PL207576B1 - Białko, DNA, rekombinowany wektor, transformant, sposób wytwarzania białka o aktywności dehydrogenazy glukozowej, szczep Burkhorderia cepacia KS1 (FERM BP-7306) oraz sensor glukozy i zestaw do oznaczania glukozy - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy nowej dehydrogenazy glukozowej i sposobu jej wytwarzania, DNA kodującego ten enzym, rekombinowanego wektora zawierającego DNA kodujący ten enzym, transformanta stransformowanego zrekombinowanym wektorem, nowego mikroorganizmu wytwarzającego ten enzym, sensora glukozy wykorzystującego elektrodę enzymatyczną zawierającą ten enzym oraz zestawu do oznaczania glukozy.

Biosensory wykorzystujące enzym, który specyficznie reaguje z określonym substratem aktywnie opracowuje się w różnych dziedzinach przemysłu. Sensor glukozy jest jednym z biosensorów w sposobach pomiaru i urządzeniach wykorzystujących takie sposoby opracowywanych w dziedzinach związanych z medycyną.

Historia sensora glukozy liczy około 40 lat, odkąd Clark i Lyons w 1962 roku po raz pierwszy opisali biosensor zawierający oksydazę glukozową i elektrodę tlenową, w połączeniu, (L.C. Clark, J. i Lyonas, C. „Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery. Ann. n. y. Acad. Sci., 105: 20-45).

A zatem, stosowanie oksydazy glukozowej jako enzymu sensora glukozy ma długą historię. Jest to spowodowane tym, że oksydaza glukozowa wykazuje wysoką specyficzność substratowa i lepszą stabilność termiczną . Enzym ten moż na też wytwarzać na dużą skalę a koszt jego produkcji jest niższy niż pozostałych enzymów.

Wysoka specyficzność substratowa oznacza, że enzym ten nie reaguje z sacharydami innymi niż glukoza, co stanowi jego zaletę, ponieważ można uzyskiwać właściwe pomiary bez błędu wartości pomiaru.

Ponadto, lepsza stabilność termiczna oznacza, że można zaradzić problemom związanym z denaturacją enzymu i inaktywacją jego aktywności enzymatycznej powodowanym przez ciepło, co stanowi zaletę, ponieważ właściwy pomiar można przeprowadzać w ciągu długiego czasu.

Jednakże, chociaż oksydaza glukozowa wykazuje wysoką specyficzność substratową i lepszą stabilność termiczną i może być produkowana przy niskich kosztach, istnieje problem polegający na tym, że na ten enzym oddziałuje rozpuszczony tlen a to wpływa na wyniki pomiarów.

Tymczasem, oprócz oksydazy glukozowej, opracowano również sensor glukozy wykorzystujący dehydrogenazę glukozową. Enzym ten znaleziono również w mikroorganizmach.

Na przykład, znana jest dehydrogenaza glukozowa pochodząca z bakterii z rodzaju Bacillus (EC 1.1.1.47) i dehydrogenaza glukozowa pochodząca z bakterii z rodzaju Cryptococcus (EC 1.1.1.119).

Pierwsza dehydrogenaza glukozowa (EC 1.1.1.47) jest enzymem, który katalizuje reakcję β-D-glukoza + NAD (P)+ D-ó-glukonolakton + NAD (P)H + H+, a druga dehydrogenaza glukozowa (EC 1.1.1.119) jest enzymem, który katalizuje reakcję

D-glukoza + NADP+ D-ó-glukonolakton + NADPH + H+.

Dehydrogenazy glukozowe pochodzące z mikroorganizmów są już w sprzedaży. Zaletą tych dehydrogenaz glukozowych jest to, że nie oddziałują one z tlenem rozpuszczonym w mierzonej próbce. Stanowi to ich istotną zaletę bo można uzyskiwać właściwe pomiary bez błędów w wynikach, nawet jeśli pomiar przeprowadza się w środowisku, w którym ciśnienie cząstkowe tlenu jest niskie lub do pomiaru stosuje się próbkę o wysokim stężeniu wymagającą dużej ilości tlenu.

Jednakże, chociaż na dehydrogenazę glukozową nie oddziałuje rozpuszczony tlen, to istnieje problem z jej stabilnością termiczną i słabszą specyficznością substratową niż w przypadku oksydazy glukozowej.

Dlatego też, pożądany jest enzym, który pokonałby wady obu enzymów, oksydazy glukozowej i dehydrogenazy glukozowej.

Twórcy wynalazku podawali wyniki swoich badań, dotyczących dehydrogenazy glukozowej z wykorzystaniem próbek zebranych z gleby w pobliż u gorą cych ź ródeł , w Sode K., Tsugawa W., Yamazaki T., Watanabe M., Ogasawara N. i Tanaka M., Enzyme Microb. Technol., 19, 82-85 (1996); Yamazaki T., Tsugawa W. i Sode K., Appli. Biochemi. and Biotec. Lett., 21, 199-202 (1999).

Jednakże, na tym etapie badań nie zidentyfikowano szczepu bakteryjnego posiadającego zdolność wytwarzania tlenu.

Przedmiotem wynalazku jest białko o sekwencji aminokwasowej o numerze identyfikacyjnym: 3 i DNA kodujący to białko, który zawiera sekwencję nukleotydową od numeru 764 do 2380 w sekwencji

PL 207 576 B1 nukleotydowej o numerze identyfikacyjnym: 1. Rekombinowany wektor według wynalazku zawiera taki DNA. Transformant jest stransformowany określonym DNA lub rekombinowanym wektorem.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania białka o aktywności dehydrogenazy glukozowej, który obejmuje etapy hodowania opisanego transformanta w celu wytwarzania dehydrogenazy glukozowej jako produktu ekspresji DNA i etap zbierania go.

Sposób wytwarzania białka o aktywności dehydrogenazy glukozowej obejmuje etapy hodowania mikroorganizmu z rodzaju Burkhorderia o zdolności do wytwarzania w pożywce określonego białka i etap zbierania biał ka lub kompleksu zawieraj ącego biał ko z poż ywki i/lub komórek mikroorganizmu.

Mikroorganizmem stosowanym w sposobie według wynalazku jest korzystnie Burkhorderia cepacia, a zwłaszcza szczep Burkhorderia cepacia KS1 (FERM BP-7306).

Sensor glukozy według wynalazku wykorzystuje elektrodę enzymatyczną obejmującą określone białko, transformant lub szczep.

Zestaw do oznaczania glukozy obejmuje białko według wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest także białko o sekwencji aminokwasowej o numerze identyfikacyjnym: 2 i DNA kodujący to białko, który zawiera sekwencję nukleotydową od numeru od 258 do 761 w sekwencji nukleotydowej o numerze identyfikacyjnym: 1. DNA, korzystnie obejmuje DNA w określonej kolejności.

Korzystnie DNA zawiera sekwencję nukleotydową od numeru 258 do 2380 w sekwencji nukleotydowej o numerze identyfikacyjnym: 1. Rekombinowany wektor zawiera DNA określony według wynalazku.

Transformant, jest stransformowany tym DNA lub zrekombinowanym wektorem.

Sposób wytwarzania białka o aktywności dehydrogenazy glukozowej według wynalazku, obejmuje etapy hodowania transformanta w celu wytwarzania produktu ekspresji DNA określonego i etap zbierania go.

Celem wynalazku jest uzyskanie enzymu, który nie ma wad obu znanych enzymów, oksydazy glukozowej i dehydrogenazy glukozowej, tj. enzymu, który wykazuje wysoką specyficzność substratowa i lepszą stabilność termiczną, który można wytwarzać przy niskich kosztach i który nie oddziałuje z tlenem rozpuszczonym w badanej próbce.

Twórcy wynalazku z powodzeniem wyizolowali z gleby w pobliżu gorących źródeł Burkhorderia cepacia wytwarzający enzym spełniający założone cele i tak zrealizowali wynalazek.

<1> Nowy szczep bakteryjny wytwarzający dehydrogenazę glukozową

Enzym (dalej określany jako „enzym lub „GDH) może być wytwarzany przez bakterię należącą do rodzaju Burkhorderia. Nie ma szczególnych ograniczeń dotyczących bakterii z rodzaju Burkhorderia stosowanej w wynalazku, tak długo jak jest ona bakterią z rodzaju Burkhorderia posiadającą zdolność wytwarzania enzymu. Jednakże, preferowana jest Burkhorderia cepacia, a w szczególności szczep KSl Burkhorderia cepacia. Ten szczep bakteryjny jest nowym szczepem bakteryjnym wyizolowanym przez twórców wynalazku z gleby w pobliżu gorących źródeł w Japonii, jak opisano w przykładach i zidentyfikowanym jako Burkhorderia cepacia, na podstawie jego właściwości bakteriologicznych. Wcześniej nie było wiadomo, że mikroorganizm należący do rodzaju Burkhorderia może wytwarzać dehydrogenazę glukozową. Ten bakteryjny szczep oznaczono jako szczep KS1 i zdeponowano w International Patent Organizm Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Tsuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, kod pocztowy: 305-8566) 25 września 2000 roku i otrzymano numer dostępu mikroorganizmu FERM BP-7306.

Twórcy wynalazku uzyskali kilka szczepów Burkhorderia cepacia innych niż szczep KSl Burkhorderia cepacia, które zdeponowali w Institute of Fermentation (Osaka, IFO) lub w Japan Collection of Microorganisms (JCM), The Institute of Physical and Chemical Research, i mierzyli aktywność dehydrogenazy glukozowej. W wyniku pomiarów potwierdzono, że wszystkie te szczepy bakteryjne wykazują aktywność.

<2> Dehydrogenaza glukozowa według wynalazku

Jeśli bakterię Burkhorderia wykazującą zdolność wytwarzania dehydrogenazy glukozowej, na przykład szczep KS1 Burkhorderia cepacia, hoduje się w podłożu hodowlanym stosowanym do zwykłych hodowli mikroorganizmów, korzystnie w podłożu zawierającym glukozę lub substancję zawierającą glukozę w celu podwyższenia zdolności wytwarzania enzymu, to wytwarzana jest dehydrogenaza glukozowa według wynalazku i akumuluje się ona w produkcie hodowlanym lub w komórkach hodowanych. Dlatego, zbiera się ją znanymi metodami. Sposób wytwarzania enzymu szczegółowo wyjaśniono na przykładzie szczepu KS1 Burkhorderia cepacia.

PL 207 576 B1

Najpierw, szczep KS1 Burkhorderia cepacia hoduje się w odpowiednim podłożu hodowlanym, na przykład, w podłożu zawierającym odpowiednie źródło węgla, źródło azotu, sole nieorganiczne, glukozę lub substancje zawierające je w celu wytworzenia i zakumulowania enzymu w produkcie hodowlanym lub hodowanych komórkach.

Jako źródła węgla, można stosować dowolne substancje, które mogą być asymilowane, na przykład, D-glukozę, L-arabinozę, D-ksylozę, D-mannozę, skrobię, różne peptony i inne. Jako źródła azotu, można stosować ekstrakt drożdżowy, ekstrakt słodowy, różne peptony, różne ekstrakty mięsne, namok kukurydziany, roztwory aminokwasów oraz organiczne i nieorganiczne związki azotu, takie jak sole amonowe lub substancje je zawierające. Jako sole nieorganiczne, można stosować różne sole kwasu fosforowego oraz sole magnezu, potasu, sodu, wapnia i inne. Ponadto, jeśli jest to pożądane, do podłoża można dodawać różne substancje nieorganiczne i organiczne wymagane do wzrostu bakterii lub wytwarzania enzymu, na przykład, olej silikonowy, olej sezamowy, środki przeciw-spienianiu, takie jak różne środki powierzchniowo czynne oraz witaminy.

Jeśli chodzi o samą metodę hodowli, to chociaż można stosować zarówno hodowlę płynną jak i stałą, to zazwyczaj preferuje się hodowlę pł ynną .

Enzym według wynalazku można otrzymać z podłoża i/lub hodowli komórek. Enzym, znajdujący się w komórkach, można otrzymać jako ekstrakt komórkowy poprzez rozerwanie lub lizę komórek.

Dehydrogenazę glukozową w produkcie hodowlanym lub w ekstrakcie komórkowym można oczyszczać stosując odpowiednią kombinację technik chromatograficznych wykorzystując wymieniacz jonowy, nośnik do filtracji żelowej, nośnik hydrofobowy i inne.

Aktywność enzymu można mierzyć stosując te same metody jakie są znane do mierzenia aktywności dehydrogenazy glukozowej. W szczególności, aktywność można mierzyć metodą opisaną w przykładach.

Właściwości fizykochemiczne nowej dehydrogenazy glukozowej według wynalazku są następujące:

(i) enzym posiada zdolność katalizowania reakcji dehydrogenacji glukozy;

(ii) enzym składa się z podjednostek mających masę cząsteczkową około 60 kDa i około 43 kDa w elektroforezie w żelu poliakryloamidowym z SDS w warunkach redukujących;

(iii) enzym ma masę cząsteczkową około 380 kDa w chromatografii żelowej z zastosowaniem żelu TSK G3000SW (Tosoh Corporation) oraz (iv) enzym wykazuje optymalną temperaturę reakcji około 45°C (bufor Tris-HCl, pH 8,0).

Dehydrogenaza glukozowa wykazuje pik aktywności w temperaturze około 45°C w uprzednio podanych warunkach, jak również wykazuje pik aktywności w temperaturze około 75°C (patrz. fig. 3 (a)). Nie jest znana żadna GDH, która wykazywałaby pik aktywności w obu zakresach temperatury, jak opisano powyżej.

