛋白是细胞色素C。
(11)根据(8)至(10)任意一项的葡萄糖脱氢酶，其中显示约60kDa分子量的亚单位包含SEQ ID NO：3中第2至12氨基酸的氨基酸序列。
(12)根据(8)至(11)任意一项的葡萄糖脱氢酶，其中显示43kDa分子量的亚单位的N-末端具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
(13)根据(11)的葡萄糖脱氢酶，其中显示约60kDa分子量的亚单位是如下列(A)或(B)所定义的蛋白质：
(A)具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的蛋白质；
(B)具有包括一个或若干氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加的SEQ ID NO：3的氨基酸序列和葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质。
(14)根据(6)的葡萄糖脱氢酶，它在45℃左右和75℃左右显示活性峰。
(15)细胞色素C，它是根据(10)的葡萄糖脱氢酶的亚单位，并且具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
(16)DNA，它编码根据(15)的细胞色素C的一部分，并且具有SEQ IDNO：8的核苷酸序列。
(17)DNA，它编码根据(15)的细胞色素C的一部分，并且具有SEQ IDNO：1核苷酸序列中第2386至2467核苷酸的核苷酸序列。
(18)DNA，它编码根据(15)的细胞色素C的信号肽，并且包含SEQ IDNO：1核苷酸序列中第2386至2451核苷酸的核苷酸序列。
(19)肽，它是细胞色素C的信号肽，并且具有SEQ ID NO：4氨基酸序列中第1至22氨基酸的氨基酸序列。
(20)具有下列性质的蛋白质：
(i)该蛋白质能够作为亚单位构成根据(6)的葡萄糖脱氢酶；
(ii)该蛋白质具有葡萄糖脱氢酶活性；
(iii)  该蛋白质在还原条件下、在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示约60kDa的分子量；和
(iv)该蛋白质显示75℃左右的最佳反应温度(Tris-HCl缓冲液，pH8.0)。
(21)根据(20)的蛋白质，它包含SEQ ID NO：3中第2至12氨基酸的氨基酸序列。
(22)根据(21)的葡萄糖脱氢酶，其中该蛋白质是如下列(A)或(B)所定义的蛋白质：
(A)具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的蛋白质；
(B)具有包括一个或若干氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加的SEQ ID NO：3的氨基酸序列和葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质。
(23)如下列(A)或(B)所定义的蛋白质：
(A)具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的蛋白质；
(B)具有包括一个或若干氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加的SEQ ID NO：3的氨基酸序列和葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质。
(24)DNA，它编码如下列(A)或(B)所定义的蛋白质：
(A)具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的蛋白质；
(B)具有包括一个或若干氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加的SEQ ID NO：3的氨基酸序列和葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质。
(25)根据(24)的DNA，它是如下列(a)或(b)所定义的DNA：
(a)包含SEQ ID NO：1核苷酸序列中第764至2380核苷酸的核苷酸序列的DNA；
(b)在严格条件下可与包含SEQ ID NO：1中第764至2380核苷酸的核苷酸序列或能够从该序列制备的探针杂交、并且编码具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的DNA。
(26)包含根据(24)或(25)的DNA的重组载体。
(27)根据(26)的重组载体，它包含编码根据(18)的信号肽和β-亚单位的核苷酸序列。
(28)用根据(24)或(25)的DNA或根据(26)或(27)的重组载体转化的转化体。
(29)生产葡萄糖脱氢酶的方法，包括下列步骤：培养根据(28)的转化体以产生作为DNA的表达产物的葡萄糖脱氢酶，再收集之。
(30)洋葱伯克霍尔德氏菌KS1菌株(FERM BP-7306)。
(31)使用一种酶电极的葡萄糖传感器，该酶电极包括根据(6)至(14)任意一项的葡萄糖脱氢酶、根据(20)至(23)任意一项的蛋白质、根据(27)的转化体或根据(30)的菌株。
(32)葡萄糖测定试剂盒，包括根据(6)至(14)任意一项的葡萄糖脱氢酶或根据(20)至(23)任意一项的蛋白质。
(33)具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白质。
(34)编码一种蛋白质的DNA，该蛋白质具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
(35)根据(34)的DNA，它包含SEQ ID NO：1核苷酸序列中第258至761核苷酸的核苷酸序列。
(36)DNA，按顺序包含根据(34)或(35)的DNA和根据(24)或(25)的DNA。
(37)根据(36)的DNA，它包含SEQ ID NO：1核苷酸序列中第258至2380核苷酸的核苷酸序列。
(38)包含根据(36)或(37)的DNA的重组载体。
(39)根据(38)的重组载体，它包含编码根据(18)的信号肽和β-亚单位的核苷酸序列。
(40)用根据(36)或(37)的DNA或根据(38)或(39)的重组载体转化的转化体。
(41)生产葡萄糖脱氢酶的方法，包括下列步骤：培养根据(40)的转化体以产生作为根据(36)或(37)的DNA的表达物质的葡萄糖脱氢酶，再收集之。
下面将详细解释本发明。
(1)产生本发明葡萄糖脱氢酶的新细菌菌株
本发明的酶(以下也称为“该酶”或“GDH”)可以被伯克霍尔德氏菌属细菌产生。用于本发明的伯克霍尔德氏菌属细菌不受特别的限制，只要它是具有产生该酶能力的伯克霍尔德氏菌属细菌即可。不过，洋葱伯克霍尔德氏菌、特别是洋葱伯克霍尔德氏菌KS1菌株是优选的。这种细菌菌株是由本发明的发明人从温泉附近的土壤中分离的新细菌菌株，如下实施例所述，并且基于它的细菌学性质被鉴定为洋葱伯克霍尔德氏菌。按照惯例，伯克霍尔德氏菌属微生物能够产生葡萄糖脱氢酶还是未知的。这种细菌菌株被称为KS1菌株。这种菌株于2000年9月25日被保藏在International Patent Organism Depositary，NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology(Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，P.C.：305-8566)中，微生物保藏号为FERMBP-7306。
本发明的发明人获得一些除洋葱伯克霍尔德氏菌KS1菌株以外的洋葱伯克霍尔德氏菌菌株，它们被保藏在Institute for Fermentation(Osaka，IFO)或Japan Collection of Microorganisms(JCM)、theInstitute of Physical and Chemical Research中，并测量了它们的葡萄糖脱氢酶活性。结果确认了所有这些细菌菌株都有活性。
(2)本发明的葡萄糖脱氢酶
如果具有葡萄糖脱氢酶产生能力的伯克霍尔德氏菌属细菌、例如洋葱伯克霍尔德氏菌KS1菌株是在用于微生物普通培养的营养性培养基中培养的，优选含有葡萄糖或含葡萄糖物质的培养基，目的是增加酶产生能力，那么本发明的葡萄糖脱氢酶是在培养产物或所培养的细胞中产生和蓄积的。因此，它可以通过已知方法收集。生产该酶的方法将以洋葱伯克霍尔德氏菌KS1菌株为例加以具体解释。首先，在适合的营养性培养基中培养洋葱伯克霍尔德氏菌KS1菌株，例如含有适合的碳源、氮源、无机盐、葡萄糖或含有这些的物质等的培养基，以在培养产物或所培养的细胞中产生和蓄积该酶。
作为碳源，可以使用能够被同化的任何物质，例子包括例如D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖、淀粉、各种胨等。作为氮源，可以使用酵母提取物、麦芽提取物、各种胨、各种肉类提取物、玉米浆、氨基酸溶液和有机与无机含氮化合物，例如铵盐，或含有这些的物质。作为无机盐，可以使用各种磷酸盐和镁、钾、钠、钙等的盐。进而，根据需要，可以向培养基加入细菌生长或酶产生所需的各种无机与有机物质，例如硅酮油、芝麻油、消泡剂，例如各种表面活性剂，和维生素。
关于培养方法，尽管可以使用液体培养或固体培养，不过液体培养通常是优选的。
本发明的酶可以得自如上所述获得的培养基和/或培养物中的细胞。存在于细胞中的酶可以这样获得，使细胞破裂或溶解，得到细胞提取物。
培养产物或细胞提取物中的葡萄糖脱氢酶可以通过色谱技术的适当组合加以纯化，使用离子交换剂、凝胶过滤载体、疏水性载体等。
使用用于测量葡萄糖脱氢酶活性的已知方法的相同方法能测定酶活性。具体而言，活性例如可以用后面实施例所述方法测量。
本发明新颖的葡萄糖脱氢酶的物理化学性质如下：
(i)该酶具有催化葡萄糖脱氢反应的作用；
(ii)该酶由这样的亚单位组成，它们在还原条件下、在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示约60kDa的分子量和约43kDa的分子量；
(iii)该酶在使用TSK Gel G3000SW(Tosoh Corporation)的凝胶过滤色谱中显示约380kDa的分子量；和
(iv)该酶显示45℃左右的最佳反应温度(Tris-HCl缓冲液，pH8.0)。
在上述条件下，葡萄糖脱氢酶在45℃左右显示活性峰，还在75℃左右显示活性峰(参照图3(a))。已知没有GDH在上述两个温度区域显示活性峰。
分子量和最佳温度可以通过后面实施例所述方法加以测量。
上述本发明葡萄糖脱氢酶由两个独立的多肽组成，分子量约60kDa的α-亚单位和分子量约43kDa的β-亚单位(以下，这种葡萄糖脱氢酶也被称为“复聚体酶”)。本发明的发明人进一步详细研究了这两种亚单位。
发现β-亚单位是细胞色素C(如后面实施例所示)。仅含有α-亚单位的蛋白质表现下列物理化学性质：
(i)该蛋白质能够作为亚单位构成葡萄糖脱氢酶；
(ii)该蛋白质具有葡萄糖脱氢酶活性；
(iii)该蛋白质在还原条件下、在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示约60kDa的分子量；和
(iv)该蛋白质显示75℃左右的最佳反应温度(Tris-HCl缓冲液，pH8.0)。
最佳温度可以通过后面实施例所述方法加以测量。
由于这种蛋白质本身具有酶活性，该蛋白质也可以可选地被称为“肽酶”或“酶”，取决于所解释的内容。
作为本发明肽酶的具体实施方式，可以提到具有氨基酸序列SEQ IDNO：3的蛋白质。进而，这种肽酶可以是具有在SEQ ID NO：3的氨基酸序列中含有一个或多个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列的蛋白质，只要它具有GDH活性即可。尽管能够被SEQ ID NO：1的核苷酸序列编码的氨基酸序列是如SEQ ID NO：3所示的，不过N-末端的甲硫氨酸残基可以在翻译后被消去。