Masę cząsteczkową i optymalną temperaturę można mierzyć metodami opisanymi w przykładach.

Dehydrogenaza glukozowa według wynalazku składa się z dwóch odrębnych polipeptydów, podjednostki α posiadającej masę cząsteczkową około 60 kDa i podjednostki β posiadającej masę cząsteczkową około 43 kDa (dalej w opisie, ta dehydrogenaza glukozowa określana jest również jako „enzym multimeryczny). Twórcy wynalazku szczegółowo badali dalej te dwie podjednostki.

Stwierdzono, że podjednostka β to cytochrom C (jak pokazano później w przykładach). Białko zawierające tylko podjednostkę α wykazuje następujące właściwości fizykochemiczne:

(i) białko może tworzyć dehydrogenazę glukozową jako podjednostka;

(ii) białko posiada aktywność dehydrogenazy glukozowej;

(iii) białko ma masę cząsteczkową około 60 kDa w elektroforezie w żelu poliakryloamidowym z SDS w warunkach redukują cych oraz (iv) białko wykazuje optymalną temperaturę reakcji około 75°C (bufor Tris-HCl, pH 8,0).

Optymalną temperaturę można mierzyć metodą opisaną w przykładach.

Ponieważ białko to samo wykazuje aktywność enzymatyczną, to białko można dowolnie nazywać „enzymem peptydowym lub „enzymem, w zależności od istoty wyjaśnienia.

Jako szczególne rozwiązanie enzymu peptydowego według wynalazku można wymienić białko posiadające sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym: 3. Ponadto, ten enzym peptydowy może być białkiem posiadającym sekwencję aminokwasową zawierającą podstawienie, delecję, insercję lub addycję jednej lub więcej reszt aminokwasowych w sekwencji aminokwasowej o numerze identyfikacyjnym: 3, tak długo jak długo zachowuje ono aktywność GDH. Chociaż sekwencja aminokwasowa, która może być kodowana przez sekwencję nukleotydową o numerze identyfikacyjnym: 1,

PL 207 576 B1 jest przedstawiona jako sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 3, reszty metioniny w końcu N mogą zostać wyeliminowane po translacji.

Ponadto, jako szczególne rozwiązanie multimerycznego enzymu według wynalazku, można wymienić multimer zawierający białko, którego podjednostka α posiada sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym: 3. Ponadto, enzym multimeryczny moż e być multimerem zawierają cym białko, którego podjednostka α posiada sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym: 3, obejmującą podstawienie, delecję, insercję lub addycję jednej lub więcej reszt aminokwasowych, tak długo jak długo zachowuje ona aktywność GDH.

„Jedna lub więcej oznacza liczbę od 1 do 10, korzystnie od 1 do 5, szczególnie korzystnie od 1 do 3.

Twórcy wynalazku potwierdzili istnienie podjednostki γ, oprócz podjednostki α i podjednostki β.

W przykł adach opisano, ż e podjednostkę γ usuni ę to z supernatantu hodowlanego lub ekstraktu komórkowego na etapie oczyszczania enzymu, i dlatego nie potwierdzono obecności podjednostki γ w oczyszczonym enzymie. Jednakże, jak pokazano w przykładach, jeś li podjednostka γ ulegała ekspresji razem z podjednostka α, uzyskiwano wysoką aktywność enzymatyczną w porównaniu z przypadkiem, gdy ekspresji ulegała tylko podjednostka α. Sugeruje to, że podjednostka γ była białkiem w jakiś sposób zaangaż owanym w wytwarzanie podjednostki α w komórkach mikroorganizmu. Przyjmując, że aktywność właściwa podjednostki α (aktywność enzymatyczna na białko) jest taka sama w obu przypadkach, niższa aktywność enzymatyczna wskazuje na mniejszą ilość podjednostki α, ponieważ aktywność enzymatyczna odzwierciedla ilość enzymu. Z drugiej strony, wytworzona podjednostka α może być w jakiś sposób zablokowana przez podjednostkę γ, albo mimo, że podjednostka α ulega pełnej ekspresji jako białko, to nie może osiągnąć trójwymiarowej struktury dla przejawiania aktywności enzymatycznej z powodu braku podjednostki γ, i w ten sposób aktywność enzymatyczna staje się niska. W obu przypadkach, wysoką aktywność enzymatyczną można uzyskać, jeśli podjednostka γ ulega ekspresji razem z podjednostka α.

<3> DNA według wynalazku

DNA według wynalazku można otrzymać z mikroorganizmu zawierającego DNA, na przykład Burkhorderia cepacia. DNA wyizolowano z chromosomalnego DNA Burkhorderia cepacia. Jednakże, ujawnienie jego sekwencji nukleotydowej oraz sekwencji aminokwasowej kodowanej przez tę sekwencję nukleotydową pozwala by to DNA również otrzymać przez syntezę chemiczną w oparciu o te sekwencje. Ponadto, DNA według wynalazku można również otrzymać z chromosomalnego DNA Burkhorderia cepacia lub podobnie przez hybrydyzację, bądź PCR stosując, jako sondę lub starter, oligonukleotyd przygotowany na podstawie tej sekwencji.

W dodatku DNA, który koduje białko posiadające sekwencję aminokwasową według sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 3, DNA wed ł ug wynalazku mo ż e być DNA, który koduje białko posiadają ce sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym: 3, obejmującą podstawienie, delecję, insercję lub addycję jednej lub więcej reszt aminokwasowych i wykazujące aktywność GDH.

Jako DNA według wynalazku, można w szczególności wymienić DNA posiadający sekwencję nukleotydową nukleotydów o numerach od 764 do 2380 w sekwencji nukleotydowej o numerze identyfikacyjnym: 1. Sekwencja nukleotydowa nukleotydów o numerach od 764 do 2380 w sekwencji nukleotydowej o numerze identyfikacyjnym: 1 koduje podjednostkę α GDH posiadającą sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym: 3.

Ponadto, DNA według wynalazku może również być DNA, który jest zdolny do hybrydyzacji z sekwencją nukleotydową nukleotydów o numerach od 764 do 2380 w sekwencji nukleotydowej o numerze identyfikacyjnym: 1 lub z sondą, którą można przygotować z sekwencji w ostrych warunkach, i który koduje białko wykazujące aktywność GDH.

Uważa się, że sekwencja nukleotydowa nukleotydów o numerach od 258 do 761 w sekwencji nukleotydowej o numerze identyfikacyjnym: 1 koduje podjednostkę γ. Sekwencję aminokwasową przedstawiono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2. Uważa się, że ponieważ gen strukturalny podjednostki γ znajduje się w regionie przed regionem genu podjednostki α, i w ten sposób podjednostka γ ulega ekspresji jako pierwsza i istnieje już jako białko podczas wytwarzania podjednostki α przez mikroorganizm, to podjednostka α może być wydajnie wytwarzana w mikroorganizmie. Dlatego też, DNA według wynalazku może obejmować DNA, kodujący sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym: 2, w dodatku do uprzednio wspomnianego DNA.

DNA, kodujący białko zasadniczo identyczne z białkiem posiadającym sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym: 3, można otrzymać, na przykład metodą taką jak mutageneza ukierunkowana lub traktowanie mutagenem. Aktywność GDH białka kodowanego przez DNA z wprowa6

PL 207 576 B1 dzoną mutacją można mierzyć, na przykład, następująco: Próbkę enzymu i glukozę, jako substrat, dodaje się do 10 mM buforu fosforanu potasu (pH 7,0) zawierającego 594 μΜ metosiarczanu metylofenazyny (mPMS) oraz 5,94 μM 2,6-dichlorofenoloindofenolu (DCIP) i inkubuje się w temperaturze 37°C. Stosując spektrofotometr, monitoruje się zmiany absorbancji DCIP przy fali o długości 600 nm a szybkość zmniejszania się absorbancji jest miarą szybkości reakcji enzymatycznej.

Ponadto, sekwencję nukleotydową składającą się z nukleotydu numer 2386 i sekwencji znajdującej się za nukleotydem numer 2386 w sekwencji nukleotydowej o numerze identyfikacyjnym: 1 uważa się za kodującą podjednostkę β. Ponadto, sekwencję nukleotydową nukleotydów o numerach od 2386 do 2451 uważa się za kodującą peptyd sygnałowy podjednostki β. Oszacowana sekwencja aminokwasowa tego peptydu sygnałowego jest sekwencją aminokwasową aminokwasów o numerach 1 do 22 w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4. Peptyd sygnałowy jest peptydem koniecznym, aby białko syntetyzowane w rybosomie ulegało sekrecji przez błonę i stwierdzono, że zawiera on 15 do 30 hydrofobowych reszt aminokwasowych. Dlatego też, ponieważ ilość białek w supernatancie hodowlanym wzrasta dzięki obecności peptydu sygnałowego, jest to peptyd wydajnie działający w sposobie wytwarzania białka.

Wyjaśniono sposób otrzymywania DNA według wynalazku.

Chromosomalny DNA izoluje się z mikroorganizmu, takiego jak Burkhorderia cepacia i oczyszcza a następnie chromosomalny DNA rozszczepia się przez rozbijanie ultradźwiękami, traktowanie enzymami restrykcyjnymi lub podobnie, liguje z liniowym wektorem ekspresyjnym i przeprowadza w postać kolistą, stosując ligazę DNA lub podobnie, w celu skonstruowania rekombinowanego wektora. Otrzymany rekombinowany wektor wprowadza się do gospodarza będącego mikroorganizmem, w którym wektor ulega autonomicznej replikacji i transformanty przeszukuje się, stosując jako wskaźniki marker wektora i aktywność enzymatyczną, w celu otrzymania mikroorganizmu niosącego rekombinowany wektor, zawierający gen kodujący GDH. Oczekuje się, że rekombinowany wektor, zawarty w otrzymanym mikroorganizmie, zawiera co najmniej sekwencję nukleotydową kodującą podjednostkę α. Ponadto, jeśli sklonowany fragment posiada właściwą wielkość, jest bardzo prawdopodobne, że zawiera on również sekwencję nukleotydową kodującą podjednostkę γ.

Następnie, mikroorganizm posiadający rekombinowany wektor można hodować, rekombinowany wektor można izolować z komórek hodowanego mikroorganizmu i oczyszczać, a gen kodujący GDH można odzyskać z wektora ekspresyjnego. Na przykład, chromosomalny DNA służący jako donor genu szczególnie odzyskuje się, na przykład następująco:

Mikroorganizm będący donorem genu można hodować na wytrząsarce, na przykład, przez 1 do 3 dni a komórki zbierać przez wirowanie z otrzymanej brzeczki hodowlanej, a następnie lizować w celu przygotowania lizatu komórkowego zawierającego gen GDH. Jako metodę lizy komórki traktuje się enzymem bakteriolitycznym, takim jak lizozym i inne enzymy, takie jak proteaza oraz czynniki powierzchniowo czynne, takie jak siarczan sodowy dodecylu (SDS), stosowane w połączeniu, jeśli jest to pożądane. Można również wykorzystywać w połączeniu fizyczne metody niszczenia komórek, takie jak zamrażanie i rozmrażanie oraz traktowanie z zastosowaniem prasy francuskiej.

DNA można izolować i oczyszczać z lizatu, otrzymanego w sposób opisany powyżej, w konwencjonalny sposób, na przykład przez odpowiednią kombinację odbiałczania przez traktowanie fenolem lub traktowanie proteazą, traktowanie rybonukleazą, wytrącanie alkoholem i inne.

DNA wyizolowany i oczyszczony z mikroorganizmu można rozszczepiać, na przykład, przez rozbijanie ultradźwiękami, traktowanie enzymami restrykcyjnymi lub podobnie. Korzystnie, odpowiednie jest stosowanie enzymu restrykcyjnego typu II, który działa na specyficzną sekwencję nukleotydową. Stosowany enzym restrykcyjny może tworzyć lepkie końce trawionego końca wektora lub tępe końce trawionego końca można utworzyć stosując arbitralny enzym restrykcyjny i zligować z wektorem.

Jako wektor stosowany do klonowania odpowiedni jest fag, który może autonomicznie namnażać się w mikroorganizmie będącym gospodarzem lub plazmid, który skonstruowano dla rekombinowanego genu. Przykłady fagów obejmują, na przykład, jeśli jako mikroorganizm będący gospodarzem stosuje się Escherichia coli, lambda gt10, lambda gt11 i inne. Ponadto przykłady plazmidów obejmują, jeśli jako mikroorganizm będący gospodarzem stosuje się Escherichia coli, pBR322, pUC18, pUC118, pUC19, pUC119, pTrc99A i pBluescript, jak również SuperCosI, który jest kosmidem.

Po sklonowaniu, fragment wektora można otrzymać przez trawienie wektora enzymem restrykcyjnym stosowanym do trawienia DNA mikroorganizmu, jako donora genu kodującego GDH. Jednakże, niekoniecznie trzeba zastosować enzym restrykcyjny identyczny jak stosowano do trawienia DNA mikroorganizmu. Metoda ligacji fragmentu DNA mikroorganizmu i fragmentu DNA wektora może być

PL 207 576 B1 znaną metodą z zastosowaniem ligazy DNA. Na przykład, liguje się lepki koniec fragmentu DNA mikroorganizmu i lepki koniec fragmentu wektora a następnie tworzy się rekombinowany wektor zawierający fragment DNA mikroorganizmu i fragment DNA wektora, stosując odpowiednią ligazę DNA. Jeśli jest to pożądane, po ligacji, fragment można również wprowadzić do mikroorganizmu będącego gospodarzem z wykorzystaniem ligazy DNA występującej w mikroorganizmie w celu wytwarzania rekombinowanego wektora.

Nie ma szczególnych ograniczeń dotyczących mikroorganizmu będącego gospodarzem stosowanym do klonowania dopóki rekombinowany wektor jest stabilny i może autonomicznie namnażać się w gospodarzu a obcy gen może ulegać ekspresji w gospodarzu. Generalnie, można stosować

Escherichia coli DH5a, XL-1 BlueMR i inne.

Jako metodę wprowadzania rekombinowanego wektora do mikroorganizmu będącego gospodarzem, na przykład, jeśli mikroorganizmem będącym gospodarzem jest Escherichia coli, można stosować metodę z zastosowaniem komórek kompetentnych z wykorzystaniem traktowania wapniem, elektroporację i podobne.

To czy sklonowany fragment, tak otrzymany, koduje GDH można potwierdzić przez rozszyfrowanie sekwencji nukleotydowej fragmentu w konwencjonalny sposób.

DNA według wynalazku można otrzymać przez odzyskanie rekombinowanego wektora z transformanta, otrzymanego jak opisano powyżej.

GDH można wytwarzać przez hodowanie transformanta zawierającego DNA według wynalazku lub rekombinowany wektor zawierający DNA, w celu wytwarzania GDH jako produktu ekspresji DNA i zbieranie go z komórek lub brzeczki hodowlanej. Chociaż DNA według wynalazku może być DNA kodującym podjednostkę α, to wydajność ekspresji można zwiększyć przez dodatkową ekspresję podjednostki γ, razem z podjednostką α.

Przykłady mikroorganizmu, w którym wytwarza się GDH obejmują bakterie jelitowe, takie jak

Escherichia coli, Gram-ujemne bakterie, takie jak te z rodzaju Pseudomonas i Gluconobacter, Gramdodatnie bakterie, takie jak Bacillus subtilis, drożdże, takie jak Saccharomyces cerevisiae i grzyby nitkowate, takie jak Aspergillus niger. Jednakże, mikroorganizmu nie ogranicza się do tych mikroorganizmów, i jako gospodarza można stosować dowolny mikroorganizm, odpowiedni do wytwarzania obcych białek.

Gen GDH zawarty w wyselekcjonowanym rekombinowanym wektorze zawierającym gen GDH można bez trudu przenosić do rekombinowanego wektora, który może ulegać replikacji w mikroorganizmie przez odzyskiwanie DNA, który jest genem GDH, z rekombinowanego wektora zawierającego gen GDH dzięki zastosowaniu enzymu restrykcyjnego lub przez PCR i ligację z innym fragmentem wektora. Ponadto, mikroorganizm można bez trudu transformować tymi wektorami, na przykład metodą z zastosowaniem komórek kompetentnych w wykorzystaniem traktowania wapniem dla bakterii z rodzaju Escherichia, metodę z zastosowaniem protoplastów dla bakterii z rodzaju Bacillus, metodę KU lub KUR dla drożdży, metodę mikromanipulacji dla grzybów nitkowatych. Ponadto, powszechnie można również stosować metodę elektroporacji.

Mikroorganizm będący gospodarzem, do którego wprowadza się docelowy rekombinowany wektor można selekcjonować przez poszukiwanie mikroorganizmu, w którym jednocześnie ulega ekspresji marker oporności na lek wektora zawierającego docelowy DNA oraz aktywność GDH. Na przykład, można wyselekcjonować mikroorganizm rosnący w podłożu selektywnym, w oparciu o marker oporności na lek, i wytwarzający GDH.

Odnośnie metody hodowli transformanta, warunki hodowli można wybrać uwzględniając wymagania odżywcze i właściwości fizjologiczne gospodarza. W wielu przypadkach, prowadzi się hodowlę płynną. Z punktu widzenia przemysłu, korzystne jest prowadzenie hodowli tlenowej z mieszaniem.

Jeśli chodzi o składniki odżywcze podłoża, te zwykle stosowane do hodowli mikroorganizmów można szeroko stosować. Odnośnie źródeł węgla, można stosować dowolne związki węgla, które mogą być asymilowane, na przykład: glukozę, sacharozę, laktozę, maltozę, laktozę, melasę, kwas pirogronowy i inne. Ponadto, jako źródła azotu, można stosować dowolne związki azotu, które mogą być wykorzystywane - przykładowo pepton, ekstrakty mięsne, ekstrakt drożdżowy, hydrolizat kazeiny, alkaliczny ekstrakt mąki sojowej i inne. Ponadto, jeśli jest to pożądane, stosuje się sole kwasu fosforowego, sole kwasu węglowego, sole kwasu siarkowego, sole magnezu, wapnia, potasu, żelaza, manganu, cynku i inne, określone aminokwasy, określone witaminy i inne.

Chociaż temperatura hodowli może się odpowiednio zmieniać w zakresie, w którym bakterie rosną i wytwarzają GDH, korzystnie wynosi ona od około 20°C do 42°C. Czas hodowli różni się nieco

PL 207 576 B1 w zależ noś ci od warunków. Jednakż e, hodowlę moż na zakończyć we wł a ś ciwym czasie ocenianym jako pozwalający uzyskać maksymalny poziom GDH, a ten czas hodowli wynosi zazwyczaj od około 12 do 72 godzin. Chociaż pH podłoża może się odpowiednio zmieniać w zakresie, w którym bakterie rosną i wytwarzają GDH, korzystnie pozostaje ono w zakresie od pH około 6,0 do 9,0.

Brzeczkę hodowlaną zawierającą komórki wytwarzające GDH w hodowli można zbierać i wykorzystywać jako taką. Jednakże, jeśli GDH znajduje się w brzeczce hodowlanej, brzeczkę hodowlaną zazwyczaj rozdziela się, na roztwór zawierający GDH i komórki mikroorganizmu, stosując filtrację, wirowanie i podobne, a następnie komórki niszczy się metodą mechaniczną lub metodą enzymatyczną, taką jak z zastosowaniem lizozymu, po czym dodaje się czynnik chelatujący, taki jak EDTA i czynnik powierzchniowo czynny dla solubilizacji GDH, jeśli jest to pożądane w celu wyizolowania i zebrania GDH w postaci roztworu wodnego.

GDH można wytrącać z roztworu zawierającego GDH, otrzymanego jak opisano powyżej, na przykład przez zatężanie pod zmniejszonym ciśnieniem, zatężanie membranowe, wysalanie siarczanem amonowym, siarczanem sodowym i podobne, lub przez wytrącanie frakcyjne za pomocą hydrofilowego rozpuszczalnika organicznego, takiego jak metanol, etanol i aceton. Ponadto, wydajnym sposobem oczyszczania może być traktowanie gorącem i w punkcie izoelektrycznym. Następnie, w celu otrzymania oczyszczonej GDH, GDH można oczyszczać przez odpowiednią kombinację filtracji żelowej z zastosowaniem adsorbenta lub czynnika filtracji żelowej, chromatografii absorpcyjnej, chromatografii jonowymiennej oraz chromatografii powinowactwa.

Oczyszczony preparat enzymu można otrzymać przez izolację i oczyszczanie oparte na chromatografii kolumnowej. Chociaż oczyszczony preparat enzymu jest korzystnie oczyszczony w takim stopniu, że w elektroforezie (SDS-PAGE) powinno się uzyskiwać jeden prążek, może on zawierać podjednostkę γ.

Oczyszczony enzym, otrzymany jak opisano powyżej można przygotować w postaci proszku przez, na przykład, liofilizację, suszenie pod zmniejszonym ciśnieniem, suszenie rozpyłowe lub podobnie i rozdzielić.

Ponadto, sekwencję aminokwasową podjednostki β można również określić tak samo jak w przypadku okreś lania sekwencji aminokwasowej podjednostki α , co opisano w przykł adach i w oparciu o sekwencję moż na wyizolować DNA kodują cy podjednostkę β . Ponadto, stosują c otrzymany DNA można również wytworzyć podjednostkę β. Ponadto, można również utworzyć enzym multimeryczny stosując DNA kodujący podjednostkę α oraz DNA kodujący podjednostkę β.

<4> Sensor glukozy według wynalazku

Sensor glukozy, według wynalazku, charakteryzuje się wykorzystaniem enzymu według wynalazku (uprzednio wspomnianego enzymu multimerycznego lub enzymu peptydowego, bądź enzymu multimerycznego lub enzymu peptydowego zawierającego podjednostkę γ), transformanta według wynalazku lub mikroorganizmu według wynalazku (szczep KS1 Burkhorderia cepacia) jako elektrody enzymatycznej. Jako elektrodę można stosować elektrodę węglową, elektrodę złotą, elektrodę platynową i enzym według wynalazku immobilizuje się na tej elektrodzie. Przykłady metod immobilizacji obejmują metodę ze stosowaniem odczynników sieciujących, metodę zamykania enzymu w macierzy polimerycznej, metodę powlekania enzymu membraną dializacyjną, metody ze stosowaniem polimeru, którego sieciowanie zachodzi pod wpływem światła, polimeru przewodzącego, polimeru oksydacyjnoredukującego lub podobnych. Alternatywnie, enzym można immobilizować w polimerze lub na elektrodzie przez adsorpcję razem z mediatorem elektronicznym, którego typowymi przykładami są ferrocen i jego pochodne. Metody te można też stosować w połączeniu. Zazwyczaj, dehydrogenazę glukozową immobilizuje się na elektrodzie węglowej stosując aldehyd glutarowy, i aldehyd glutarowy blokuje się odczynnikiem posiadającym grupę aminową.

Stężenie glukozy można mierzyć następująco: w komorze o stałej temperaturze umieszcza się bufor i dodaje razem z mediatorem, utrzymuje się stałą temperaturę. Jako mediator można stosować żelazicyjanek, metosiarczan fenazyny i tym podobne. Stosuje się elektrodę, na której immobilizowano enzym według wynalazku jako elektrodę roboczą, przeciwelektrodę (np. elektrodę platynową) oraz elektrodę odniesienia (np. elektrodę Ag/AgC). Do elektrody węglowej doprowadza się stałe napięcie i, po uzyskaniu prądu ustalonego, dodaje się próbkę zawierającą glukozę a następnie mierzy się wzrost natężenia prądu. Stężenie glukozy w próbce można obliczać na podstawie krzywej kalibracyjnej, utworzonej przez zastosowanie roztworów glukozy o standardowych stężeniach.

PL 207 576 B1 <5> Zestaw do oznaczania glukozy według wynalazku

Zestaw do oznaczania sacharydów według wynalazku charakteryzuje się tym, że obejmuje enzym według wynalazku (uprzednio wspomniany enzym multimeryczny lub enzym peptydowy, bądź uprzednio wspomniany enzym multimeryczny lub enzym peptydowy zawierający podjednostkę γ). Zestaw do oznaczania glukozy według wynalazku obejmuje enzym według wynalazku w ilości wystarczającej do co najmniej jednego oznaczenia. Zazwyczaj, zestaw obejmuje, poza enzymem według wynalazku, bufor, mediator, standardowe roztwory glukozy lub podobne do utworzenia krzywej kalibracyjnej, która jest konieczna do oznaczania oraz instrukcję użycia. Enzym według wynalazku można dostarczyć w różnych postaciach, na przykład, jako liofilizowany odczynnik lub roztwór w odpowiednim roztworze do przechowywania.

Krótki opis rysunków

Fig. 1 przedstawia masę cząsteczkową enzymu według wynalazku określoną przez natywną elektroforezę PAGE.

Fig. 2 przedstawia zdjęcie żelu elektroforetycznego pokazujące masę cząsteczkową enzymu według wynalazku w oparciu o elektroforezę SDS-PAGE.

Fig. 3 przedstawia optymalną temperaturę reakcji (a) i stabilność termiczną (b) według wynalazku. Fig. 4 przedstawia optymalną temperaturę reakcji (a) i stabilność termiczną (b) enzymu peptydowego stanowiącego tylko podjednostkę α enzymu według wynalazku.

Fig. 5 przedstawia wyniki analiz spektrofotometrycznych enzymu według wynalazku przy nieobecności i obecności glukozy przed traktowaniem ciepłem (a) oraz wyniki analiz spektrofotometrycznych enzymu według wynalazku przy nieobecności i obecności glukozy po traktowaniu ciepłem (b).

Fig. 6 przedstawia odpowiedzi sensora glukozy, wykorzystującego GDH otrzymaną z transformanta, na glukozę w różnych temperaturach.

Wynalazek zostanie wyjaśniony bardziej szczegółowo w poniższych przykładach.

P r z y k ł a d 1:

Zdobycie bakterii wykazującej zdolność wytwarzania dehydrogenazy glukozowej

Mikroorganizm według wynalazku otrzymano przez zbieranie gleby w pobliżu gorących źródeł w Japonii i wyselekcjonowanie bakterii wykazującej aktywność dehydrogenazy glukozowej spośród bakterii wykorzystujących glukozę jako składnik odżywczy z gleby.

Poniżej przedstawiono wyniki badań dotyczących charakterystyki morfologicznej, charakterystyki wzrostu i charakterystyki fizjologicznej szczepu.