进而，作为本发明复聚体酶的具体实施方式，可以提到含有这样一种蛋白质的多聚体，其α-亚单位具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列。进而，上述复聚体酶可以是含有这样一种蛋白质的多聚体，其α-亚单位具有包括一个或多个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加的SEQ ID NO：3的氨基酸序列，只要它具有GDH活性。
本发明中，“一个或多个”表示1至10个，优选1至5个，特别优选1至3个。
除了上述α-亚单位和β-亚单位以外，本发明的发明人还证实γ-亚单位的存在。
在后面所述的实施例中，γ-亚单位是在纯化本发明酶的阶段被从培养物上清液或细胞提取物中被除去的，因此在纯化后的酶中没有证实有γ-亚单位。不过，如实施例所示，当γ-亚单位与α-亚单位被一起表达时，与仅有α-亚单位被表达的情况相比得到高的酶活性。这提示了γ-亚单位是以一定方式参与微生物细胞中α-亚单位产生的蛋白质。假定α-亚单位的比活性(每个蛋白质的酶活性)在两者情况下是相同的，酶活性越低，说明α-亚单位作为酶的量越小，因为酶活性反映酶的量。另一方面，所产生的α-亚单位可以被γ-亚单位以某种方式保护起来，或者尽管α-亚单位作为蛋白质是被完全表达的，它也不能具有用以表现酶活性的三维结构，因为不存在γ-亚单位，因而酶活性可能变得很低。在任一情况下，当γ-亚单位与α-亚单位被一起表达时，可以获得高的酶活性。
(3)本发明的DNA
本发明的DNA可以得自含有本发明DNA的微生物，例如洋葱伯克霍尔德氏菌。本发明的DNA是在完成本发明的过程中从洋葱伯克霍尔德氏菌的染色体DNA分离的。不过，由于它的核苷酸序列和被该核苷酸序列编码的氨基酸序列是由本发明所阐明的，也可以通过基于这些序列的化学合成得到DNA。进而，还可以使用基于上述序列制备的寡核苷酸作为探针或引物进行杂交或PCR，从洋葱伯克霍尔德氏菌等的染色体DNA得到本发明的DNA。
除了编码具有氨基酸序列SEQ ID NO：3的蛋白质的DNA以外，本发明的DNA还可以是编码具有这样一种氨基酸序列SEQ ID NO：3的蛋白质的DNA，在该氨基酸序列中含有一个或多个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加，并且具有GDH活性。
作为本发明的DNA，具体可以提到包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列中第764至2380个核苷酸的核苷酸序列的DNA。SEQ ID NO：1的核苷酸序列中第764至2380个核苷酸的核苷酸序列编码具有氨基酸序列SEQID NO：3的GDH的α-亚单位。
进而，本发明的DNA还可以是在严格条件下可与SEQ ID NO：1的核苷酸序列中第764至2380个核苷酸的核苷酸序列或者能从该序列制备的探针杂交的并且编码具有GDH活性的蛋白质的DNA。
据估计，SEQ ID NO：1的核苷酸序列中第258至761个核苷酸的核苷酸序列编码γ-亚单位。氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。考虑到由于γ-亚单位的结构基因包含在α-亚单位的上游区域中，因而γ-亚单位被首先表达，并且一旦α-亚单位被微生物产生即已作为蛋白质存在，因此α-亚单位能够在微生物中被高效率地产生。因此，本发明的DNA除了上述DNA以外，还可以包括编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的DNA。
编码基本上等同于具有氨基酸序列SEQ ID NO：3的上述蛋白质的蛋白质的DNA例如可以通过这样一种方法获得，例如定点诱变或诱变处理。被引入突变的DNA编码的蛋白质的GDH活性例如可以如下测量。
将酶样本和作为底物的葡萄糖加入到含有594μM甲硫酸甲吩嗪酯(mPMS)和5.94μM 2，6-二氯苯酚-靛酚(DCIP)的10mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中，培育在37℃下。利用分光光度计监测DCIP在600nm下的吸光度变化，测量吸光度减少率作为酶促反应速率。
进而，由SEQ ID NO：1的核苷酸序列中第2386个核苷酸和第2386个核苷酸之后的核苷酸序列组成的核苷酸序列据估计编码β-亚单位。进而，第2386至2451个核苷酸的核苷酸序列据估计编码β-亚单位的信号肽。所估计的这种信号肽的氨基酸序列是SEQ ID NO：4中第1至22个氨基酸的氨基酸序列。信号肽是在核糖体中合成的蛋白质被分泌穿过膜所必需的肽，已经发现包含15至30个疏水性氨基酸残基。因此，由于培养物上清液中蛋白质的量因信号肽的存在而增加，这是一种在生产蛋白质的方法中有效发挥作用的肽。
下面将解释用于获得本发明DNA的方法实例。
染色体DNA是从微生物分离的，例如洋葱伯克霍尔德氏菌，然后纯化，通过超声处理、限制性酶处理等裂解染色体DNA，利用DNA连接酶等与线性表达载体连接和环化，构建重组载体。将所得重组载体引入到宿主微生物中，其中载体是可自主复制的，使用载体标记和酶活性表达作为指标筛选转化体，得到隐匿重组载体的微生物，该载体含有编码GDH的基因。包含在所得微生物中的重组载体预期至少含有编码α-亚单位的核苷酸序列。进而，如果所克隆的片段具有足够的大小，非常可能还含有编码γ-亚单位的核苷酸序列。
然后，可以培养具有重组载体的微生物，可以从所培养的微生物细胞中分离重组载体，纯化，然后可以从表达载体中收集编码GDH的基因。例如，充当基因供体的染色体DNA例如具体是如下收集的。
例如，可以将上述基因供体微生物在搅拌下培养1至3天，可以从所得培养肉汤中离心收集细胞，然后溶解，制备含有GDH基因的溶胞产物。作为细胞溶解方法，使用溶解细菌的酶进行处理，例如溶菌酶，根据需要联合使用其他酶，例如蛋白酶，和表面活性剂，例如十二烷基硫酸钠(SDS)。进而，还可以联合采用物理细胞破碎方法，例如冷冻与融化或French压缩机处理。
可以按常规方式从上述所得溶胞产物中分离和纯化DNA，例如苯酚处理或蛋白酶处理、核糖核酸酶处理、醇沉淀等脱蛋白作用的适当组合。
从微生物分离和纯化的DNA例如可以被超声处理、限制酶处理等裂解。优选地，适宜使用II型限制酶，它作用于特定的核苷酸序列。所用限制酶可以生成与所消化的载体末端相匹配的末端，或者所消化的末端可以被任意限制酶平端化，再与载体连接。
作为用于克隆的载体，能够在宿主微生物中自主生长的噬菌体或为基因重组而构建的质粒是适合的。当使用大肠杆菌(Escherichia coli)作为宿主微生物时，噬菌体的实例例如包括λgt10、λgt11等。进而，当使用大肠杆菌作为宿主微生物时，质粒的实例例如包括pBR322、pUC18、pUC118、pUC19、pUC119、pTrc99A和pBluescript以及SuperCosI，后者是一种粘粒，等。
克隆后，将上述载体用限制酶消化可以得到载体片段，该限制酶用于消化微生物DNA，同上述编码GDH的基因供体。不过，没有必要使用与用于消化微生物DNA的限制酶完全相同的限制酶。用于连接微生物DNA片段与载体DNA片段的方法可以是已知的使用DNA连接酶的方法。例如，连接微生物DNA片段的粘着末端与载体片段的粘着末端，然后使用适合的DNA连接酶产生含有微生物DNA片段和载体DNA片段的重组载体。如果需要的话，在连接之后，还可以利用存在于微生物中的DNA连接酶向宿主微生物引入片段，产生重组载体。
用于克隆的宿主微生物是没有特别限制的，只要重组载体是稳定的，并且能够在宿主中自主生长，外来基因能够在宿主中被表达。一般可以使用大肠杆菌DH5α、XL-1 BlueMR等。
作为用于向宿主微生物引入重组载体的方法，例如当宿主微生物是大肠杆菌时，可以使用合适的细胞方法，利用钙处理、电穿孔等。
通过上述方法所得所克隆的片段是否编码GDH，可以按常规方式对片段的核苷酸序列进行译码加以确认。
从上述所得转化体中收集重组载体，可以得到本发明的DNA。
GDH可以这样产生，培养含有本发明DNA的转化体或含有该DNA的重组载体，产生GDH作为DNA的表达产物，从细胞或培养肉汤中收集之。关于这种制备，尽管本发明的DNA可以是编码α-亚单位的DNA，不过通过进一步与α-亚单位一起表达γ-亚单位可以提高表达效率。
在其中产生GDH的微生物实例包括肠细菌，例如大肠杆菌，革兰氏阴性菌，例如假单胞菌属和葡糖杆菌属的那些，革兰氏阳性菌，包括杆菌属细菌，例如枯草杆菌，酵母，例如酿酒酵母，和丝状真菌，例如黑曲霉。不过，微生物不限于这些微生物，任意适合于产生外来蛋白质的宿主微生物都可以使用。
包含在一经选择的含有GDH基因的重组载体中的GDH基因能够被容易地转移到可在微生物中复制的重组载体中，方法是使用限制酶或者通过PCR从含有GDH基因的重组载体中回收GDH基因的DNA，再将其与另一种载体片段连接。进而，微生物能够容易地用这些载体转化，例如，关于埃希氏杆菌属细菌，借助利用钙处理的合适的细胞方法，关于杆菌属细菌，借助原生质体法，关于酵母，借助KU或KUR法，关于丝状真菌，借助显微操作法等等。进而，还可以普遍使用电穿孔。
向其中引入靶重组载体的宿主微生物可以这样选择，寻找同时表达含有靶DNA和GDH活性的耐药性载体标志的微生物。例如，可以选择这样一种微生物，它生长在基于耐药性标志的选择性培养基中，并且产生GDH。
关于转化体的培养方法，可以考虑宿主的营养与生理性质，选择培养条件。在很多情况下，进行液体培养。工业上有利的是在搅拌下进行需氧培养。
作为培养基的养分，可以普遍使用常用于微生物培养的那些。作为碳源，可以使用能够被同化的任意含碳化合物，其实例包括葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、乳糖、糖蜜、丙酮酸等。进而，作为氮源，可以使用能够被采用的任何含氮化合物，其实例包括胨、肉类提取物、酵母提取物、酪蛋白水解产物、大豆粉碱性提取物等。另外，根据需要使用磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、镁、钙、钾、铁、锰、锌等的盐、特定的氨基酸、特定的维生素等。
尽管培养温度可以在细菌生长和产生GDH的范围内适当变化，不过优选约20℃至42℃。培养时间多少因条件而异。不过，可以在估计产生最大GDH水平的适当时候完成培养，培养时间通常约12至72小时。尽管培养基的pH可以在细菌生长和产生GDH的范围内适当变化，不过优选地在约pH6.0至9.0的范围内。
含有在培养物中产生GDH的细胞的培养肉汤可以照原样收集和使用。不过，当在培养肉汤中存在GDH时，通常按常规方式通过过滤、离心等将培养肉汤分离为含有GDH的溶液和微生物细胞，再使用。当在细胞中存在GDH时，借助过滤、离心等从所得培养物中收集细胞，然后通过机械方法或酶学方法、例如使用溶菌酶使细胞破裂，根据需要进一步加入螯合剂、例如EDTA和表面活性剂，以增溶GDH，分离和收集GDH的水溶液。
GDH可以这样从上述所得含有GDH的溶液中沉淀出来，例如真空浓缩、膜浓缩、硫酸铵、硫酸钠等盐析、或者用亲水性有机溶剂分步沉淀，例如甲醇、乙醇和丙酮。进而，热处理和等电点处理也是有效的纯化手段。然后，可以通过适当的组合方法纯化GDH，例如使用吸附剂或凝胶过滤剂的凝胶过滤、吸收色谱、离子交换层析和亲和层析，得到所纯化的GDH。
通过基于柱层析的分离和纯化可以得到所纯化的酶制备物。尽管所纯化的酶制备物优选地被纯化至应当在电泳(SDS-PAGE)中得到单一谱带的程度，不过它可以含有γ-亚单位。
上述所得所纯化的酶例如可以通过冷冻干燥、真空干燥、喷雾干燥等制成粉末，然后进行分配。
进而，按照与后面实施例所述α-亚单位氨基酸序列的测定相同的方式，还可以测定β-亚单位的氨基酸序列，基于该序列可以分离编码β-亚单位的DNA。进而，还可以利用所得DNA产生β-亚单位。进而，还可以利用编码α-亚单位的DNA和编码β-亚单位的DNA产生复聚体酶。
(4)本发明的葡萄糖传感器
本发明的葡萄糖传感器是以使用本发明的酶(上述复聚体酶或肽酶或者上述含有γ-亚单位的复聚体酶或肽酶)、本发明的转化体或本发明的微生物(洋葱伯克霍尔德氏菌KS1菌株)作为酶电极为特征的。作为电极，可以使用碳电极、金电极、铂电极等，将本发明的酶固定在该电极上。固定方法的实例包括使用交联剂的方法、在聚合物基质中截留酶的方法、用透析膜覆盖酶的方法、使用光致交联聚合物、导电聚合物、氧化还原聚合物等的方法。作为替代选择，可以将酶与电子介质一起固定在聚合物中或者通过吸附作用固定在电极上，电子介质的典型例子是二茂铁及其衍生物，或者可以联合采用这些方法。通常，使用戊二醛将本发明的葡萄糖脱氢酶固定在碳电极上，通过具有胺基的试剂处理封闭戊二醛。
葡萄糖浓度可以测量如下。将缓冲液置于恒温池中，加入介质，保持恒温。作为介质，可以使用铁氰化钾、甲硫酸吩嗪酯等。其上固定本发明酶的电极用作工作电极，还使用计数电极(例如铂电极)和参照电极(例如Ag/AgC电极)。向碳电极施加恒定电压，得到稳态电流后，加入含有葡萄糖的样本，测量电流的增加。根据利用具有标准浓度的葡萄糖溶液生成的校准曲线，可以计算样本中的葡萄糖浓度。
(5)本发明的葡萄糖测定试剂盒
本发明的糖测定试剂盒是以包括本发明的酶(上述复聚体酶或肽酶或者上述含有γ-亚单位的复聚体酶或肽酶)为特征的。本发明的葡萄糖测定试剂盒包括本发明的酶，含量足以进行至少一次测定。通常，除了本发明的酶以外，试剂盒还包括缓冲液、介质、用于生成校准曲线的葡萄糖标准溶液等，这些是测定所必需的，和使用指导。可以以各种形式提供本发明的酶，例如冻干试剂或适当的贮存溶液。
附图的简要说明
图1显示通过天然PAGE电泳测定的本发明酶的分子量。
图2显示电泳图，显示基于SDS-PAGE电泳的本发明酶的分子量。
图3显示本发明酶的最佳反应温度(a)和热稳定性(b)。
图4显示仅构成本发明酶的α-亚单位的肽酶的最佳反应温度(a)和热稳定性(b)。
图5显示在热处理前、在有或没有葡萄糖的存在下本发明酶的分光光度分析结果(a)和在热处理后、在有或没有葡萄糖的存在下本发明酶的分光光度分析结果(b)。
图6显示在各种温度下使用得自转化体的GDH的葡萄糖传感器对葡萄糖的响应。
实施本发明的最佳方式
下面参照下列实施例更具体地解释本发明。
实施例1：具有葡萄糖脱氢酶产生能力的细菌的获得
[筛选]
本发明的微生物是这样得到的，收集日本各种温泉附近的土壤，利用葡萄糖作为养分从土壤中选择细菌中具有葡萄糖脱氢酶活性的细菌。
该菌株的形态学特征、生长特征和生理学特征研究结果显示如下。
[细菌学特征]
革兰氏染色 阴性
细胞形态 棒状
极性鞭毛移动性 阳性
片段数量 ＞5
最佳生长温度 45℃
氧化酶 阴性
过氧化氢酶 阳性
乙偶姻的产生 阴性
H2S的产生 阴性
吲哚的产生 阴性
来自葡萄糖的酸 阳性
精氨酸二水解酶 阴性
脲酶 阴性
β-葡糖苷酶 阴性
蛋白酶 阴性
β-半乳糖苷酶 阳性
赖氨酸羧酶 阴性
鸟氨酸羧酶 阴性
硝酸盐的还原 阳性
[同化特征]
甘油 阳性
赤藓醇 阴性
D-阿拉伯糖 阴性
L-阿拉伯糖 阳性
核糖 阳性
D-木糖 阳性
L-木糖 阴性
侧金盏糖醇 阳性
β-甲基木糖苷 阴性
半乳糖 阳性
D-葡萄糖 阳性
D-果糖 阳性
D-甘露糖 阳性
L-山梨糖 阴性
鼠李糖 阴性
卫矛醇 阳性
肌醇 阳性
甘露糖醇 阳性
山梨糖醇 阳性
α-甲基-D-甘露糖苷 阴性
α-甲基-D-葡糖苷 阴性
N-乙酰基葡糖胺 阳性
扁桃苷 阴性
熊果苷 阴性
七叶苷 阴性
水杨苷 阴性
纤维二糖 阴性
麦芽糖 阴性
乳糖 阴性
蜜二糖 阴性
蔗糖 阴性
海藻糖 阳性
菊粉 阴性
松三糖 阴性
D-棉子糖 阴性
美沙酮 阴性
糖原 阴性
木糖醇 阳性
β-龙胆二糖 阴性
D-松二糖 阴性
D-来苏糖 阴性
D-塔格糖 阴性
D-岩藻糖 阴性
L-岩藻糖 阴性
D-阿糖醇 阳性
L-阿糖醇 阳性
葡糖酸 阳性
2-酮基葡糖酸 阳性
5-酮基葡糖酸 阴性
癸酸 阳性
己二酸 阳性
苹果酸 阳性
柠檬酸 阳性
乙酸苯基酯 阳性
[氧化特征]
甘油 阴性
赤藓醇 阴性
D-阿拉伯糖 阴性
L-阿拉伯糖 阳性
核糖 阳性
D-木糖 阳性
L-木糖 阴性
侧金盏糖醇 阳性
β-甲基木糖苷 阴性
半乳糖 阳性
D-葡萄糖 阳性
D-果糖 阳性
D-甘露糖 阳性
L-山梨糖 阴性
鼠李糖 阴性
卫矛醇 阳性
肌醇 阳性
甘露糖醇 阳性
山梨糖醇 阳性
α-甲基-D-甘露糖苷 阴性
α-甲基-D-葡糖苷 阴性
N-乙酰基葡糖胺 阴性
扁桃苷 阴性
熊果苷 阴性
七叶苷 阳性
水杨苷 阴性
纤维二糖 阳性
麦芽糖 阳性
乳糖 阳性
蜜二糖 阴性
蔗糖 阴性
海藻糖 阳性
菊粉 阴性
松三糖 阴性
D-棉子糖 阴性
美沙酮 阴性
糖原 阴性
木糖醇 阴性
β-龙胆二糖 阳性
D-松二糖 阴性
D-来苏糖 阴性
D-塔格糖 阴性
D-岩藻糖 阳性
L-岩藻糖 阴性
D-阿糖醇 阳性
L-阿糖醇 阳性
葡糖酸 阴性
2-酮基葡糖酸 阴性
5-酮基葡糖酸 阴性
参照Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology研究了具有上述细菌学特征的KS1菌株的分类学位置，确定该菌株属于伯克霍尔德氏菌属，是洋葱伯克霍尔德氏菌的细菌菌株。
伯克霍尔德氏菌属按照惯例归入假单胞菌属，但是目前独立分成伯克霍尔德氏菌属(Yabuuchi，E.，Kosako，Y.，Oyaizu，H.，Yano，I.，Hotta，H.，Hashimoto，Y.，Ezaki，T.，Arakawa，M.，Microbiol.Immunol.Vol.36(12)：1251-1275(1992)；International Journalof Systematic Bacteriology，Apr.，1993，pp.398-399)。
进而，本发明的发明人得到了除洋葱伯克霍尔德氏菌KS1菌株以外的若干洋葱伯克霍尔德氏菌菌株，它们被保藏在Institute forFermentation，Osaka或Japan Collection for Fermentation(JCM)，Institute of Physical and Chemical Research中，测量了这些菌株的葡萄糖脱氢酶活性，确认它们具有该活性。葡萄糖脱氢酶活性是通过后面实施例2所述方法测量的。这些菌株基于KS1菌株水溶性部分的酶活性——取作100——的相对活性如表1所示。
表1
 细菌菌株 葡萄糖脱氢酶活性
70℃  45℃
 KS1 水溶性部分 100  100
 JCM5506 水溶性部分 100  100
膜部分 100  100
 JCM5507 水溶性部分 100  100
膜部分 100  100
 JCM2800 水溶性部分 100  100
 JCM2801 水溶性部分 100  100
 IFO15124 水溶性部分 100  100
 IFO14595 水溶性部分 100  100
实施例2：葡萄糖脱氢酶的提取
(1)细胞的培养
作为细菌的培养条件，使用普通的需氧培养条件。在7L培养基中，将细胞在34℃下培养8小时，每升培养基含有下列成分。
聚胨 10g
酵母提取物 1g
NaCl 5g
KH2PO4 2g
葡萄糖 5g
Einol(ABLE Co.，Tokyo，Japan) 0.14g
总体积，包括蒸馏水 1L
调节pH 7.2
将体积为7L的培养肉汤在9,000xg和4℃下离心10分钟，得到约60g细胞。
(2)粗略纯化部分的制备
将60g细胞分散在10mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)中，利用French压缩机(Otake Corporation，Tokyo，Japan)向细胞施加1,500Kg/cm2压力差，使细胞膜破裂。将细胞提取物在8000xg下离心10分钟，除去细胞固体。进而，将上清液在69,800xg和4℃下超离心90分钟，得到约8g膜部分的沉淀物。
(3)酶的纯化
将膜部分重分散在含有1％ Triton X-100作为最终浓度的10mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)中。然后，将分散系在4℃下缓慢搅拌过夜。将分散系超离心(69,800xg，4℃，90分钟)后，将增溶的膜部分再次在4℃和15,000xg下离心15分钟，得到上清液。
向溶解的膜部分加入含有0.2％ Triton X-100的等体积10mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)。将溶液透析，然后上DEAE-TOYOPEARL柱(22mm ID×20cm，Tosoh Corporation，Tokyo，Japan)，柱子用含有0.2％ TritonX-100的10mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)均等化。用含0至0.15M NaCl的10mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)的线性梯度洗脱蛋白质。流速为5ml/min。在约75mM的NaCl浓度下洗脱GDH。收集表现GDH活性的部分，对含有0.2％ Triton X-100的10mM磷酸钾缓冲液(pH8.0，4℃)透析过夜。
进而，将透析后的酶溶液上DEAE-5PW柱(8.0mm ID×7.5cm，TosohCorporation，Tokyo，Japan)。该柱子预先用含有0.2％ Triton X-100的10mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)平衡过。用含0至100mM NaCl的10mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)的线性梯度洗脱蛋白质。流速为1ml/min。在约20mM的NaCl浓度下洗脱表现GDH活性的部分。收集具有GDH活性的部分，用含有0.2％ Triton X-100的10mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)脱盐过夜，得到纯化的酶。
按照本实施例和下列实施例中的下列方法测量GDH活性。
作为电子受体，使用2，6-二氯苯酚-靛酚(DCIP)和甲硫酸吩嗪酯(PMS)。在预定的温度下，在聚乙烯试管内进行反应。将体积为5μl的酶溶液加入到含有0.75mM PMS和0.75mM DCIP的20μl 25mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中。将该混合物预先在恒温下放置1分钟。加入1μl 2M葡萄糖(最终浓度：77mM)引发反应，在恒温下放置2分钟。随后，加入100μl冰冷的蒸馏水或120μl 7.5M脲，冷却样本。利用超微测量池(100μl)和能够利用该池测量的分光光度计(UV160，ShimadzuCorporation，Kyoto，Japan)监测由葡萄糖脱氢所致电子受体的还原反应。也就是说，在600nm下测量由DCIP还原所致颜色随时间消失，600nm是DCIP的吸收波长。使用DCIP的摩尔吸光系数(22.23mM×cm-1)。酶的一个单位(U)被定义为在标准试验条件下每分钟氧化1μM葡萄糖的量。利用Lowry法测量蛋白质浓度。
实施例3
对纯化的酶进行天然PAGE电泳。使用含有1％ Triton X-100的Tris-丙氨酸缓冲系统，在8至25％聚丙烯酰胺梯度凝胶上进行电泳。将凝胶用硝酸银染色。作为蛋白质标志，使用甲状腺球蛋白(669kDa)、铁蛋白(440kDa)、过氧化氢酶(232kDa)、醛缩酶(158kDa)、牛血清白蛋白(67kDa)、卵白蛋白(43kDa)和胰凝乳蛋白酶原A(25kDa)。
进而，对天然PAGE凝胶进行活性染色，方法是将凝胶在下列溶液中培育30分钟。在GDH活性位点，氮蓝四唑被还原，生成甲，导致深紫色的形成。
200mM 葡萄糖
0.1mM 氮蓝四唑
0.3mM 甲硫酸吩嗪酯
20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)
根据天然PAGE的银染色结果，估计该酶由单一种类的酶组成，并且具有约400kDa的分子量。进而，当对凝胶染色检测活性时，在与银染色相同的移动性位点观察到了活性(见图1。图中，第1栏显示具有标准分子量的标志蛋白的银染色结果，第2栏显示酶的银染色，第4栏显示酶活性染色)。当将酶在70℃下加热30分钟后，活性被意外地保留了，将酶分离为几种蛋白质，其中一种具有活性，显示约85kDa的分子量(见图1。图中，第3栏显示在70℃下加热30分钟的酶的银染色结果，第5栏显示在70℃下加热30分钟的酶的活性染色)。这些结果提示酶由亚单位组成。