[Charakterystyka bakteriologiczna]
barwienie Grama	ujemne
morfologia komórki	pałeczka z biegunową wicią
ruchliwość	dodatnia
liczba fragmentów	> 5
optymalna temperatura wzrostu	45°C
oksydaza	ujemna
katalaza	dodatnia
wytwarzanie acetoiny	ujemne
wytwarzanie H2S	ujemne
wytwarzanie indolu	ujemne
kwas z glukozy	dodatni
dihydrolaza argininowa	ujemna
ureaza	ujemna
β-glukozydaza	ujemna
proteaza	ujemna
β-galaktozydaza	dodatnia
karboksylaza lizynowa	ujemna
karboksylaza ornitynowa	ujemna
redukcja azotanu	dodatnia
[Charakterystyka asymilacji]
glicerol	dodatni
erytritol	ujemny

PL 207 576 B1

D-arabinoza

L-arabinoza ryboza

D-ksyloza

L-ksyloza adonitol β-metyloksylozyd galaktoza

D-glukoza

D-fruktoza

D-mannoza

L-sorboza ramnoza dulcytol inozytol mannitol sorbitol α-metylo-D-mannozyd α-metylo-D-glukozyd

N-acetyloglukozoamina amigdalina arbutyna eskulina salicyna celobioza maltoza laktoza melibioza sacharoza trehaloza inulina melezytoza

D-rafinoza amidon glikogen ksylitol β-gentiobioza

D-turanoza

G-liksoza

D-tagatoza

D-fukoza

D-arabitol

L-arabitol kwas glukonowy kwas 2-ketoglukonowy kwas 5-ketoglukonowy kwas kaprynowy kwas adypinowy kwas jabłkowy kwas cytrynowy octan fenylu

[Charakterystyka oksydacyjna] glicerol erytritol

D-arabinoza ujemna dodatnia dodatnia dodatnia ujemna dodatni ujemny dodatnia dodatnia dodatnia dodatnia ujemna ujemna dodatnia dodatni dodatni dodatni ujemny ujemny dodatnia ujemna ujemna ujemna ujemna ujemna ujemna ujemna ujemna ujemna dodatnia ujemna ujemna ujemna ujemny ujemny dodatni ujemna ujemna ujemna ujemna ujemna dodatni dodatni dodatni dodatni ujemny dodatni dodatni dodatni dodatni dodatni ujemny ujemny ujemna

PL 207 576 B1

L-arabinoza ryboza

D-ksyloza

L-ksyloza adonitol β-metyloksylozyd galaktoza

D-glukoza

D-fruktoza

D-mannoza

L-sorboza ramnoza dulcytol inozytol mannitol sorbitol α-metylo-D-mannozyd α-metylo-D-glukozyd

N-acetyloglukozoamina amigdalina arbutyna eskulina salicyna celobioza maltoza laktoza melibioza sacharoza trehaloza inulina melezytoza

D-rafinoza amidon glikogen ksylitol β-gentiobioza

D-turanoza

G-liksoza

D-tagatoza

D-fukoza

D-arabitol

L-arabitol kwas glukonowy kwas 2-ketoglukonowy kwas 5-ketoglukonowy dodatnia dodatnia dodatnia ujemna dodatni ujemny dodatnia dodatnia dodatnia dodatnia ujemna ujemna dodatni dodatni dodatni dodatni ujemny ujemny ujemna ujemna ujemna dodatnia ujemna dodatnia dodatnia dodatnia ujemna ujemna dodatnia ujemna ujemna ujemna ujemny ujemny ujemny dodatnia ujemna ujemna ujemna dodatnia dodatni dodatni ujemny ujemny ujemny

Pozycję taksonomiczną szczepu KS1 posiadającego wyżej przedstawione właściwości bakteriologiczne ustalono w odniesieniu do Bergey's Manual of Determinative Bacteriology i szczep identyfikowano jako należący do rodzaju Burkhorderia, i jest on szczepem Burkhorderia cepacia.

Rodzaj Burkhorderia zwyczajowo klasyfikowano do rodzaju Pseudomonas, ale obecnie klasyfikuje się go oddzielnie do rodzaju Burkhorderia (Yabuuchi, E., Kosako, Y., Oyaizu, H., Yano, I., Hotta, H., Hashimoto, Y., Ezaki, T. i Arakawa, M., Microbiol. Immunol. tom 36 (12): 1251-1275 (1992); International Journal of Systematic bacteriology, Apr., 1993, str. 398-399).

Ponadto, twórcy wynalazku otrzymali kilka szczepów Burkhorderia cepacia, innych niż szczep KS1 Burkhorderia cepacia, które zdeponowali w Institute for Fermentation, Osaka lub w Japan Collec12

PL 207 576 B1 tion of Microorganisms (JCM), Institute of Physical and Chemical Research, i mierzyli aktywność dehydrogenazy glukozowej tych szczepów oraz potwierdzili, że wykazują one taką aktywność.

Aktywność dehydrogenazy glukozowej mierzono metodą opisaną w przykładzie 2. Względne aktywności tych szczepów, w odniesieniu do aktywności enzymatycznej frakcji rozpuszczalnej w wodzie szczepu KS1, którą przyjęto jako 100, przedstawiono w tablicy 1.

T a b l i c a 1

Szczep bakteryjny		Aktywność dehydrogenazy glukozowej
70°C	45°C
KS1	frakcja rozpuszczalna w wodzie	100	100
JCM5506	frakcja rozpuszczalna w wodzie	100	100
	frakcja membranowa	100	100
JCM5507	frakcja rozpuszczalna w wodzie	100	100
	frakcja membranowa	100	100
JCM2800	frakcja rozpuszczalna w wodzie	100	100
JCM2801	frakcja rozpuszczalna w wodzie	100	100
IFO15124	frakcja rozpuszczalna w wodzie	100	100
IFO14595	frakcja rozpuszczalna w wodzie	100	100

P r z y k ł a d 2

Ekstrakcja dehydrogenazy glukozowej <1> Hodowla komórek

Jako warunki hodowli bakterii, zastosowano zwykłe warunki hodowli tlenowej. Komórki hodowano w temperaturze 34°C w ciągu 8 godzin w 7 litrach podłoża, zawierającego następujące składniki na litr.

polipepton	10 g
ekstrakt drożdżowy	1 g
NaCl	5 g
KH2PO4	2 g
glukoza	5 g
Einol (ABLE Co., Tokio, Japonia)	0,14 g
całkowita objętość włącznie z wodą destylowaną 1 litr
doprowadzone	pH 7,2
Brzeczkę hodowlaną o objętości 7 litrów wirowano przy 9000 x g, w temperaturze 4°C w ciągu

minut, otrzymując około 60 g komórek.

<2> Przygotowanie wstępnie oczyszczonej frakcji

Komórki, w ilości 60 g, zawieszono w 10 mM buforze fosforanu potasu (pH 6,0) i komórki poddano działaniu ciśnienia różnicowego wynoszącego 1500 Kg/cm² stosując prasę francuską (Otake Corporation, Tokio, Japonia) w celu zniszczenia błon komórkowych. Ekstrakt komórkowy wirowano przy 8000x g w ciągu 10 minut w celu usunięcia stałych pozostałości komórkowych. Następnie, supernatant poddawano ultrawirowaniu przy 69800 x g, w temperaturze 4°C w ciągu 90 minut, otrzymując około 8 g frakcji błonowej w postaci precypitatu.

<3> Oczyszczanie enzymu

Frakcję błonową ponownie zawieszono w 10 mM buforze fosforanu potasu (pH 6,0), zawierającym 1% Triton X-100, jako stężenie końcowe. Następnie zawiesinę wolno mieszano przez noc, w temperaturze 4°C. Po poddaniu zawiesiny ultrawirowaniu (69800 X g, 4°C, 90 minut), frakcję zsolubilizowanych błon ponownie wirowano w temperaturze 4°C, w ciągu 15 minut, przy 15000 x g dla otrzymania supernatantu.

Do zsolubilizowanej frakcji błonowej dodano taką samą objętość 10 mM buforu fosforanu potasu (pH 8,0), zawierającego 0,2% Triton X-100. Roztwór dializowano, a następnie nanoszono na kolumnę DEAE-TOYOPEARL (22 mm średnicy x 20 cm, Tosoh Coporation, Tokio, Japonia), równoważoną 10 mM buforem fosforanu potasu (pH 8,0), zawierającym 0,2% Triton X-100. Białka eluowano,

PL 207 576 B1 stosując gradient liniowy od 0 do 0,15 M NaCl w 10 mM buforze fosforanu potasu (pH 8,0). Szybkość przepływu wynosiła 5 ml/minutę. GDH ulegała elucji przy stężeniu NaCl wynoszącym w przybliżeniu 75 mM. Frakcje wykazujące aktywność GDH zbierano i dializowano przez noc wobec 10 mM buforu fosforanu potasu (pH 8,0; 4°C), zawierającego 0,2% Triton X-100.

Dalej, roztwór dializowanego enzymu nanoszono na kolumnę DEAE-5PW (8,0 mm średnicy x 7,5 cm, Tosoh Corporation, Tokio, Japonia. Kolumnę tą równoważono wcześniej 10 mM buforem fosforanu potasu (pH 6,0), zawierającym 0,2% Triton X-100. Białka eluowano, stosując gradient liniowy od 0 do 100 mM NaCl w 10 mM buforze fosforanu potasu (pH 8,0). Szybkość przepł ywu wynosiła 1 ml/minutę. Frakcje wykazujące aktywność GDH ulegał y elucji przy stężeniu NaCl wynoszą cym w przybliżeniu 20 mM. Frakcje wykazujące aktywność GDH zbierano i odsalano przez noc wobec 10 mM buforu fosforanu potasu (pH 8,0; 4°C), zawierającego 0,2% Triton X-100, w celu otrzymania oczyszczonego enzymu.

W tym i następnych przykł adach, aktywność GDH mierzono zgodnie z poniż ej podaną metodą .

Jako akceptory elektronów stosowano 2,6-dichlorofenoloindofenol (DCIP) i metosiarczan fenazyny (PMS). Reakcję przeprowadzano w rurce polietylenowej we wcześniej ustalonej temperaturze.

Roztwór enzymu o objętości 5 μΐ dodawano do 20 μΐ 25 mM buforu Tris-HCl (pH 8,0), zawierającego 0,75 mM PMS i 0,75 mM DCIP. Mieszaninę pozostawiano uprzednio na 1 minutę w stałej temperaturze. Reakcję rozpoczynano przez dodanie 1 μ!,1 2 M glukozy (stężenie końcowe: 77 mM) i pozostawiano w stałej temperaturze na 2 minuty. Następnie, w celu schłodzenia próbki dodawano 100 μl chłodzonej lodem wody destylowanej lub 120 μl 7,5 M mocznika. Reakcję redukcji akceptorów elektronów spowodowaną dehydrogenacją glukozy monitorowano stosując ultra-mikro komorę pomiarową (100 μθ i spektrofotometr (UV160, Shimadzu Corporation, Kyoto, Japonia, który umożliwia pomiar z zastosowaniem komory. To jest, mierzy się przy 600 nm, co jest długością fali absorpcji DCIP, odbarwianie w czasie, które jest spowodowane redukcją DCIP. Stosowano molowy współczynnik absorpcji DCIP (22, 23 mM X cm^-1). Jedną jednostkę (U) enzymu zdefiniowano jako ilość utleniającą 1 μM glukozy na minutę w standardowych warunkach testowych. Stężenie białka mierzono metodą Lowry'ego.

P r z y k ł a d 3

Natywną elektroforezę PAGE przeprowadzano dla oczyszczonego enzymu. Elektroforezę przeprowadzano w gradiencie od 8 do 25% żelu poliakryloamidowego, stosując układ buforowy Tris-alanina zawierający 1% Triton X-100. Żel wybarwiano azotanem srebra. Jako markery białkowe stosowano tyroglobulinę (669 kDa), ferrytynę (440 kDa), katalazę (232 kDa), aldolazę (158 kDa), albuminę surowicy bydlęcej (67 kDa), albuminę jaja kurzego (43 kDa) i chymotrypsynogen A (25 kDa).

Następnie, wybarwianie aktywności przeprowadzano dla natywnego żelu PAGE, inkubując żel w następującym roztworze w ciągu 30 minut. W miejscach aktywności GDH, błękit nitrotetrazoliowy ulegał redukcji i powstawał formazan, co powodowało powstawanie barwy ciemnopurpurowej.

200 mM glukozy

0,1 mM błękitu nitrotetrazoliowego

0,3 mM metosiarczanu fenazyny mM buforu Tris-HCl (pH 8,0)

Na podstawie wyników barwienia srebrem w natywnej PAGE, oceniono, że enzym składał się z jednego rodzaju enzymu i posiadał masę cząsteczkową wynoszącą około 400 kDa. Następnie, żel wybarwiano pod kątem aktywności; aktywność obserwowano w miejscach o tej samej ruchliwości co w barwieniu srebrem (fig. 1, Ścieżka 1 przedstawia wyniki barwienia srebrem markerów białkowych o standardowych masach cząsteczkowych. Ścieżka 2 przedstawia barwienie srebrem enzymu, a Ścieżka 4 przedstawia barwienie aktywności enzymu). Po ogrzewaniu enzymu w temperaturze 70°C w ciągu 30 minut, nieoczekiwanie stwierdzono, że aktywność się zachowała, wyizolowano białka enzymu, z których jedno wykazywało aktywność i posiadało masę cząsteczkową wynoszącą około 85 kDa (patrz fig. 1, Ścieżka 3 przedstawia wyniki barwienia srebrem enzymu ogrzewanego w temperaturze 70°C w ciągu 30 minut, a Ścieżka 5 przedstawia wyniki barwienia aktywności enzymu ogrzewanego w temperaturze 70°C w ciągu 30 minut). Wyniki te sugerują, że enzym składa się z podjednostek.

P r z y k ł a d 4

Roztwór oczyszczonego enzymu poddawano SDS-PAGE. SDS-PAGE przeprowadzano w gradiencie żelu poliakryloamidowego od 8 do 25%, stosując bufor Tris-trycynowy. Białka w żelu wybarwiano azotanem srebra. Rozdział i rozwijanie przeprowadzano automatycznie stosując Phast System (Pharmacia). Masę cząsteczkową określano, opierając się na względnej migracji białek standardowych. Stosując SDS-PAGE, rozdzielono białka enzymu o masach cząsteczkowych około 60 kDa i 43 kDa. (fig. 2).

PL 207 576 B1

Fig. 2 jest zdjęciem żelu elektroforetycznego. Na tej figurze, Ścieżka 1 przedstawia wyniki barwienia azotanem srebra markerów białkowych posiadających standardowe masy cząsteczkowe, a Ścieżka 2 przedstawia wyniki barwienia azotanem srebra enzymu). A zatem, sugeruje to, że podjednostka a o masie cząsteczkowej 60 kDa i podjednostka β o masie cząsteczkowej 43 kDa łączą się w enzym, i przypuszcza się, że cztery każdej z tych podjednostek tworzą oktamer, łącząc się wzajemnie ze sobą.

Podjednostkę β, białko o masie cząsteczkowej 43 kDa oddzielone przez SDA-PAGE, przeniesiono na membranę z polifluorku winylidenu, a następnie określono sekwencję aminokwasową końca N podjednostki β, stosując sekwenator aminokwasowy (PPSQ-10, Shimadzu Corporation). W wyniku stwierdzono, że sekwencja aminokwasową końca N białka składa się z 16 reszt sekwencji aminokwasowej o numerze identyfikacyjnym: 5.

Ponadto, wyniki otrzymane dla enzymu poddawanego traktowaniu przez ogrzewanie w temperaturze 70°C w ciągu 30 minut przedstawiono jako Ścieżkę 3 na fig. 2. Na podstawie wyników otrzymanych w SDS-PAGE, można przypuszczać, że enzym zmienił się po traktowaniu przez ogrzewanie w jednołańcuchowy polipeptyd o masie cząsteczkowej 60 kDa.

P r z y k ł a d 5

Enzym poddano chromatografii żelowej. Jako żel zastosowano żel TSK G3000SW (Tosoh Corporation), a kolumnę żelową (8,0 mm średnicy x 30 cm, Tosoh Corporation, Tokio, Japonia) równoważono roztworem zawierającym 0,3 M NaCl i 0,1% Triton X-100 w 10 mM buforze fosforanu potasu (pH 6,0).

Zbierano frakcje (125 μΐ). Do określania masy cząsteczkowej oczyszczonego enzymu stosowano 7 rodzajów markerów białkowych. Jako markery białkowe stosowano: tyroglobulinę (669 kDa), ferrytynę (440 kDa), katalazę (232 kDa), aldolazę (158 kDa), albuminę surowicy bydlęcej (67 kDa), albuminę jaja kurzego (43 kDa) i chymotrypsynogen A (25 kDa).

Potwierdzono, że masa cząsteczkowa enzymu wynosiła około 380 kDa.

P r z y k ł a d 6

Sprawdzano optymalną temperaturę oczyszczonego enzymu.

Enzym inkubowano najpierw w buforze Tris-HCl (pH 8,0) we wcześniej określonej temperaturze w ciągu 1 minuty, a następnie rozpoczynano reakcję. Aktywność mierzono we wcześniej określonej temperaturze reakcji. Optymalną temperaturę obserwowano około 45°C (Fig. 3 (a)). Ponadto, pik obserwowano również około temperatury 75°C, chociaż aktywność była niższa niż aktywność w temperaturze około 45°C.

Ponadto, w celu sprawdzenia stabilności termicznej enzymu, enzym pozostawiono w każdej stałej z tych temperatur na 30 minut i mierzono pozostałą aktywność enzymatyczną w temperaturze 45°C (fig. 3 (b)).

P r z y k ł a d 7

Sprawdzano temperaturę optymalną i stabilność termiczną enzymu peptydowego składającego się z pojedynczego oligopeptydu o masie cząsteczkowej 60 kDa, otrzymanego przez ogrzewanie enzymu w temperaturze 70°C w ciągu 30 minut.

Ten enzym peptydowy wykazywał temperaturę optymalną wyższą niż nieogrzewany enzym, jak również lepszą stabilność termiczną. Nie było dotąd doniesień o enzymie wykazującym takie zależności temperaturowe.

Enzym inkubowano najpierw w buforze Tris-HCl (pH 8,0) we wcześniej określonej temperaturze w ciągu 1 minuty, a następnie rozpoczynano reakcję. Aktywność mierzono we wcześniej określonej temperaturze reakcji. Optymalną temperaturę obserwowano około 75°C (fig. 4 (a)).

Ponadto, w celu sprawdzenia stabilności termicznej enzymu, enzym pozostawiono w każdej stałej z tych temperatur na 30 minut i mierzono pozostałą aktywność enzymatyczną w temperaturze 70°C (Fig. 4 (b)).

P r z y k ł a d 8

W celu zbadania roli każdej podjednostki, przeprowadzano analizę spektrofotometryczną GDH przed i po traktowaniu przez ogrzewanie. Fig. 5 (a) i (b) przedstawiają absorpcję utlenionych i zredukowanych GDH przed i po traktowaniu przez ogrzewanie (w obecności glukozy). Absorpcja przy różnych długościach fali, utlenionej GDH przed traktowaniem przez ogrzewanie, która była oryginalną GDH, wykazywała charakterystyczny pik przy fali o długości 409 nm. Ponadto, pik przesuwał się do fali o długości 417 nm w obecności glukozy i obserwowano dwa dodatkowe piki przy fali o długości 523 nm i 550 nm (fig. 5 (a)). W przeciwieństwie, GDH po traktowaniu przez ogrzewanie nie wykazywała nadal charakterystycznego piku przy fali o długości 409 nm (fig. 5 (b)) i nie obserwowano znaczących różnic pomiędzy utlenioną a zredukowaną GDH.

PL 207 576 B1

Absorpcja przy różnych długościach fali, utlenionej GDH przed traktowaniem przez ogrzewanie, która była oryginalną GDH, była podobna do absorpcji dehydrogenazy alkoholowej lub dehydrogenazy aldehydowej składających się na kompleks dehydrogenaza-cytochrom Gluconobacter sp. lub Acetobacter sp. (Adachi, O., Tayama, K., Shinagawa, E., Matsushita, K. i Ameyama, M., Agr. Biol. Chem., 42, 2045-2056 (1978); Adachi, O., Miyagawa, E., Matsushita, K. i Ameyama, M., Agr. Biol. Chem., 42, 2331-2340 (1978); Ameyama, M. i Adachi, O., Methods Enzymol., 89, 450-457 (1982); Adachi, O., Tayama, K., Shinagawa, E., Matsushita, K. i Ameyama, M., Agr. Biol. Chem., 44, 503-515 (1980); Ameyama, M. i Adachi, O., Methods Enzymol., 89, 491-497, (1982)).

Wyniki wskazują na możliwość, że kompleks oligomeryczny GDH zawiera cytochrom. Dlatego też uważa się, że obserwowane długości fal, podobne do tych dla cytochromu C, można przypisać podjednostce β; zanikły one podczas traktowania przez ogrzewanie, a więc podjednostka β składa się z cytochromu C.

P r z y k ł a d 9

Prążek zawierający podjednostkę β, otrzymany przez elektroforezę w przykładzie 4, wycięto i analizowano sekwencję aminokwasową, stosując sekwenator peptydowy (PPSQ-10, Shimadzu Corporation). W wyniku, można było otrzymać sekwencję aminokwasową końca N, składającą się z 16 reszt przedstawionych w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 5.

Podjęto próbę zamplifikowania przez PCR regionu genu, kodującego wyżej wspomnianą sekwencję aminokwasową końca N składającą się z 16 reszt, opierając się na sekwencji peptydu. To jest, zaprojektowano dwa startery PCR posiadające sekwencję nukleotydową, od strony przed genem (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 6), odpowiadającą 5 resztom końca N i, po przeciwnej stronie (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 7), odpowiadającą nici antysensownej 5 reszt końca C w łańcuchu peptydowym składającym się z 16 reszt. Przeprowadzając PCR w konwencjonalny sposób dla genomu szczepu KS1, z wykorzystaniem pary starterów PCR, zamplifikowano fragment genu o wielkości około 50 bp. W wyniku określania, w konwencjonalny sposób, sekwencji nukleotydowej tego fragmentu genu rozpoznano 58 nukleotydów, obejmujących parę starterów PCR. Wśród tych nukleotydów, zanalizowano 18 nukleotydów z wyłączeniem starterów PCR, i stwierdzono sekwencję genu odpowiadającą regionowi od Pro, która była szóstą resztą od końca N wyżej wspomnianego końca N podjednostki β o długości 16 reszt, do Arg, która była jedenastą resztą (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 8). A zatem, stwierdzono, że zamplifikowany fragment genu obejmował fragment genu podjednostki β.

Stwierdzono również, że w podjednostce β znajdują się 22 reszty aminokwasowe za podjednostką α. Oparto to na stwierdzeniu, że skoro sekwencja aminokwasową końca N oczyszczonej podjednostki β, określona w przykładzie 4, odpowiada pięciu resztom aminokwasowym otrzymanym w wyniku translacji sekwencji nukleotydowej nukleotydów o numerach od 2452 do 2466 w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 1, to sekwencje te są identyczne.

Ponadto, zakłada się, że sekwencja nukleotydowa nukleotydów o numerach od 2386 do 2451 w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 1 jest sekwencją dla peptydu sygnałowego podjednostki β. Sekwencja aminokwasowa kodowana przez tę sekwencję nukleotydową odpowiada aminokwasom o numerach od 1 do 22 w sekwencji aminokwasowej o numerze identyfikacyjnym: 4.

P r z y k ł a d 10

Do 50 mM buforu fosforanu potasu (pH 7,5), zawierającego 0,1% Triton X-100 i 1 mM CaCl2, dodawano oczyszczony enzym i dostępny komercyjnie koenzym NAD GDH (w skrócie „NAD-GDH), w stężeniu 100 U/litr każdy i mieszano. Każdy roztwór umieszczano w gorącym zbiorniku w temperaturze 60°C i mierzono pozostałą aktywność.

T a b l i c a 2:

Pozostała aktywność względna (%)

Czas (minuty)	NAD-GDH	Enzym GDH
0	100	100
15	20	100
30	5	100

PL 207 576 B1

Potwierdzono, że enzym wykazywał zaskakującą stabilność termiczną w porównaniu z aktualnie komercyjnie dostępnym enzymem GDH. Stwierdzono, że enzym był nowym enzymem, który jest całkowicie inny od komercyjnie dostępnego NAD-GDH.

P r z y k ł a d 11:

Izolacja genu kodującego podjednostkę α GDH <1> Przygotowanie chromosomalnego DNA ze szczepu KS1 Burkhorderia cepacia

Chromosomalny gen wyizolowano ze szczepu KS1 Burkhorderia cepacia metodą konwencjonalną. Szczep bakteryjny wytrząsano przez noc w temperaturze 34°C stosując podłoże płynne TL (10 g polipeptonu, 1 g ekstraktu drożdżowego, 5 g NaCl, 2 g KH2PO4, 5 g glukozy w 1 litrze, pH 7,2). Namnożone komórki zbierano stosując wirówkę. Komórki zawieszano w roztworze zawierającym 10 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,5% SDS i 100 μg/ml proteinazy K i traktowano w temperaturze 50°C w ciągu 6 godzin. Do tej mieszaniny dodano równoważną objętość mieszaniny fenol-chloroform i mieszano w temperaturze pokojowej w ciągu 10 minut a następnie zbierano supernatant stosując wirówkę. Do supernatantu dodano octan sodowy w stężeniu końcowym 0,3 M i nawarstwiono na niego dwie objętości etanolu w celu wytrącenia chromosomalnego DNA w warstwie pośredniej. DNA zebrano szklaną bagietką, przemyto 70% etanolem i rozpuszczono w odpowiedniej ilości buforu TE w celu otrzymania roztworu chromosomalnego DNA.

<2> Określanie sekwencji aminokwasowej końca N podjednostki α GDH.

GDH oczyszczoną tak jak w przykładzie 2 zatężono przez liofilizację i rozdzielono przez elektroforezę z SDS stosując 12,5% poliakryloamid w celu wyizolowania podjednostki α. Otrzymaną podjednostkę α przeniesiono na membranę z polifluorku winylidenu, a następnie określano sekwencję aminokwasową końca N, stosując sekwenator aminokwasowy (PPSQ-10, Shimadzu Corporation). W wyniku, stwierdzono, że enzym obejmował sekwencję peptydu składającego się z 11 reszt aminokwasów o numerach od 2 do 12 w sekwencji aminokwasowej o numerze identyfikacyjnym: 3.

<3> Klonowanie genu kodującego podjednostkę α μq DNA przygotowanego zgodnie z procedurą opisaną w <1> poddano częściowemu trawieniu enzymem restrykcyjnym Sau3AI i traktowano cielęcą jelitową fosfatazą alkaliczną (CIAP). Oddzielnie, SuperCosI (otrzymany ze STRATAGENE), który jest kosmidem, traktowano BamHI i fragment DNA otrzymany przez częściowe trawienie Sau3AI fragmentu chromosomalnego DNA pochodzącego ze szczepu α-15 włączono do SuperCosI, stosując ligazę DNA T4. Escherichia coli XL-1 Blue MR (otrzymany ze STRATAGENE) stransformowano uzyskanym rekombinowanym DNA. Transformanty selekcjonowano na podłożu agarowym LB zawierającym 10 μg/ml neomycyny i 25 μg/ml ampicyliny, na podstawie oporności na neomycynę i ampicylinę, które są markerami oporności na antybiotyki SuperCosI. Otrzymane transformanty hodowano w płynnym podłożu LB. Transformanty te zbierano i zawieszano w odczynniku do pomiaru aktywności GDH, i izolowano klony stosując jako wskaźnik aktywność dehydrogenazy wobec glukozy. W wyniku, otrzymano jeden klon szczepu wykazujący aktywność dehydrogenazy glukozowej.