实施例4
对纯化的酶溶液进行SDS-PAGE。使用Tris-麦黄酮缓冲液，在8至25％梯度聚丙烯酰胺凝胶中进行SDS-PAGE。将凝胶中的蛋白质用硝酸银染色。利用Phast System(Pharmacia)，自动进行分离和展开。基于相对于标准蛋白质的移行测定分子量。通过SDS-PAGE将酶分离为具有约60kDa和43kDa的分子量的蛋白质(见图2。图2是电泳图。图中，第1栏显示具有标准分子量的标志蛋白的硝酸银染色结果，第2栏显示酶的硝酸银染色结果)。从而提示了在酶中结合有60kDa的α-亚单位和43kDa的β-亚单位，预期通过四对这些亚单位各自彼此键合形成八聚物。
将β-亚单位——通过SDS-PAGE分离的43kDa蛋白质——转移到聚偏二氟乙烯膜上，然后利用氨基酸序列分析仪(PPSQ-10，ShimadzuCorporation)测定β-亚单位N-末端的氨基酸序列。结果发现，该蛋白质N-末端的氨基酸序列由SEQ ID NO：5的氨基酸序列的16个残基组成。
进而，对酶进行70℃热处理30分钟所得结果如图2第3栏所示。基于这种SDS-PAGE结果，可以估计该酶在热处理之后变为分子量60kDa的单一多肽。
实施例5
对酶进行凝胶过滤色谱。作为凝胶，使用TSK Gel G3000SW(TosohCorporation)，将凝胶柱(8.0mm ID×30cm Tosoh Corporation，Tokyo，Japan)用含有0.3M NaCl与0.1％ Triton X-100的10mM磷酸钾缓冲溶液(pH6.0)平衡。收集各级分(125μl)。使用七种蛋白质标志测定纯化酶的分子量。作为蛋白质标志，使用甲状腺球蛋白(669kDa)、铁蛋白(440kDa)、过氧化氢酶(232kDa)、醛缩酶(158kDa)、牛血清白蛋白(67kDa)、卵白蛋白(43kDa)和胰凝乳蛋白酶原A(25kDa)。
证实该酶的分子量约为380kDa。
实施例6
检查纯化的酶的最佳温度。
将酶预先在Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中、在预定温度下培育1分钟，然后开始反应。在预定的反应温度下测量活性。在45℃左右观察到最佳温度(见图3(a))。进而，在75℃左右也观察到峰值，不过活性低于45℃左右的活性。
进而，为了检查酶的热稳定性，将酶保持在每种恒温下达30分钟，在45℃下测量残留的酶活性(见图3(b))。
实施例7
检查肽酶的最佳温度和热稳定性，该肽酶构成在70℃下加热30分钟所得分子量60kDa的单一寡肽。
这种肽酶显示比未加热的酶更高的最佳温度以及热稳定性。没有关于具有这种温度依赖性的酶的报道。
将酶预先在Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中、在预定温度下培育1分钟，然后开始反应。在预定的反应温度下测量活性。在75℃左右观察到最佳温度(见图4(a))。
进而，为了检查酶的热稳定性，将酶保持在每种恒温下达30分钟，在70℃下测量残留的酶活性(见图4(b))。
实施例8
为了研究每种亚单位的作用，在热处理之前和之后对GDH进行分光光度分析。图5(a)和(b)显示在热处理之前和之后被氧化和还原的GDH的吸光度(在葡萄糖的存在下)。热处理之前氧化GDH——原始GDH——的吸收波长在409nm下显示特征峰。进而，在葡萄糖的存在下峰迁移至417nm，在523nm和550nm下观察到另外两个峰(图5(a))。相形之下，热处理之后GDH不再在409nm下显示特征峰(图5(b))，在被氧化与还原的GDH之间观察到没有显著性差异。
热处理之前氧化GDH——原始GDH——的吸收波长类似于葡糖杆菌(Gluconobacter sp.)或醋酸杆菌(Acetobacter sp.)的包含脱氢酶细胞色素复合体的醇脱氢酶或醛脱氢酶的吸收波长(参照下列文献：Adachi，O.，Tayama，K.，Shinagawa，E.，Matsushita，K.和Ameyama，M.，Agr.Biol.Chem.，42，2045-2056(1978)；Adachi，O.，Miyagawa，E.，Matsushita，K.和Ameyama，M.，Agr.Biol.Chem.，42，2331-2340(1978)；Ameyama，M.和Adachi，O.，Methods Enzymol.，89，450-457(1982)；Adachi，O.，Tayama，K.，Shinagawa，E.，Matsushita，K.和Ameyama，M.，Agr.Biol.Chem.，44，503-515(1980)；Ameyama，M.和Adachi，O.，Methods Enzymol.，89，491-497(1982))。
结果提示了这样一种可能性，GDH的寡聚复合体含有细胞色素。因此，可以考虑所观察到的类似于细胞色素C的波长可归因于β-亚单位，在热处理期间丧失，因而β-亚单位由细胞色素C组成。
实施例9
切取通过实施例4电泳得到的含有β-亚单位的谱带，利用肽序列分析仪(PPSQ-10，Shimadzu Corporation)分析氨基酸序列。作为结果，可以得到由SEQ ID NO：5所示16个残基组成的N-末端氨基酸序列。
尝试通过基于肽序列的PCR扩增编码上述16个残基的N-末端氨基酸序列的基因区域。也就是说，设计两种PCR引物，在前侧具有相当于16个残基肽链N-末端5个残基的核苷酸序列(SEQ ID NO：6)，在对侧具有相当于C-末端5个残基反义链的核苷酸序列(SEQ ID NO：7)。当利用这对PCR引物对KS1菌株基因组按常规方式进行PCR时，扩增了约50个bp的基因片段。当按常规方式测定该基因片段的核苷酸序列时，含有这对PCR引物的58个核苷酸的核苷酸序列被译码了。在这些核苷酸中，分析了除PCR引物以外的18个核苷酸，发现了相当于从Pro到Arg的区域的基因序列，Pro是上述β-亚单位N-末端16个残基从N-末端开始第6个残基，Arg是第11个残基(SEQ ID NO：8)。因而，发现所扩增的基因片段包括β-亚单位的基因片段。
进而，还发现β-亚单位存在于α-亚单位后22个氨基酸残基之后。这是基于这样一种发现，由于在实施例4中测定的纯化β-亚单位N-末端氨基酸序列匹配从SEQ ID NO：1中第2452至2466个核苷酸的核苷酸序列翻译的5个氨基酸残基，因此这些序列是等同的。
此外，推断SEQ ID NO：1中第2386至2451个核苷酸的核苷酸序列是β-亚单位的信号肽。被这种核苷酸序列编码的氨基酸序列相当于SEQ ID NO：4的氨基酸序列中第1至22个氨基酸。
实施例10
在含有0.1％ Triton X-100和1mM CaCl2的50mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)中加入和混合纯化酶和商业上可得到的NAD辅酶GDH(缩写为“NAD-GDH”)，浓度各为100U/L。将每种溶液置于60℃加热罐内，测量残留的活性。
表2：残留的相对活性(％)
 时间(min)  NAD-GDH  GDH酶
 0  100  100
 15  20  100
 30  5  100
证实与目前商业上可得到的GDH酶相比，该酶具有惊人的热稳定性。发现该酶是一种新颖的酶，完全不同于商业上可得到的NAD-GDH。
实施例10：编码GDHα-亚单位的基因的分离
(1)来自洋葱伯克霍尔德氏菌KS1菌株的染色体DNA的制备
按常规方式从洋葱伯克霍尔德氏菌KS1菌株制备染色体基因。也就是说，使用TL液体培养基(10g聚胨，1g酵母提取物，5g NaCl，2g KH2SO4，5g葡萄糖，1L，pH7.2)，将细菌菌株在34℃下摇动过夜。利用离心机收集生长后的细胞。将细胞悬浮在含有10mM NaCl、20mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、0.5％SDS和100μg/ml蛋白酶K的溶液中，在50℃下处理6小时。向该混合物加入等体积的苯酚-氯仿，在室温下搅拌10分钟，然后利用离心机收集上清液。向上清液加入乙酸钠至最终浓度为0.3M，再加入两倍体积的乙醇，使染色体DNA沉淀在中间层中。将DNA用玻璃棒取出，用70％乙醇洗涤，溶于适量TE缓冲液，得到染色体DNA溶液。
(2)GDHα-亚单位N-末端氨基酸序列的测定
通过冷冻干燥浓缩按与实施例2相同的方式纯化的GDH，使用12.5％聚丙烯酰胺通过SDS-电泳展开，分离α-亚单位。将所得α-亚单位转移到聚偏二氟乙烯膜上，然后利用氨基酸序列分析仪(PPSQ-10，ShimadzuCorporation)测定N-末端氨基酸序列。结果发现，该酶包括由SEQ ID NO：3的氨基酸序列第2至12个氨基酸的11个残基组成的肽序列。
(3)编码α-亚单位的基因的克隆
将(1)中制备的1μg DNA用限制酶Sau3AI进行有限消化，用牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)处理。另将SuperCosI(从STRATAGENE获得)——它是一种粘粒——用BamHI处理，使用T4 DNA连接酶将用Sau3AI有限消化得自α-15菌株的染色体DNA片段所得DNA片段结合到SuperCosI中。将大肠杆菌XL-1 Blue MR(从STRATAGENE获得)用所得重组DNA转化。在含有10μg/ml新霉素和25μg/ml氨苄西林的LB琼脂培养基上基于新霉素耐药性和氨苄西林耐药性选择转化体，这些是SuperCosI的抗生素耐药性。在LB液体培养基中培养所得转化体。收集这些转化体细胞，悬浮在用于测量GDH活性的试剂中，利用葡萄糖脱氢酶活性作为指数选择克隆体。结果得到一种显示葡萄糖脱氢酶活性的克隆菌株。
(4)亚克隆
从含有(3)所得编码α-亚单位的基因的粘粒SuperCosI制备含有靶基因的DNA片段。使用限制酶NotI从粘粒中切除所插入的基因片段。将这些DNA片段用限制酶XbaI处理，结合到用XbaI消化的质粒pUC18中。将大肠杆菌DH5αMCR菌株用含有每种插入片段的质粒pUC18转化，生长在含有50μg/ml氨苄西林的LB琼脂培养基上，收集菌落。将所得转化体培养在液体LB培养基中，按与(3)相同的方式检查细胞中的GDH活性。结果从一种转化体中得到显示GDH活性的菌株。从这种转化体中提取质粒，分析所插入的DNA片段。结果证实插入片段约为8.8kbp。这种质粒被称为pKS1。
(5)核苷酸序列的测定
按照限制酶分析法和常规方法测定pKS1中所插入的DNA片段的核苷酸序列。结果在这种所插入的DNA片段中证实了编码在(2)中发现的α-亚单位N-末端氨基酸序列的DNA序列，并且发现含有该序列的可读框。所测定的核苷酸序列和能够被这种核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：1和3所示。从该氨基酸序列所得蛋白质的分子量为59,831Da，基本上匹配洋葱伯克霍尔德氏菌KS1菌株α-亚单位的SDS-PAGE所得60kDa的分子量。
既然测定了α-亚单位的核苷酸序列，利用上述α-亚单位的结构基因生成一种载体，进一步利用这种载体生成转化体。
首先，如下制备有待插入载体中的基因。
使用得自KS1菌株的基因组片段作为模板，通过PCR进行扩增，以便应当包括所需的限制酶位点。在PCR中使用下列寡核苷酸引物对。
(正向)
5’-CCCAAGCTTGGGCCGATACCGATACGCA-3’(SEQ ID NO：9)
(反向)
5’-GAGAAGCTTTCCGCACGGTCAGACTTCC-3’(SEQ ID NO：10)
将用PCR扩增的基因用限制酶HindIII消化，插入到表达载体pFLAG-CTS(SIGMA)的克隆位点，即HindIII位点。所得质粒被称为pFLAG-CTS/α。
将大肠杆菌DH5αMCR菌株用上述质粒pFLAG-CTS/α转化，生长在含有50μg/ml氨苄西林的LB琼脂培养基中，收集菌落。
进而，当在α-亚单位的上游搜索pKS1插入片段的可读框时，新发现了507个核苷酸的结构基因，它编码包含168个氨基酸残基的多肽，如SEQ ID NO：2所示(SEQ ID NO：1中第258至761个核苷酸)。这种结构基因被认为编码γ-亚单位。
既然发现编码γ-亚单位的区域位于α-亚单位编码区的上游，生成了含有具有多顺反子结构的基因的重组载体，连续包括γ-亚单位和α-亚单位，构建引入这种载体的转化体。
首先，如下制备有待插入到载体中的基因。
使用连续包括γ-亚单位结构基因和α-亚单位结构基因的KS1菌株基因组片段作为模板，通过PCR进行扩增，以便应当包括所需的限制酶位点。使用下列寡核苷酸引物对进行PCR。
(正向)
5’-CATGCCATGGCACACAACGACAACACT-3’(SEQ ID NO：11)
(反向)
5’-CCCAAGCTTGGGTCAGACTTCCTTCTTCAGC-3’(SEQ ID NO：12)
将通过PCR扩增的基因的5’末端和3’末端分别用NcoI和HindIII消化，将该基因插入到载体pTrc99A(Pharmacia)的克隆位点，即NcoI/HindIII位点。所得质粒被称为pTrc99A/γ+α。
将大肠杆菌DH5αMCR菌株用上述质粒pTrc99A/γ+α转化，生长在含有50μg/ml氨苄西林的LB琼脂培养基上，收集菌落。
实施例11：重组大肠杆菌产生GDHα-亚单位
使用用上述每种质粒pKS1、pFLAG-CTS/α和pTrc99A/γ+α转化的大肠杆菌DH5αMCR菌株产生α-亚单位。将每种转化体接种到含有50μg/ml氨苄西林的3ml LB培养基中，在37℃下培养12小时，利用离心机收集细胞。利用French压缩机(1500kgf)使细胞破裂，通过超离心(160,400xg，4℃，90min)分离膜部分(10mM磷酸钾缓冲液，pH6.0)。
实施例12：葡萄糖的测定
首先，证实每种上述膜部分中的GDH活性。具体而言，使用含有594μM甲硫酸甲吩嗪酯(mPMS)和5.94μM 2，6-二氯苯酚-靛酚(DCIP)的10mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)进行视觉测定。结果如下所示。+的数量代表颜色从蓝色变为无色的程度。
培养后的用pFLAG-CTS/α转化的转化体膜部分：     +
培养后的用pKS1转化的转化体膜部分：             ++
培养后的用pTrc99A/γ+α转化的转化体膜部分：    +++
仅结合有α-亚单位的、培养后的用pFLAG-CTS/α转化的转化体膜部分的GDH活性最低，培养后的用pTrc99A/γ+α转化的转化体膜部分——用以高效构建载体——的GDH活性最高。
尽管α-亚单位在用仅有α-亚单位结构基因的载体转化的转化体中即被表达，不过使用联合含有γ-亚单位结构基因和α-亚单位结构基因的载体能够高效得到α-亚单位。
使用本发明的葡萄糖脱氢酶测定葡萄糖。使用各种浓度的葡萄糖测量本发明的葡萄糖脱氢酶(α-亚单位)的酶活性。在含有594μM甲硫酸甲吩嗪酯(mPMS)和5.94μM 2，6-二氯苯酚-靛酚(DCIP)的10mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中测量GDH活性。加入酶样本和作为底物的葡萄糖，培育在37℃下，利用分光光度计监测DCIP在600nm下的吸光度变化。测量吸光度减少率作为酶反应速率。使用本发明的GDH，能够在0.01至1.0mM的范围内量化葡萄糖。
实施例13：葡萄糖传感器的制备和评价
向实施例2所得本发明的葡萄糖脱氢酶(25单位)加入20mg碳糊，冷冻干燥。将它们充分混合，仅涂在已填充约40mg碳糊的碳糊电极表面上，在滤纸上抛光。在室温下将该电极在含有1％戊二醛的10mM MOPS缓冲液(pH7.0)中处理30分钟，然后在室温下在含有20mM赖氨酸的10mMMOPS缓冲液(pH7.0)中处理20分钟，以封闭戊二醛。在室温下将该电极在10mM MOPS缓冲液(pH7.0)中平衡1小时或更长时间。将电极贮存在4℃下。
使用上述电极作为工作电极，Ag/AgCl电极作为参照电极，Pt电极作为对电极，在加入葡萄糖后测量响应电流值。使用含有1mM甲氧基-PMS的10mM磷酸钾缓冲液作为反应溶液，在测量时施加100mV的电压。
利用所制备的酶传感器测量葡萄糖浓度。利用其上固定有本发明的葡萄糖脱氢酶的酶传感器能够在0.05至5.0mM的范围内量化葡萄糖(图6)。
实施例14：利用从转化体所得GDH制备和评价葡萄糖传感器
向实施例12所得10U本发明α-亚单位(249U/mg蛋白质)加入50mg碳糊，冷冻干燥。将它们充分混合，仅涂在已填充约40mg碳糊的碳糊电极表面上，在滤纸上抛光。在室温下将该电极在含有1％戊二醛的10mMMOPS缓冲液(pH7.0)中处理30分钟，然后在室温下在含有20mM赖氨酸的10mM MOPS缓冲液(pH7.0)中处理20分钟，以封闭戊二醛。在室温下将该电极在10mM MOPS缓冲液(pH7.0)中平衡1小时或更长时间。将电极贮存在4℃下。
使用上述电极作为工作电极，Ag/AgCl电极作为参照电极，Pt电极作为对电极，在加入葡萄糖后测量响应电流值。使用含有1mM甲氧基-PMS的10mM磷酸钾缓冲液作为反应溶液，在25℃和40℃下对各种浓度的葡萄糖水溶液进行测量，并施加100mV的电压。
在利用所制备的酶传感器测量葡萄糖浓度时，证实得到响应于每种浓度的电流。
工业实用性
按照本发明，具有高底物特异性的酶可以在低成本下生产，并且不受溶解在测量样本中的氧的影响，具体为具有优异热稳定性的新颖的葡萄糖脱氢酶，因此能够提供用于生产该酶的方法。进而，得到产生该酶的新颖的洋葱伯克霍尔德氏菌菌株。使用含有该酶或细菌菌株的酶电极还能够提供有效测量葡萄糖的葡萄糖传感器。
进而，由于本发明发现了葡萄糖脱氢酶基因、使该基因高效表达成为肽和编码这种肽的DNA，利用基于该基因的重组DNA技术能够生产大量的GDH。
                            序列表<110> SODE，Koji<120> 新颖的葡萄糖脱氢酶和生产该脱氢酶的方法<130> KO1262<141> 2001-10-31<150> JP 2000-332085<151> 2000-10-31<150> JP 2000-357102<151> 2000-11-24<150> JP 2001-276832<151> 2001-09-12<160> 12<170> PatentIn Ver.2.0<210> 1<211> 2467<212> DNA<213> 洋葱伯克霍尔德氏菌<220><221> CDS<222> (258)..(761)<220><221> CDS<222> (764)..(2380)<220><221> CDS<222> (2386)..(2466)<400> 1aagctttctg tttgattgca cgcgattcta accgagcgtc tgtgaggcgg aacgcgacat 60gcttcgtgtc gcacacgtgt cgcgccgacg acacaaaaat gcagcgaaat ggctgatcgt 120tacgaatggc tgacacattg aatggactat aaaaccattg tccgttccgg aatgtgcgcg 180tacatttcag gtccgcgccg atttttgaga aatatcaagc gtggttttcc cgaatccggt 240gttcgagaga aggaaac atg cac aac gac aac act ccc cac tcg cgt cgc    290
               Met His Asn Asp Asn Thr Pro His Ser Arg Arg
                 1               5                  10cac ggc gac gca gcc gca tca ggc atc acg cgg cgt caa tgg ttg caa   338His Gly Asp Ala Ala Ala Ser Gly Ile Thr Arg Arg Gln Trp Leu Gln
             15              20                  25ggc gcg ctg gcg ctg acc gca gcg ggc ctc acg ggt tcg ctg aca ttg   386Gly Ala Leu Ala Leu Thr Ala Ala Gly Leu Thr Gly Ser Leu Thr Leu
         30              35                  40cgg gcg ctt gca gac aac ccc ggc act gcg ccg ctc gat acg ttc atg   434Arg Ala Leu Ala Asp Asn Pro Gly Thr Ala Pro Leu Asp Thr Phe Met
 45                  50                  55acg ctt tcc gaa tcg ctg acc ggc aag aaa ggg ctc agc cgc gtg atc   482Thr Leu Ser Glu Ser Leu Thr Gly Lys Lys Gly Leu Ser Arg Val Ile60                  65                  70                  75ggc gag cgc ctg ctg cag gcg ctg cag aag ggc tcg ttc aag acg gcc   530Gly Glu Arg Leu Leu Gln Ala Leu Gln Lys Gly Ser Phe Lys Thr Ala
             80                  85                  90gac agc ctg ccg cag ctc gcc ggc gcg ctc gcg tcc ggt tcg ctg acg   578Asp Ser Leu Pro Gln Leu Ala Gly Ala Leu Ala Ser Gly Ser Leu Thr
         95                 100                 105cct gaa cag gaa tcg ctc gca ctg acg atc ctc gag gcc tgg tat ctc   626Pro Glu Gln Glu Ser Leu Ala Leu Thr Ile Leu Glu Ala Trp Tyr Leu
    110                 115                 120ggc atc gtc gac aac gtc gtg att acg tac gag gaa gca tta atg ttc   674Gly Ile Val Asp Asn Val Val Ile Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Met Phe
125                 130                 135ggc gtc gtg tcc gat acg ctc gtg atc cgt tcg tat tgc ccc aac aaa   722Gly Val Val Ser Asp Thr Leu Val Ile Arg Ser Tyr Cys Pro Asn Lys140                 145                 150                 155ccc ggc ttc tgg gcc gac aaa ccg atc gag agg caa gcc tg atg gcc    769Pro Gly Phe Trp Ala Asp Lys Pro Ile Glu Arg Gln Ala    Met Ala
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     85                  90                  95gtg ggc ggc acg acg tgg cac tgg gcc gcg tcg gcg tgg cgc ttc att   1105Val Gly Gly Thr Thr Trp His Trp Ala Ala Ser Ala Trp Arg Phe Ile