<4> Subklonowanie

Fragmenty DNA zawierające docelowy gen wyizolowano z kosmidu SuperCosI obejmującego gen kodujący podjednostkę α otrzymaną w <3>. Wstawione fragmenty genu wycięto z kosmidu, stosując enzym restrykcyjny Notl. Te fragmenty DNA traktowano enzymem restrykcyjnym Xbal i wstawiono do plazmidu pUC18, strawionego Xbal. Szczep DH5aMCR Escherichia coli transformowano plazmidem pUC18, zawierającym każdy wstawiony fragment i zbierano kolonie, które wyrosły na podłożu agarowym LB, zawierającym 50 μg/ml ampicyliny. Otrzymane transformanty hodowano w płynnym podłożu LB i sprawdzano pod względem aktywności GDH w komórkach, tak jak w <3>. W wyniku, z jednego transformanta uzyskano szczep wykazujący aktywność GDH. Plazmid wyekstrahowano z tego transformanta i analizowano fragment wstawionego DNA. W wyniku, potwierdzono obecność wstawionego fragmentu o wielkości około 8,8 kbp. Plazmid ten oznaczono pKS1.

<5> Określanie sekwencji nukleotydowej

Sekwencję nukleotydową wstawionego fragmentu DNA w pKS1 określano przez analizę enzymami restrykcyjnymi i metodą konwencjonalną. W wyniku, w tym fragmencie DNA potwierdzono obecność sekwencji DNA kodującej koniec N sekwencji aminokwasowej podjednostki α otrzymanej w <2> i stwierdzono otwartą ramkę odczytu zawierającą tę sekwencję. Określoną sekwencję nukleotydową oraz sekwencję aminokwasową, która może być kodowana przez tę sekwencję nukleotydową przedstawiono w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 1 i 3. Masa cząsteczkowa białka

PL 207 576 B1 otrzymanego z sekwencji aminokwasowej wynosiła 59,831 Da i zasadniczo pasowała do masy cząsteczkowej 60 kDa otrzymanej przez SDS-PAGE podjednostki a szczepu KS1 Burkhorderia cepacia.

Ponieważ sekwencja nukleotydowa podjednostki α była określona, utworzono wektor wykorzystując gen strukturalny podjednostki α a następnie utworzono transformanty z tym wektorem.

Najpierw przygotowano gen, który miał być wstawiony do wektora.

Przeprowadzono amplifikację przez PCR stosując fragment genomu pochodzący ze szczepu KS1 jako matrycę tak, że powinno być włączone pożądane miejsce restrykcyjne. W PCR zastosowano następującą parę starterów oligonukleotydowych.

(starter „forward)

5'-CCCAAGCTTGGGCCGATACCGATACGCA-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 9) (starter „ reverse)

5'- GAGAAGCTTTCCGCACGGTCAGACTTCC-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 10)

Gen zamplifikowany przez PCR trawiono enzymem restrykcyjnym Hindlll i wstawiono do wektora ekspresyjnego pFLAG-CTS (SIGMA) w jego miejscu do klonowania, miejscu Hindlll. Otrzymany plazmid oznaczono jako pFLAG-CTS/α.

Szczep DH5aMCR Escherichia coli stransformowano plazmidem pFLAG-CTS/α i zbierano kolonie, które wyrosły na podłożu agarowym LB, zawierającym 50 μg/ml ampicyliny.

Następnie, kiedy poszukiwano otwartej ramki odczytu wstawionego fragmentu pKS1 przed podjednostką α, znaleziono gen strukturalny o długości 507 nukleotydów, kodujący polipeptyd zawierający 168 reszt aminokwasowych przedstawionych w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 (nukleotydy o numerach od 258 do 761 w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 1). Uważa się, że ten gen strukturalny koduje podjednostkę γ.

Ponieważ stwierdzono, że region kodujący podjednostkę γ znajduje się przed regionem kodującym podjednostkę α, utworzono rekombinowany wektor zawierający gen, posiadający policistronową strukturę, obejmujący w sposób ciągły podjednostkę γ i podjednostkę α i skonstruowano transformanta z wprowadzonym tym wektorem.

Najpierw, przygotowano gen, który miał być wprowadzony do wektora.

Przeprowadzono amplifikację przez PCR, wykorzystując jako matrycę fragment genomu szczepu KS1 zawierający ciągły gen strukturalny podjednostki γ i gen strukturalny podjednostki α, tak że powinno być włączone pożądane miejsce restrykcyjne. W PCR zastosowano następującą parę starterów oligonukleotydowych.

(starter „forward)

5'-CATGCCATGGCACACAACGACAACACT-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 11) (starter „ reverse)

5'-CCCAAGCTTGGGTCAGACTTCCTTCTTCAGC-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 12)

Koniec 5' i koniec 3' zamplifikowanego przez PCR genu trawiono, odpowiednio, Ncol i Hindlll i gen wstawiono do wektora pTrc99A (Pharmacia) w jego miejscu do klonowania, miejscu Ncol/Hindlll. Otrzymany plazmid oznaczono pTrc99A/y+a.

Szczep DH5aMCR Escherichia coli stransformowano plazmidem pTrc99A/Y+a i zbierano kolonie, które wyrosły na podłożu agarowym LB, zawierającym 50 μg/ml ampicyliny.

P r z y k ł a d 12

Wytwarzanie podjednostki α GDH przez rekombinowaną Escherichia coli.

Podjednostkę α wytwarzano stosując szczep DH5aMCR Escherichia coli stransformowany każdym z wymienionych plazmidów pKS1, pFLAG-CTS/α i pTrc99A/Y+a. Każdym transformantem zaszczepiono 3 ml podłoża LB zawierającego 50 μg/ml ampicyliny i prowadzono hodowlę w temperaturze 37°C w ciągu 12 godzin, a następnie zbierano komórki wykorzystując wirówkę. Komórki niszczono stosując prasę francuską (1500 kgf) i izolowano frakcję błonową (10 mM bufor fosforanu potasu, pH 6,0) przez ultrawirowanie (160400 x g, 4°C, 90 minut).

P r z y k ł a d 13

Oznaczenie glukozy

Najpierw, potwierdzano aktywność GDH każdej z frakcji błonowych. Przeprowadzono ocenę wizualną stosując 10 mM bufor fosforanu potasu (pH 7,0) zawierający 594 μM metosiarczanu metylofenazyny (mPMS) i 5,94 μM 2,6-dichlorofenoloindofenolu (DCIP). Wyniki przedstawiono poniżej. Liczba + reprezentuje stopień zmiany koloru z niebieskiego na bezbarwny.

Frakcja błonowa hodowanego transformanta + stransformowanego pFLAG-CTS/α:

Frakcja błonowa hodowanego transformanta ++ stransformowanego pKS1:

PL 207 576 B1

Frakcja błonowa hodowanego transformanta +++ stransformowanego pTrc99A/y+a:

Aktywność GDH frakcji błonowej hodowanego transformanta stransformowanego pFLAG-CTS/α, który posiadał włączoną tylko podjednostkę α była najniższa, a aktywność GDH frakcji błonowej hodowanego transformanta transformowanego pTrc99A//+a była najwyższa.

Chociaż podjednostka α ulegała ekspresji nawet w transformantach stransformowanych wektorem posiadającym tylko gen strukturalny podjednostki α, podjednostkę α można wydajnie otrzymywać stosując wektor zawierający, w połączeniu, gen strukturalny podjednostki γ i gen strukturalny podjednostki α.

Glukozę oznaczano wykorzystując dehydrogenazę glukozową według wynalazku. Aktywność enzymatyczną dehydrogenazy glukozowej (podjednostki α) według wynalazku mierzono stosując glukozę w różnych stężeniach. Aktywność GDH mierzono w 10 mM buforze fosforanu potasu (pH 7,0), zawierającym 594 μM metosiarczanu metylofenazyny (mPMS) i 5,94 μM 2,6-dichlorofenoloindofenolu (DCIP). Dodawano próbkę enzymu oraz glukozę, jako substrat, i inkubowano w temperaturze 37°C; zmiany absorbancji DCIP przy fali o długości 600 nm monitorowano stosując spektrofotometr. Szybkość reakcji enzymatycznej mierzono jako szybkość zmniejszania się absorbancji. Stosując GDH według wynalazku można było określać glukozę ilościowo w zakresie od 0,01 do 1,0 mM.

P r z y k ł a d 14

Przygotowywanie i ocena sensora glukozy

Do dehydrogenazy glukozowej (25 jednostek) według wynalazku, otrzymanej w przykładzie 2, dodano 20 mg pasty węglowej i liofilizowano. Odpowiednio mieszano, nakładano tylko na powierzchnię elektrody węglowej wypełnioną już około 40 mg pasty węglowej i wygładzano bibułą filtracyjną. Elektrodę tę traktowano 10 mM buforem MOPS (pH 7,0), zawierającym 1% aldehyd glutarowy w temperaturze pokojowej w ciągu 30 minut, a następnie traktowano 10 mM buforem MOPS (pH 7,0), zawierającym 20 mM lizyny w temperaturze pokojowej w ciągu 20 minut w celu zablokowania aldehydu glutarowego. Elektrodę tę równoważono w 10 mM buforze MOPS (pH 7,0) w temperaturze pokojowej w ciągu 1 godziny lub dłużej. Elektrodę przechowywano w temperaturze 4°C.

Stosując wymienioną elektrodę jako elektrodę roboczą, elektrodę Ag/AgCl jako elektrodę odniesienia oraz elektrodę Pt jako przeciwelektrodę, po dodaniu glukozy mierzono wartość bieżącej odpowiedzi. Jako roztwór reakcyjny wykorzystywano 10 mM bufor fosforanu potasu zawierający 1 mM metoksy-PMS, a do pomiaru stosowano napięcie 100 mV.

Stężenie glukozy mierzono stosując otrzymany sensor enzymatyczny. Stosując sensor enzymatyczny, na którym immobilizowano dehydrogenazę glukozową według wynalazku (fig. 6) można określać ilościowo glukozę w zakresie od 0,05 do 5,0 mM.

P r z y k ł a d 15

Przygotowywanie i ocena sensora glukozy przez GDH otrzymaną z transformanta

Do 10 U podjednostki α (249 U/mg białka) według wynalazku, otrzymanej w przykładzie 12, dodano 50 mg pasty węglowej i liofilizowano. Odpowiednio mieszano, nakładano tylko na powierzchnię elektrody węglowej wypełnioną już około 40 mg pasty węglowej i wygładzano bibułą filtracyjną. Elektrodę tę traktowano 10 mM buforem MOPS (pH 7,0), zawierającym 1% aldehyd glutarowy w temperaturze pokojowej w ciągu 30 minut, a następnie traktowano 10 mM buforem MOPS (pH 7,0), zawierającym 20 mM lizyny w temperaturze pokojowej w ciągu 20 minut w celu zablokowania aldehydu glutarowego. Elektrodę tę równoważono w 10 mM buforze MOPS (pH 7,0) w temperaturze pokojowej w ciągu 1 godziny lub dłużej. Elektrodę przechowywano w temperaturze 4°C.

Stosując wyżej wymienioną elektrodę jako elektrodę roboczą, elektrodę Ag/AgCl jako elektrodę odniesienia oraz elektrodę Pt jako przeciwelektrodę, po dodaniu glukozy mierzono wartość bieżącej odpowiedzi. Jako roztwór reakcyjny wykorzystywano 10 mM bufor fosforanu potasu zawierający 1 mM metoksy-PMS, a pomiar przeprowadzano dla wodnych roztworów glukozy o różnych stężeniach w temperaturze 25°C i 40°C, stosując napięcie 100 mV.

Potwierdzono, że mierząc stężenie glukozy z zastosowaniem wytworzonego sensora glukozy, otrzymywano dane odpowiadające każdemu stężeniu.

Zastosowanie przemysłowe

Przedmiotem wynalazku jest enzym, który wykazuje wysoką specyficzność substratową, który można wytwarzać przy niskich kosztach, i który nie podlega działaniu tlenu rozpuszczonego w mierzonej próbce, a mianowicie nowa dehydrogenaza glukozowa posiadająca lepszą stabilność termiczną oraz sposób otrzymywania tego enzymu. Ponadto, otrzymano nowy szczep bakteryjny Burkhorderia cepacia wytwarzający ten enzym. Ujawniono również sensor glukozy skuteczny w mierzeniu glukozy przez zastosowanie elektrody enzymatycznej zawierającej enzym lub szczep bakteryjny.

PL 207 576 B1

Ponadto, ponieważ wynalazek ujawnił gen dehydrogenazy glukozowej, peptyd, który umożliwia wydajną ekspresję tego genu oraz DNA kodujący ten peptyd, mogą być wytwarzane duże ilości GDH przez zastosowanie technik rekombinowanego DNA opartych na tym genie.

Lista sekwencji <110> SODĘ, Koj i < 120> Nowa dehydrogenaza glukozowa i sposób wytwarzania dehydrogenazy <130> KOI262 <141> 2001-10-31 <150> JP 2000-332085 <15I> 2000-10-31 <150> JP 2000-357102 <151> 2000-11-24 <150> JP 2001-276832 <151> 2001-09-12 <160> 12 <I70> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <2ll> 2467 <212> DNA <213> Burkhorderia cepacia <220>

<221> CDS <222> (258)..(761) <220>

<221> CDS <222> (764)..(2380) <22O>

<221> CDS <222> (2386)..(2466) <400> 1 aagclttctg tttgaltgca cgcgattcta accgagcgtc tgtgaggcgg aacgcgacat 60 gcttcgtgtc gcacacgtgl cgcgccgacg acacaaaaal gcagcgaaal ggctgatcgt 120

PL 207 576 B1 tacgaatggc tgacacattg aatggactat aaaaccattg tccgttccgg aatglgcgcg 180 tacatltcag gtccgcgccg atttttgaga aatatcaagc gtggttttcc cgaatccggt 240 gtlcgagaga aggaaac alg cac aac gac aac act ccc cac leg cgl cgc 290

Met His Asn Asp Asn Thr Pro His Ser Arg Arg

1

5

10

cac

ggc

gac

gca

gcc

gca

t ca

ggc

atc

acg

cgg

cgl

caa

tgg

t tg

caa

338

His

Gly

Asp

Ala

Ala

Ala

Ser

Gly

Ile

Thr

Arg

Arg

Gin

Trp

Leu

Gin

15

20

25

ggc

gcg

c tg

gcg

ctg

acc

gca

gcg

ggc

ctc

acg

ggt

tcg

c tg

aca

t tg

386

Gly

Ala

Leu

Ala

Leu

Thr

Ala

Ala

Gly

Leu

Thr

Gly

Ser

Leu

Thr

Leu

30

35

40

cgg

gcg

cli

gca

gac

aac

ccc

ggc

ac t

gcg

ccg

ctc

gat

acg

ttc

atg

434

Arg

Ala

Leu

Ala

Asp

Asn

Pro

Gly

Thr

Ala

Pro

Leu

Asp

Thr

Phe

Met

45

50

55

acg

c 11

tcc

gaa

tcg

ctg

acc

ggc

aag

aaa

ggg

ctc

agc

cgc

gtg

atc

482

Thr

Leu

Ser

Glu

Ser

Leu

Thr

Gly

Lys

Lys

Gly

Leu

Ser

Arg

Yal

Ile

60

65

70

75

ggc

gag

cgc

ctg

ctg

cag

gcg

ctg

cag

aag

ggc

tcg

ttc

aag

acg

gcc

530

Gly

Glu

Arg

Leu

Leu

Gin

Ala

Leu

Gin

Lys

Gly

Ser

Phe

Lys

Thr

Ala

80

85

90

gac

agc

ctg

ccg

cag

ctc

gcc

ggc

gcg

ctc

gcg

tcc

ggt

leg

ctg

acg

578

Asp

Ser

Leu

Pro

Gin

Leu

Ala

Gly

Ala

Leu

Ala

Ser

Gly

Ser

Leu

Thr

95

100

105

cci

gaa

cag

gaa

tcg

ctc

gca

ctg

acg

atc

ctc

gag

gcc

tgg

tat

ctc

626

Pro

Glu

Gin

Glu

Ser

Leu

Ala

Leu

Thr

Ile

Leu

Glu

Ala

Trp

Tyr

Leu

110

115

120

ggc

ale

gtc

gac

aac

gtc

gtg

at t

acg

tac

gag

gaa

gca

t ta

atg

t tc

674

Gly

Ile

Val

Asp

Asn

Val

Val

Ile

Thr

Tyr

Glu

Glu

Ala

Leu

Met

Phe

125

130

135

ggc

glc

gtg

tcc

gat

acg

ctc

gtg

atc

cgt

tcg

tat

tgc

ccc

aac

aaa

722

Gly

Val

Val

Ser

Asp

Thr

Leu

Yal

Ile

Arg

Ser

Tyr

Cys

Pro

Asn

Lys

140

145

150

155

ccc

ggc

ttc

tgg

gcc

gac

aaa

ccg

atc

gag

agg

caa

gcc

tg alg i

gcc

769

Pro

Gly

Phe

Trp

Ala

Asp

Lys

Pro

I le

Glu

Arg

Gin

Ala

Met j

Ma

160

165

170

gal

acc

gat

acg

caa

aag

gcc

gac

gtc

gtc

glc

git

gga

tcg

ggt

gtc

817

Asp

Thr

Asp

Thr

Gin

Lys

Ala

Asp

Yal

Val

Va 1

Yal

Gly

Ser

Gly

Yal

175

180

185

gcg

ggc

gcg

atc

gtc

gcg

cat

cag

ctc

gcg

atg

gcg

ggc

aag

gcg

gig

865

Ala

Gly

Ala

Ile

Va 1

Ala

His

Gin

Leu

Ala

Met

Ala

Gly

Lys

Ala

Yal

190

195

200

atc

c Ig

ctc

gaa

gcg

ggc

ccg

cgc

atg

ccg

cgc

tgg

gaa

atc

gtc

gag

913

Ile

Leu

Leu

Glu

Ala

Gly

Pro

Arg

Met

Pro

Arg

Trp

Glu

Ile

Yal

Glu

PL 207 576 B1

cgc	tle	205 cgc	aa t	cag	ccc	gac	210 aag
Arg	Phe	Arg	Asn	Gin	Pro	Asp	Lys
leg	220 age	ccc	tgg	gcg	ccg	225 cat	ccc
Ser	Ser	Pro	Trp	Ala	Pro	His	Pro
235 ctg	atc	ctg	aag	ggc	240 gag	cac	aag
Leu	Ile	Leu	Lys	Gly	Glu	His	Lys
gtg	ggc	ggc	acg	255 acg	tgg	cac	tgg
Val	Gly	Gly	Thr	Thr	Trp	His	Trp
ccg	aac	gac	270 t tc	aag	atg	aag	age
Pro	Asn	Asp	Phe	Lys	Met	Lys	Ser
ccg	ale	285 cag	tac	gac	gat	c le	290 gag
Pro	He	Gin	Tyr	Asp	Asp	Leu	Glu
gag	300 ctc	ggc	gtg	tgg	ggc	305 ccg	ggc
Glu	Leu	Gly	Val	Trp	Gly	Pro	Gly
315 cgc	aag	cag	ccg	tat	320 ccg	atg	ccg
Arg	Lys	Gin	Pro	Tyr	Pro	Met	Pro
cag	acc	atc	aag	335 acg	gcg	ctg	aac
Gin	Thr	Ile	Lys	Thr	Ala	Leu	Asn
gtg	acc	gag	350 ccg	gtc	gcg	cgc	aac
Va 1	Thr	Glu	Pro	Yal	Ala	Arg	Asn
ac t	tgt	365 tgc	ggc	aac	aac	aac	370 tgc
Thr	Cys	Cys	Gly	Asn	Asn	Asn	Cys
alg	380 tac	aac	ggc	atc	gtg	385 cac	gtc
Met	Tyr	Asn	Gly	Ile	Val	His	Yal
395 aag	ctg	atc	gag	aac	400 gcg	gtc	gtc
Lys	Leu	Ile	Glu	Asn	Ala	Va 1	Val
aag	cgc	atc	gtc	415 gcg	gcg	ctc	tac
Lys	Arg	Ile	Va 1	Ala	Ala	Leu	Tyr

430

atg	gac	ttc	atg	215 gcg	ccg	tac	ccg
Met	Asp	Phe	Met	Ala	Pro	Tyr	Pro
gag	tac	ggc	230 ccg	ccg	aac	gac	tac

Glu Tyr Gly Pro Pro Asn Asp Tyr 245 250 ttc aac tcg cag tac atc cgc gcg 1057

Phe Asn Ser Gin Tyr Ile Arg Ala

260 265 gcc gcg tcg gcg tgg cgc ttc att 1105

Ala Ala Ser Ala Trp Arg Phe Ile

275					280
gtg	tac	ggc	gtc	ggc	cgc	gac	tgg
Yal	Tyr	Gly	Yal	Gly 295	Arg	Asp	Trp
ccg	tac	tat	cag	cgc	gcg	gag	gaa
Pro	Tyr	Tyr	Gin 310	Arg	Ala	Glu	Glu
ccc	gag	gaa	gat	ctg	tac	tcg	ccg
Pro	Glu	Glu 325	Asp	Leu	Tyr	Ser	Pro 330
ccg	ctg	ccg	ttg	tcg	t tc	aac	gag
Pro	Leu 340	Pro	Leu	Ser	Phe	Asn 345	Glu
aac	tac	gat	ccg	aag	ttc	cat	gtc
Asn 355	Tyr	Asp	Pro	Lys	Phe 360	His	Val
age	cgc	ccg	tac	gac	ggc	cgc	ccg
Ser	Arg	Pro	Tyr	Asp 375	Gly	Arg	Pro
atg	ccg	atc	tgc	ccg	atc	ggc	gcg
Met	Pro	Ile	Cys 390	Pro	Ile	Gly	Ala
gag	aag	gcc	gaa	cgc	gcc	ggc	gcg
Glu	Lys	Ala 405	Glu	Arg	Ala	Gly	Ala 410
tac	aag	ctc	gag	acg	ggc	ccg	gac
Tyr	Lys 420	Leu	Glu	Thr	Gly	Pro 425	Asp
aag	gac	aag	acg	ggc	gcc	gag	cat
Lys 435	Asp	Lys	Thr	Gly	Ala 440	Glu	His