100                 105                 110ccg aac gac ttc aag atg aag agc gtg tac ggc gtc ggc cgc gac tgg   1153Pro Asn Asp Phe Lys Met Lys Ser Val Tyr Gly Val Gly Arg Asp Trp115                 120                 125                 130ccg atc cag tac gac gat ctc gag ccg tac tat cag cgc gcg gag gaa   1201Pro Ile Gln Tyr Asp Asp Leu Glu Pro Tyr Tyr Gln Arg Ala Glu Glu
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        150                 155                 160cgc aag cag ccg tat ccg atg ccg ccg ctg ccg ttg tcg ttc aac gag   1297Arg Lys Gln Pro Tyr Pro Met Pro Pro Leu Pro Leu Ser Phe Asn Glu
    165                 170                 175cag acc atc aag acg gcg ctg aac aac tac gat ccg aag ttc cat gtc   1345Gln Thr Ile Lys Thr Ala Leu Asn Asn Tyr Asp Pro Lys Phe His Val
180                 185                 190gtg acc gag ccg gtc gcg cgc aac agc cgc ccg tac gac ggc cgc ccg   1393Val Thr Glu Pro Val Ala Arg Asn Ser Arg Pro Tyr Asp Gly Arg Pro195                 200                 205                 210act tgt tgc ggc aac aac aac tgc atg ccg atc tgc ccg atc ggc gcg   1441Thr Cys Cys Gly Asn Asn Asn Cys Met Pro Ile Cys Pro Ile Gly Ala
            215                 220                 225atg tac aac ggc atc gtg cac gtc gag aag gcc gaa cgc gcc ggc gcg   1489Met Tyr Asn Gly Ile Val His Val Glu Lys Ala Glu Arg Ala Gly Ala
        230                 235                 240aag ctg atc gag aac gcg gtc gtc tac aag ctc gag acg ggc ccg gac   1537Lys Leu Ile Glu Asn Ala Val Val Tyr Lys Leu Glu Thr Gly Pro Asp
    245                 250                 255aag cgc atc gtc gcg gcg ctc tac aag gac aag acg ggc gcc gag cat   1585Lys Arg Ile Val Ala Ala Leu Tyr Lys Asp Lys Thr Gly Ala Glu His
260                 265                 270cgc gtc gaa ggc aag tat ttc gtg ctc gcc gcg aac ggc atc gag acg   1633Arg Val Glu Gly Lys Tyr Phe Val Leu Ala Ala Asn Gly Ile Glu Thr275                 280                 285                 290ccg aag atc ctg ctg atg tcc gcg aac cgc gat ttc ccg aac ggt gtc   1681Pro Lys Ile Leu Leu Met Ser Ala Asn Arg Asp Phe Pro Asn Gly Val
            295                 300                 305gcg aac agc tcg gac atg gtc ggc cgc aac ctg atg gac cat ccg ggc   1729Ala Asn Ser Ser Asp Met Val Gly Arg Asn Leu Met Asp His Pro Gly
        310                 315                 320acc ggc gtg tcg ttc tat gcg agc gag aag ctg tgg ccg ggc cgc ggc   1777Thr Gly Val Ser Phe Tyr Ala Ser Glu Lys Leu Trp Pro Gly Arg Gly
    325                 330                 335ccg cag gag atg acg tcg ctg atc ggt ttc cgc gac ggt ccg ttc cgc   1825Pro Gln Glu Met Thr Ser Leu Ile Gly Phe Arg Asp Gly Pro Phe Arg
340                 345                 350gcg acc gaa gcg gcg aag aag atc cac ctg tcg aac ctg tcg cgc atc   1873Ala Thr Glu Ala Ala Lys Lys Ile His Leu Ser Asn Leu Ser Arg Ile355                 360                 365                 370gac cag gag acg cag aag atc ttc aag gcc ggc aag ctg atg aag ccc   1921Asp Gln Glu Thr Gln Lys Ile Phe Lys Ala Gly Lys Leu Met Lys Pro
            375                 380                 385gac gag ctc gac gcg cag atc cgc gac cgt tcc gca cgc tac gtg cag   1969Asp Glu Leu Asp Ala Gln Ile Arg Asp Arg Ser Ala Arg Tyr Val Gln
        390                 395                 400ttc gac tgc ttc cac gaa atc ctg ccg caa ccc gag aac cgc atc gtg   2017Phe Asp Cys Phe His Glu Ile Leu Pro Gln Pro Glu Asn Arg Ile Val
    405                 410                 415ccg agc aag acg gcg acc gat gcg atc ggc att ccg cgc ccc gag atc   2065Pro Ser Lys Thr Ala Thr Asp Ala Ile Gly Ile Pro Arg Pro Glu Ile
420                 425                 430acg tat gcg atc gac gac tac gtg aag cgc ggc gcc gcg cat acg cgc   2113Thr Tyr Ala Ile Asp Asp Tyr Val Lys Arg Gly Ala Ala His Thr Arg435                 440                 445                 450gag gtc tac gcg acc gcc gcg aag gtg ctc ggc ggc acg gac gtc gtg   2161Glu Val Tyr Ala Thr Ala Ala Lys Val Leu Gly Gly Thr Asp Val Val
            455                 460                 465ttc aac gac gaa ttc gcg ccg aac aat cac atc acg ggc tcg acg atc   2209Phe Asn Asp Glu Phe Ala Pro Asn Asn His Ile Thr Gly Ser Thr Ile
        470                 475                 480atg ggc gcc gat gcg cgc gac tcc gtc gtc gac aag gac tgc cgc acg   2257Met Gly Ala Asp Ala Arg Asp Ser Val Val Asp Lys Asp Cys Arg Thr
    485                 490                 495ttc gac cat ccg aac ctg ttc att tcg agc agc gcg acg atg ccg acc   2305Phe Asp His Pro Asn Leu Phe Ile Ser Ser Ser Ala Thr Met Pro Thr
500                 505                 510gtc ggt acc gta aac gtg acg ctg acg atc gcc gcg ctc gcg ctg cgg   2353Val Gly Thr Val Asn Val Thr Leu Thr Ile Ala Ala Leu Ala Leu Arg515                 520                 525                 530atg tcg gac acg ctg aag aag gaa gtc tgacc gtg cgg aaa tct act ctc 2403Met Ser Asp Thr Leu Lys Lys Glu Val       Val Arg Lys Ser Thr Leu
            535                         1               5act ttc ctc atc gcc ggc tgc ctc gcg ttg ccg ggc ttc gcg cgc gcg   2451Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu Pro Gly Phe Ala Arg Ala
         10                  15                  20gcc gat gcg gcc gat c                                             2467Ala Asp Ala Ala Asp
     25<210> 2<211> 168<212> PRT<213> 洋葱伯克霍尔德氏菌<400> 2Met His Asn Asp Asn Thr Pro His Ser Arg Arg His Gly Asp Ala Ala1                   5                  10                  15Ala Ser Gly Ile Thr Arg Arg Gln Trp Leu Gln Gly Ala Leu Ala Leu
             20                  25                  30Thr Ala Ala Gly Leu Thr Gly Ser Leu Thr Leu Arg Ala Leu Ala Asp
         35                  40                  45Asn Pro Gly Thr Ala Pro Leu Asp Thr Phe Met Thr Leu Ser Glu Ser
     50                  55                  60Leu Thr Gly Lys Lys Gly Leu Ser Arg Val Ile Gly Glu Arg Leu Leu65                  70                  75                  80Gln Ala Leu Gln Lys Gly Ser Phe Lys Thr Ala Asp Ser Leu Pro Gln
             85                  90                  95Leu Ala Gly Ala Leu Ala Ser Gly Ser Leu Thr Pro Glu Gln Glu Ser
        100                 105                 110Leu Ala Leu Thr Ile Leu Glu Ala Trp Tyr Leu Gly Ile Val Asp Asn
    115                 120                 125Val Val Ile Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Met Phe Gly Val Val Ser Asp
130                 135                 140Thr Leu Val Ile Arg Ser Tyr Cys Pro Asn Lys Pro Gly Phe Trp Ala145                 150                 155                 160Asp Lys Pro Ile Glu Arg Gln Ala
            165<210> 3<211> 539<212> PRT<213> 洋葱伯克霍尔德氏菌<400> 3Met Ala Asp Thr Asp Thr Gln Lys Ala Asp Val Val Val Val Gly Ser1               5                  10                  15Gly Val Ala Gly Ala Ile Val Ala His Gln Leu Ala Met Ala Gly Lys
         20                  25                  30Ala Val Ile Leu Leu Glu Ala Gly Pro Arg Met Pro Arg Trp Glu Ile
     35                  40                  45Val Glu Arg Phe Arg Asn Gln Pro Asp Lys Met Asp Phe Met Ala Pro
 50                  55                  60Tyr Pro Ser Ser Pro Trp Ala Pro His Pro Glu Tyr Gly Pro Pro Asn65                  70                  75                  80Asp Tyr Leu Ile Leu Lys Gly Glu His Lys Phe Asn Ser Gln Tyr Ile
             85                  90                  95Arg Ala Val Gly Gly Thr Thr Trp His Trp Ala Ala Ser Ala Trp Arg
        100                 105                 110Phe Ile Pro Asn Asp Phe Lys Met Lys Ser Val Tyr Gly Val Gly Arg
    115                 120                 125Asp Trp Pro Ile Gln Tyr Asp Asp Leu Glu Pro Tyr Tyr Gln Arg Ala
130                 135                 140Glu Glu Glu Leu Gly Val Trp Gly Pro Gly Pro Glu Glu Asp Leu Tyr145                 150                 155                 160Ser Pro Arg Lys Gln Pro Tyr Pro Met Pro Pro Leu Pro Leu Ser Phe
            165                 170                 175Asn Glu Gln Thr Ile Lys Thr Ala Leu Asn Asn Tyr Asp Pro Lys Phe
        180                 185                 190His Val Val Thr Glu Pro Val Ala Arg Asn Ser Arg Pro Tyr Asp Gly
    195                 200                 205Arg Pro Thr Cys Cys Gly Asn Asn Asn Cys Met Pro Ile Cys Pro Ile
210                 215                 220Gly Ala Met Tyr Asn Gly Ile Val His Val Glu Lys Ala Glu Arg Ala225                 230                 235                 240Gly Ala Lys Leu Ile Glu Asn Ala Val Val Tyr Lys Leu Glu Thr Gly
            245                 250                 255Pro Asp Lys Arg Ile Val Ala Ala Leu Tyr Lys Asp Lys Thr Gly Ala
        260                 265                 270Glu His Arg Val Glu Gly Lys Tyr Phe Val Leu Ala Ala Asn Gly Ile
    275                 280                 285Glu Thr Pro Lys Ile Leu Leu Met Ser Ala Asn Arg Asp Phe Pro Asn
290                 295                 300Gly Val Ala Asn Ser Ser Asp Met Val Gly Arg Asn Leu Met Asp His305                 310                 315                 320Pro Gly Thr Gly Val Ser Phe Tyr Ala Ser Glu Lys Leu Trp Pro Gly
            325                 330                 335Arg Gly Pro Gln Glu Met Thr Ser Leu Ile Gly Phe Arg Asp Gly Pro
        340                 345                 350Phe Arg Ala Thr Glu Ala Ala Lys Lys Ile His Leu Ser Asn Leu Ser
    355                 360                 365Arg Ile Asp Gln Glu Thr Gln Lys Ile Phe Lys Ala Gly Lys Leu Met
370                 375                 380Lys Pro Asp Glu Leu Asp Ala Gln Ile Arg Asp Arg Ser Ala Arg Tyr385                 390                 395                 400Val Gln Phe Asp Cys Phe His Glu Ile Leu Pro Gln Pro Glu Asn Arg
            405                 410                 415Ile Val Pro Ser Lys Thr Ala Thr Asp Ala Ile Gly Ile Pro Arg Pro
        420                 425                 430Glu Ile Thr Tyr Ala Ile Asp Asp Tyr Val Lys Arg Gly Ala Ala His
    435                 440                 445Thr Arg Glu Val Tyr Ala Thr Ala Ala Lys Val Leu Gly Gly Thr Asp
450                 455                 460Val Val Phe Asn Asp Glu Phe Ala Pro Asn Asn His Ile Thr Gly Ser465                 470                 475                 480Thr Ile Met Gly Ala Asp Ala Arg Asp Ser Val Val Asp Lys Asp Cys
            485                 490                 495Arg Thr Phe Asp His Pro Asn Leu Phe Ile Ser Ser Ser Ala Thr Met
        500                 505                 510Pro Thr Val Gly Thr Val Asn Val Thr Leu Thr Ile Ala Ala Leu Ala
    515                 520                 525Leu Arg Met Ser Asp Thr Leu Lys Lys Glu Val