PL 207 576 B1

cgc

gtc

gaa

ggc

aag

tat

1 tc

gtg

ctc

gcc

gcg

aac

ggc

atc

gag

acg

1633

Arg

Val

Glu

Gly

Lys

Tyr

Phe

Val

Leu

Ala

Ala

Asn

Gly

Ile

Glu

Thr

445

450

455

ccg

aag

atc

c tg

c tg

atg

tcc

gcg

aac

cgc

gat

1 tc

ccg

aac

ggt

gtc

1681

Pro

Lys

Ile

Leu

Leu

Met

Ser

Ala

Asn

Arg

Asp

Phe

Pro

Asn

Gly

Yal

460

465

470

gcg

aac

age

teg

gac

atg

gtc

ggc

cgc

aac

ctg

atg

gac

ca t

ccg

ggc

1729

Ala

Asn

Ser

Ser

Asp

Met

Yal

Gly

Arg

Asn

Leu

Met

Asp

His

Pro

Gly

475

480

485

490

acc

ggc

gtg

teg

tle

tat

gcg

age

gag

aag

ctg

tgg

ccg

ggc

cgc

ggc

1777

Thr

Gly

Yal

Ser

Phe

Tyr

Ala

Ser

Glu

Lys

Leu

Trp

Pro

Gly

Arg

Gly

495

500

505

ccg

cag

gag

atg

acg

leg

ctg

atc

ggt

1 tc

cgc

gac

ggt

ccg

t tc

cgc

1825

Pro

Gin

Glu

Met

Thr

Ser

Leu

Ile

Gly

Phe

Arg

Asp

Gly

Pro

Phe

Arg

510

515

520

gcg

acc

gaa

gcg

gcg

aag

aag

atc

cac

ctg

teg

aac

ctg

teg

cgc

atc

1873

Ala

Thr

Glu

Ala

Ala

Lys

Lys

Ile

His

Leu

Ser

Asn

Leu

Ser

Arg

Ile

525

530

535

gac

cag

gag

acg

cag

aag

atc

t tc

aag

gcc

ggc

aag

ctg

atg

aag

ccc

1921

Asp

Gin

Glu

Thr

Gin

Lys

Ile

Phe

Lys

Ala

Gly

Lys

Leu

Met

Lys

Pro

540

545

550

gac

gag

ctc

gac

gcg

cag

atc

cgc

gac

cgt

tcc

gca

cgc

tac

gtg

cag

1969

Asp

Glu

Leu

Asp

Ala

Gin

Ile

Arg

Asp

Arg

Ser

Ala

Arg

Tyr

Va 1

Gin

555

560

565

570

t tc

gac

tgc

t tc

cac

gaa

atc

ctg

ccg

caa

ccc

gag

aac

cgc

atc

gtg

2017

Phe

Asp

Cys

Phe

His

Glu

Ile

Leu

Pro

Gin

Pro

Glu

Asn

Arg

Ile

Yal

575

580

585

ccg

age

aag

acg

gcg

acc

gat

gcg

atc

ggc

att

ccg

cgc

ccc

gag

atc

2065

Pro

Ser

Lys

Thr

Ala

Thr

Asp

Ala

Ile

Gly

Ile

Pro

Arg

Pro

Glu

Ile

590

595

600

acg

tat

gcg

atc

gac

gac

tac

gtg

aag

cgc

ggc

gcc

gcg

cat

acg

cgc

2113

Thr

Tyr

Ala

Ile

Asp

Asp

Tyr

Yal

Lys

Arg

Gly

Ala

Ala

His

Thr

Arg

605

610

615

gag

gtc

lac

gcg

acc

gcc

gcg

aag

gtg

ctc

ggc

ggc

acg

gac

gtc

gtg

2161

Glu

Va 1

Tyr

Ala

Thr

Ala

Ala

Lys

Val

Leu

Gly

Gly

Thr

Asp

Val

Yal

620

625

630

tle

aac

gac

gaa

t tc

gcg

ccg

aac

aal

cac

atc

acg

ggc

teg

acg

atc

2209

Phe

Asn

Asp

Glu

Phe

Ala

Pro

Asn

Asn

His

Ile

Thr

Gly

Ser

Thr

He

635

640

645

650

alg

ggc

gcc

gat

gcg

cgc

gac

tcc

gtc

gtc

gac

aag

gac

tgc

cgc

acg

2257

Met

Gly

Ala

Asp

Ala

Arg

Asp

Ser

Va 1

Va 1

Asp

Lys

Asp

Cys

Arg

Thr

655

660

665

ttc

gac

cat

ccg

aac

clg

t tc

att

teg

age

age

gcg

acg

alg

ccg

acc

2305

PL 207 576 B1

Phe Asp His Pro Asn Leu Phe 670

Ile Ser Ser Ser Ala Thr Met

Pro Thr

675

680

gtc

ggt

acc

gta

aac

gtg

acg

ctg

acg

atc

gcc

gcg

clc

gcg

ctg cgg

2353

Val

Gly

Thr

Val

Asn

Va 1

Thr

Leu

Thr

Ile

Ala

Ala

Leu

Ala

Leu Arg

685

690

695

atg

tcg

gac

acg

ctg

aag

aag

gaa

gtc

tgacc gtg cgg aaa tct act ctc

2403

Met

Ser

Asp

Thr

Leu

Lys

Lys

Glu

Val

Val Arg Lys Ser Thr Leu

700

705

710

ac l

t tc

ctc

atc

gcc

ggc

tgc

ctc

gcg

t tg

ccg

ggc

t tc

gcg

cgc gcg

2451

Thr

Phe

Leu

Ile

Ala

Gly

Cys

Leu

Ala

Leu

Pro

Gly

Phe

Ala

Arg Ala

715

720

725

gcc

gat

gcg

gcc

gat

c

2467

Ala

Asp

Ala

Ala

Asp

730 <210> 2 <2Ι1> 168 <212> PRT <213> Burkhorderia cepacia <400> 2

Met 1

His

Asn

Asp Asn Thr Pro His Ser Arg Arg His Gly Asp Ala Ala

5

10

15

Ala

Ser

Gly

Ile

Thr

Arg

Arg

Gin

Trp

Leu

Gin

Gly

Ala

Leu

Ala

Leu

20

25

30

Thr

Ala

Ala

Gly

Leu

Thr

Gly

Ser

Leu

Thr

Leu

Arg

Ala

Leu

Ala

Asp

35

40

45

Asn

Pro

Gly

Thr

Ala

Pro

Leu

Asp

Thr

Phe

Met

Thr

Leu

Ser

Glu

Ser

50

55

60

Leu

Thr

Gly

Lys

Lys

Gly

Leu

Ser

Arg

Va 1

ile

Gly

Glu

Arg

Leu

Leu

65

70

75

80

Gin

Ala

Leu

Gin

Lys

Gly

Ser

Phe

Lys

Thr

Ala

Asp

Ser

Leu

Pro

Gin

85

90

95

Leu

Ala

Gly

Ala

Leu

Ala

Ser

Gly

Ser

Leu

Thr

Pro

Glu

Gin

Glu

Ser

100

105

110

Leu

Ala

Leu

Thr

Ile

Leu

Glu

Ala

Trp

Tyr

Leu

Gly

Ile

Va 1

Asp

Asn

115

120

125

Val

Val

Ile

Thr

Tyr

Glu

Glu

Ala

Leu

Met

Phe

Gly

Va 1

Val

Ser

Asp

130

135

140

Thr

Leu

Va 1

Ile

Arg

Ser

Tyr

Cys

Pro

Asn

Lys

Pro

Gly

Phe

Trp

Ala

145

150

155

160

Asp

Lys

Pro

Ile

Glu

Arg

Gin

Ala

165

PL 207 576 B1 <210> 3 <21l> 539 <212> PRT <213> Burkhorderia cepacia <400> 3

Met 1

Ala

Asp Thr

Asp Thr Gin Lys Ala Asp Val

Yal Yal Va 1

Gly 15

Ser

5

10

Gly

Val

Ala

Gly

Ala

Ile

Va l

Ala

His

Gin

Leu

Ala

Met

Ala

Gly

Lys

20

25

30

Ala

Val

Ile

Leu

Leu

Glu

Ala

Gly

Pro

Arg

Met

Pro

Arg

Trp

Glu

Ile

35

40

45

Va 1

Glu

Arg

Phe

Arg

Asn

Gin

Pro

Asp

Lys

Met

Asp

Phe

Met

Ala

Pro

50

55

60

Tyr

Pro

Ser

Ser

Pro

Trp

Ala

Pro

His

Pro

Glu

Tyr

Gly

Pro

Pro

Asn

65

70

75

80

Asp

Tyr

Leu

Ile

Leu

Lys

Gly

Glu

His

Lys

Phe

Asn

Ser

Gin

Tyr

Ile

85

90

95

Arg

Ala

Val

Gly

Gly

Thr

Thr

Trp

His

Trp

Ala

Ala

Ser

Ala

Trp

Arg

100

105

110

Phe

Ile

Pro

Asn

Asp

Phe

Lys

Met

Lys

Ser

Va 1

Tyr

Gly

Val

Gly

Arg

115

120

125

Asp

Trp

Pro

Ile

Gin

Tyr

Asp

Asp

Leu

Glu

Pro

Tyr

Tyr

Gin

Arg

Ala

130

135

140

Glu

Glu

Glu

Leu

Gly

Yal

Trp

Gly

Pro

Gly

Pro

Glu

Glu

Asp

Leu

Tyr

145

150

155

160

Ser

Pro

Arg

Lys

Gin

Pro

Tyr

Pro

Met

Pro

Pro

Leu

Pro

Leu

Ser

Phe

165

170

175

Asn

Glu

Gin

Thr

Ile

Lys

Thr

Ala

Leu

Asn

Asn

Tyr

Asp

Pro

Lys

Phe

180

185

190

His

Va 1

Val

Thr

Glu

Pro

Val

Ala

Arg

Asn

Ser

Arg

Pro

Tyr

Asp

Gly

195

200

205

Arg

Pro

Thr

Cys

Cys

Gly

Asn

Asn

Asn

Cys

Met

Pro

Ile

Cys

Pro

Ile

210

215

220

Gly

Ala

Met

Tyr

Asn

Gly

Ile

Yal

His

Yal

Glu

Lys

Ala

Glu

Arg

Ala

225

230

235

240

Gly

Ala

Lys

Leu

Ile

Glu

Asn

Ala

Yal

Val

Tyr

Lys

Leu

Glu

Thr

Gly

245

250

255

Pro

Asp

Lys

Arg

Ile

Val

Ala

Ala

Leu

Tyr

Lys

Asp

Lys

Thr

Gly

Ala

260

265

270

Glu

H i s

Arg

Val

Glu

Gly

Lys

Tyr

Phe

Va 1

Leu

Ala

Ala

Asn

Gly

Ile

275

280

285

Glu

Thr

Pro

Lys

Ile

Leu

Leu

Met

Ser

Ala

Asn

Arg

Asp

Phe

Pro

Asn

PL 207 576 B1

290

295

300

Gly

Va 1

Ala

Asn

Ser

Ser

Asp

Met

Va 1

Gly

Arg

Asn

Leu

Met

Asp

His

305

310

315

320

Pro

Gly

Thr

Gly

Va 1

Ser

Phe

Tyr

A1 a

Ser

Glu

Lys

Leu

Trp

Pro

Gly

325

330

335

Arg

Gly

Pro

Gin

Glu

Met

Thr

Ser

Leu

Ile

Gly

Phe

Arg

Asp

Gly

Pro

340

345

350

Phe

Arg

Ala

Thr

Glu

Ala

Ala

Lys

Lys

Ile

His

Leu

Ser

Asn

Leu

Ser

355

360

365

Arg

Ile

Asp

Gin

Glu

Thr

Gin

Lys

Ile

Phe

Lys

Ala

Gly

Lys

Leu

Met

370

375

380

Lys

Pro

Asp

Glu

Leu

Asp

Ala

Gin

I le

Arg

Asp

Arg

Ser

Ala

Arg

Tyr

385

390

395

400

Val

Gin

Phe

Asp

Cys

Phe

His

Glu

Ile

Leu

Pro

Gin

Pro

Glu

Asn

Arg

405

410

415

Ile

Val

Pro

Ser

Lys

Thr

Ala

Thr

Asp

Ala

Ile

Gly

Ile

Pro

Arg

Pro

420

425

430

Glu

Ile

Thr

Tyr

Ala

Ile

Asp

Asp

Tyr

Val

Lys

Arg

Gly

Ala

Ala

His

435

440

445

Thr

Arg

Glu

Va I

Tyr

Ala

Thr

Ala

Ala

Lys

Va I

Leu

Gly

Gly

Thr

Asp

450

455

460

Va 1

Va 1

Phe

Asn

Asp

Glu

Phe

Ala

Pro

Asn

Asn

His

Ile

Thr

Gly

Ser

465

470

475

480

Thr

Ile

Met

Gly

Ala

Asp

Ala

Arg

Asp

Ser

Va 1

Val

Asp

Lys

Asp

Cys

485

490

495

Arg

Thr

Phe

Asp

His

Pro

Asn

Leu

Phe

He

Ser

Ser

Ser

Ala

Thr

Met

500

505

510

Pro

Thr

Val

Gly

Thr

Val

Asn

Val

Thr

Leu

Thr

Ile

Ala

Ala

Leu

Ala

515

520

525

Leu

Arg

Met

Ser

Asp

Thr

Leu

Lys

Lys

Glu

Va 1

530

535

<210> 4 <211> 27 <212> PRT <213> Burkhorderia cepacia <400> 4

Val Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu 15 10 15

Pro Gly Phe Ala Arg Ala Ala Asp Ala Ala Asp 20 25

PL 207 576 B1 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Burkhorderia cepacia <400> 5

Ala Asp Ala Ala Asp Pro Ala Leu Val Lys Arg Gly Glu Tyr Leu Ala 15 10 15 <210> 6 <21l> 15 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: starter <400> 6 gcggatgcgg cggat <210> 7 <211> 15 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: starter <400> 7 cgccagatat tcgcc <21O> 8 <2ll> 18 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Op>^s sekwencji sztucznej: starter <400> 8 ccggcgclgg Igaaacgc <210> 9

PL 207 576 B1 <211> 28 <21 2> DNA <213> Sekwencja sztuczna <22O>

<223> Opis sekwencji sztucznej: starter <400> 9 cccaagcltg ggccgatacc gatacgca 28 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: starter <400> 10 gagaagcttt ccgcacggtc agacttcc 29 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: starter <400> 11 catgccatgg cacacaacga caacact 27 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: starter <400> 12 cccaagcttg ggtcagactt ccttcttcag c 31

Claims (20)

1. Białko o sekwencji aminokwasowej o numerze identyfikacyjnym: 3.

2. DNA kodujący białko określone w zastrz. 1.

3. DNA według zastrz. 2, znamienny tym, że zawiera sekwencję nukleotydową od numeru 764 do 2380 w sekwencji nukleotydowej o numerze identyfikacyjnym: 1.

4. Rekombinowany wektor, znamienny tym, że zawiera DNA określone w zastrz. 2 albo 3,

5. Transformant, znamienny tym, że jest stransformowany DNA określonym w zastrz. 2 albo 3 lub rekombinowanym wektorem określonym w zastrz. 4.

6. Sposób wytwarzania białka o aktywności dehydrogenazy glukozowej, znamienny tym, że obejmuje etapy hodowania transformanta opisanego w zastrz. 5 w celu wytwarzania dehydrogenazy glukozowej jako produktu ekspresji DNA i etap zbierania go.

7. Sposób wytwarzania białka o aktywności dehydrogenazy glukozowej, znamienny tym, że obejmuje etapy hodowania mikroorganizmu z rodzaju Burkhorderia o zdolności do wytwarzania w pożywce białka określonego w zastrz. 1 i etap zbierania białka lub kompleksu zawierającego białko z pożywki i/lub komórek mikroorganizmu.

8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że mikroorganizmem jest Burkhorderia cepacia.

9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że Burkhorderia cepacia jest szczepem Burkhorderia cepacia KS1 (FERM BP-7306).

10. Szczep Burkhorderia cepacia KS1 (FERM BP-7306).

11. Sensor glukozy, znamienny tym, że wykorzystuje elektrodę enzymatyczną obejmującą białko określone w zastrz. 1, transformant z zastrz. 5 lub szczep z zastrz. 10.

12. Zestaw do oznaczania glukozy, znamienny tym, że obejmuje białko określone w zastrz. 1.

13. Białko o sekwencji aminokwasowej o numerze identyfikacyjnym: 2.

14. DNA kodujący białko określone w zastrz.13.

15. DNA według zastrz. 14, znamienny tym, że zawiera sekwencję nukleotydową od numeru od 258 do 761 w sekwencji nukleotydowej o numerze identyfikacyjnym: 1.

16. DNA, znamienny tym, że obejmuje DNA określone w zastrz. 14 lub 15 i DNA określone w zastrz. 2 lub 3, w tej kolejności.

17. DNA według zastrz. 16, znamienny tym, że zawiera sekwencję nukleotydową od numeru 258 do 2380 w sekwencji nukleotydowej o numerze identyfikacyjnym: 1.

18. Rekombinowany wektor, znamienny tym, że zawiera DNA określone w zastrz. 16 lub 17.

19. Transformant, znamienny tym, że jest stransformowany DNA z zastrz. 16 lub 17 lub zrekombinowanym wektorem z zastrz. 18.

20. Sposób wytwarzania białka o aktywności dehydrogenazy glukozowej, znamienny tym, że obejmuje etapy hodowania transformanta określonego w zastrz. 19 w celu wytwarzania produktu ekspresji DNA określonego w zastrz. 16 lub 17 i etap zbierania go.