530                 535<210> 4<211> 27<212> PRT<213> 洋葱伯克霍尔德氏菌<400> 4Val Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu1               5                  10                  15Pro Gly Phe Ala Arg Ala Ala Asp Ala Ala Asp
         20                  25<210> 5<211> 16<212> PRT<213> 洋葱伯克霍尔德氏菌<400> 5Ala Asp Ala Ala Asp Pro Ala Leu Val Lys Arg Gly Glu Tyr Leu Ala1               5                  10                  15<210> 6<211> 15<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的说明：引物<400> 6gcggatgcgg cggat                                                  15<210> 7<211> 15<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的说明：引物<400> 7cgccagatat tcgcc                                                  15<210> 8<211> 18<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的说明：引物<400> 8ccggcgctgg tgaaacgc                                               18<210> 9<211> 28<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的说明：引物<400> 9cccaagcttg ggccgatacc gatacgca                                    28<210> 10<211> 28<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的说明：引物<400> 10gagaagcttt ccgcacggtc agacttcc                                    28<210> 11<211> 27<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的说明：引物<400> 11catgccatgg cacacaacga caacact                                     27<210> 12<211> 31<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的说明：引物<400> 12cccaagcttg ggtcagactt  ccttcttcag c                               31

Claims (41)

1.生产葡萄糖脱氢酶的方法，包括下列步骤：在培养基中培养具有葡萄糖脱氢酶产生能力的伯克霍尔德氏菌属微生物，从培养基和/或微生物细胞中收集葡萄糖脱氢酶。
2.根据权利要求1的生产葡萄糖脱氢酶的方法，其中该微生物是洋葱伯克霍尔德氏菌。
3.根据权利要求1或2的生产葡萄糖脱氢酶的方法，其中该葡萄糖脱氢酶具有下列性质：
(i)该酶具有催化葡萄糖脱氢反应的作用；
(ii)该酶由这样的亚单位组成，它们在还原条件下、在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示约60kDa的分子量和约43kDa的分子量；
(iii)该酶在使用TSK Gel G3000SW(Tosoh公司)的凝胶过滤色谱中显示约380kDa的分子量；和
(iv)该酶显示45℃左右的最佳反应温度(Tris-HCl缓冲液，pH8.0)。
4.根据权利要求3的生产葡萄糖脱氢酶的方法，其中显示约43kDa分子量的亚单位是一种电子转移蛋白。
5.根据权利要求4的生产葡萄糖脱氢酶的方法，其中该电子转移蛋白是细胞色素C。
6.葡萄糖脱氢酶，它能够被伯克霍尔德氏菌属微生物产生。
7.根据权利要求6的葡萄糖脱氢酶，其中该微生物是洋葱伯克霍尔德氏菌。
8.根据权利要求6或7的葡萄糖脱氢酶，其中该葡萄糖脱氢酶具有下列性质：
(i)该酶具有催化葡萄糖脱氢反应的作用；
(ii)该酶由这样的亚单位组成，它们在还原条件下、在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示约60kDa的分子量和约43kDa的分子量；
(iii)该酶在使用TSK Gel G3000SW(Tosoh公司)的凝胶过滤色谱中显示约380kDa的分子量；和
(iv)该酶显示45℃左右的最佳反应温度(Tris-HCl缓冲液，pH8.0)。
9.根据权利要求8的葡萄糖脱氢酶，其中显示约43kDa分子量的亚单位是一种电子转移蛋白。
10.根据权利要求9的葡萄糖脱氢酶，其中该电子转移蛋白是细胞色素C。
11.根据权利要求8至10任意一项的葡萄糖脱氢酶，其中显示约60kDa分子量的亚单位包含SEQ ID NO：3中第2至12氨基酸的氨基酸序列。
12.根据权利要求8至11任意一项的葡萄糖脱氢酶，其中显示43kDa分子量的亚单位的N-末端具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
13.根据权利要求11的葡萄糖脱氢酶，其中显示约60kDa分子量的亚单位是如下列(A)或(B)所定义的蛋白质：
(A)具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的蛋白质；
(B)具有包括一个或若干氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加的SEQ ID NO：3的氨基酸序列和葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质。
14.根据权利要求6的葡萄糖脱氢酶，它在45℃左右和75℃左右显示活性峰。
15.细胞色素C，它是根据权利要求10的葡萄糖脱氢酶的亚单位，并且具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
16.DNA，它编码根据权利要求15的细胞色素C的一部分，并且具有SEQ ID NO：8的核苷酸序列。
17.DNA，它编码根据权利要求15的细胞色素C的一部分，并且具有SEQ ID NO：1核苷酸序列中第2386至2467核苷酸的核苷酸序列。
18.DNA，它编码根据权利要求15的细胞色素C的信号肽，并且包含SEQ ID NO：1核苷酸序列中第2386至2451核苷酸的核苷酸序列。
19.肽，它是细胞色素C的信号肽，并且具有SEQ ID NO：4氨基酸序列中第1至22氨基酸的氨基酸序列。
20.具有下列性质的蛋白质：
(i)该蛋白质能够作为亚单位构成根据权利要求6的葡萄糖脱氢酶；
(ii)该蛋白质具有葡萄糖脱氢酶活性；
(iii)该蛋白质在还原条件下、在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示约60kDa的分子量；和
(iv)该蛋白质显示75℃左右的最佳反应温度(Tris-HCl缓冲液，pH8.0)。
21.根据权利要求20的蛋白质，它包含SEQ ID NO：3中第2至12氨基酸的氨基酸序列。
22.根据权利要求21的葡萄糖脱氢酶，其中该蛋白质是如下列(A)或(B)所定义的蛋白质：
(A)具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的蛋白质；
(B)具有包括一个或若干氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加的SEQ ID NO：3的氨基酸序列和葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质。
23.如下列(A)或(B)所定义的蛋白质：
(A)具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的蛋白质；
(B)具有包括一个或若干氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加的SEQ ID NO：3的氨基酸序列和葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质。
24.DNA，它编码如下列(A)或(B)所定义的蛋白质：
(A)具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的蛋白质；
(B)具有包括一个或若干氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加的SEQ ID NO：3的氨基酸序列和葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质。
25.根据权利要求24的DNA，它是如下列(a)或(b)所定义的DNA：
(a)包含SBQ ID NO：1核苷酸序列中第764至2380核苷酸的核苷酸序列的DNA；
(b)在严格条件下可与包含SEQ ID NO：1中第764至2380核苷酸的核苷酸序列或能够从该序列制备的探针杂交、并且编码具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的DNA。
26.包含根据权利要求24或25的DNA的重组载体。
27.根据权利要求26的重组载体，它包含编码根据权利要求18的信号肽和β-亚单位的核苷酸序列。
28.用根据权利要求24或25的DNA或根据权利要求26或27的重组载体转化的转化体。
29.生产葡萄糖脱氢酶的方法，包括下列步骤：培养根据权利要求28的转化体以产生作为DNA的表达产物的葡萄糖脱氢酶，再收集之。
30.洋葱伯克霍尔德氏菌KS1菌株(FERM BP-7306)。
31.使用一种酶电极的葡萄糖传感器，该酶电极包括根据权利要求6至14任意一项的葡萄糖脱氢酶、根据权利要求20至23任意一项的蛋白质、根据权利要求27的转化体或根据权利要求30的菌株。
32.葡萄糖测定试剂盒，包括根据权利要求6至14任意一项的葡萄糖脱氢酶或根据权利要求20至23任意一项的蛋白质。
33.具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白质。
34.编码一种蛋白质的DNA，该蛋白质具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
35.根据权利要求34的DNA，它包含SEQ ID NO：1核苷酸序列中第258至761核苷酸的核苷酸序列。
36.DNA，按顺序包含根据权利要求34或35的DNA和根据权利要求24或25的DNA。
37.根据权利要求36的DNA，它包含SEQ ID NO：1核苷酸序列中第258至2380核苷酸的核苷酸序列。
38.包含根据权利要求36或37的DNA的重组载体。
39.根据权利要求38的重组载体，它包含编码根据权利要求18的信号肽和β-亚单位的核苷酸序列。
40.用根据权利要求36或37的DNA或根据权利要求38或39的重组载体转化的转化体。
41.生产葡萄糖脱氢酶的方法，包括下列步骤：培养根据权利要求40的转化体以产生作为根据权利要求36或37的DNA的表达物质的葡萄糖脱氢酶，再收集之。
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