JP5824205B2 - 変異グルコース脱水素酵素 - Google Patents
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Description
本発明は基質特異性の向上した変異グルコース脱水素酵素に関する。詳細には、本発明は、シトクロムＣを含むグルコース脱水素酵素（以下ＣｙＧＤＨとも称する）を構成するαサブユニットのアミノ酸残基に変異導入した変異型αサブユニットを含むグルコース脱水素酵素およびその遺伝子に関する。本発明のグルコース脱水素酵素は、グルコースセンサ、及びグルコースアッセイキット等に好適に使用することができ、生化学分野、臨床分野等で有用である。
現在、野生型のＣｙＧＤＨや、ピロロキノリンキノンを補酵素とするＰＱＱＧＤＨが、自己血糖測定センサに用いられている。野生型のＣｙＧＤＨやＰＱＱＧＤＨは、グルコースのみならずマルトースにも反応することから、患者の血中マルトース濃度が高い場合においては、正確な血糖値の測定ができないという欠点があった。特に日本や英国においては、輸液中のエネルギー物質としてマルトースが用いられており、実際に、腹膜透析等により輸液を投与している低血糖患者が、ＰＱＱＧＤＨ型の血糖センサで高血糖と誤認されたことによる事故も発生している。
野生型ＣｙＧＤＨは、グルコースに対してマルトースの反応性が高く、グルコース濃度５０ｍｇ／ｄＬ時において、マルトース濃度が１００ｍｇ／ｄＬ時の血糖値計測結果は、１７０％高値を示す。
野生型ＣｙＧＤＨは、グルコースに対してマルトースの反応性が高く、グルコース濃度５０ｍｇ／ｄＬ時において、マルトース濃度が１００ｍｇ／ｄＬ時の血糖値計測結果は、１７０％高値を示す。
このような状況に鑑み、ＣｙＧＤＨの変異体酵素（αサブユニットのアミノ酸残基の３２６位と３６５位に変異導入し、それぞれグルタミン（Ｑ）、チロシン（Ｙ）に置換した変異体グルコース脱水素酵素（以下ＣｙＧＤＨ（ＱＹ）または単にＱＹ、ＱＹＡとも称する）が発明されており（特許文献１）、グルコース濃度５０ｍｇ／ｄＬ時において、マルトース濃度が１００ｍｇ／ｄＬ時の血糖値計測結果が、３６％の高値まで抑えることが出来ている。しかしながら、マルトース影響回避効果が完全なものとは言えなかった。
本発明は、ＣｙＧＤＨ（ＱＹ）よりも、グルコースに対する基質特異性の向上したＣｙＧＤＨを提供することを課題とする。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ＣｙＧＤＨを構成するαサブユニットのアミノ酸残基のうち、３２６位および３６５位に相当する部位をそれぞれグルタミンおよびチロシンで置換し、さらに４７２位に相当する部位をチロシンで置換することにより、基質特異性がＣｙＧＤＨ（ＱＹ）と比較してさらに向上すること、そして、ＧＤＨのホモログにおいても３２６位、３６５位および４７２位に相当する部位をそれぞれグルタミン、チロシンおよびチロシンで置換することが同様の効果をもたらすことを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）配列番号３と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有する変異グルコース脱水素酵素であって、
前記アミノ酸配列の３２６位、３６５位および４７２位に相当するアミノ酸残基が、それぞれグルタミン、チロシンおよびチロシンで置換されており、
グルコースに対する基質特異性が向上し、二糖類に対する反応性が低下したことを特徴とする、変異グルコース脱水素酵素。
（２）配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、（１）に記載の変異グルコース脱水素酵素。
（３）３２６位、３６５位および４７２位に相当する位置以外は配列番号３に示すアミノ酸配列を有する、（１）または（２）に記載の変異グルコース脱水素酵素。
（４）３２６位、３６５位および４７２位に相当する位置以外は配列番号７に示すアミノ酸配列を有する、（１）または（２）に記載の変異グルコース脱水素酵素。
（５）３２６位、３６５位および４７２位に相当する位置以外は配列番号８に示すアミノ酸配列を有する、（１）または（２）に記載の変異グルコース脱水素酵素。
（６）３２６位、３６５位および４７２位に相当する位置以外は配列番号９に示すアミノ酸配列を有する、（１）または（２）に記載の変異グルコース脱水素酵素。
（７）３２６位、３６５位および４７２位に相当する位置以外は配列番号１０に示すアミノ酸配列を有する、（１）または（２）に記載の変異グルコース脱水素酵素。
（８）前記アミノ酸配列において３２６位および３６５位に相当するアミノ酸残基がそれぞれグルタミンおよびチロシンで置換されているが４７２位は置換されていないグルコース脱水素酵素と比較して、グルコースに対する基質特異性が向上し、二糖類に対する反応性が低下したことを特徴とする、（１）〜（７）のいずれか１項に記載の変異グルコース脱水素酵素。
（９）二糖類がマルトースであることを特徴とする（１）〜（８）のいずれか１項に記載の変異グルコース脱水素酵素。
（１０）（１）〜（９）のいずれか１項に記載の変異グルコース脱水素酵素と、電子伝達サブユニットとを少なくとも含む変異グルコース脱水素酵素複合体。
（１１）電子伝達サブユニットがシトクロムＣであることを特徴とする（１０）に記載のグルコース脱水素酵素複合体。
（１２）（１）〜（９）のいずれか１項に記載の変異グルコース脱水素酵素をコードするＤＮＡ。
（１３）（１２）に記載のＤＮＡを保持し、（１）〜（９）のいずれか１項に記載の変異グルコース脱水素酵素、あるいは（１０）または（１１）に記載の変異グルコース脱水素酵素複合体を産生する微生物。
（１４）（１）〜（９）のいずれか１項に記載の変異グルコース脱水素酵素、（１０）または（１１）に記載の変異グルコース脱水素酵素複合体、あるいは（１３）に記載の微生物を含む、グルコースアッセイキット。
（１５）（１）〜（９）のいずれか１項に記載の変異グルコース脱水素酵素、（１０）または（１１）に記載の変異グルコース脱水素酵素複合体、あるいは（１３）に記載の微生物を含む、グルコースセンサ。
（１）配列番号３と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有する変異グルコース脱水素酵素であって、
前記アミノ酸配列の３２６位、３６５位および４７２位に相当するアミノ酸残基が、それぞれグルタミン、チロシンおよびチロシンで置換されており、
グルコースに対する基質特異性が向上し、二糖類に対する反応性が低下したことを特徴とする、変異グルコース脱水素酵素。
（２）配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、（１）に記載の変異グルコース脱水素酵素。
（３）３２６位、３６５位および４７２位に相当する位置以外は配列番号３に示すアミノ酸配列を有する、（１）または（２）に記載の変異グルコース脱水素酵素。
（４）３２６位、３６５位および４７２位に相当する位置以外は配列番号７に示すアミノ酸配列を有する、（１）または（２）に記載の変異グルコース脱水素酵素。
（５）３２６位、３６５位および４７２位に相当する位置以外は配列番号８に示すアミノ酸配列を有する、（１）または（２）に記載の変異グルコース脱水素酵素。
（６）３２６位、３６５位および４７２位に相当する位置以外は配列番号９に示すアミノ酸配列を有する、（１）または（２）に記載の変異グルコース脱水素酵素。
（７）３２６位、３６５位および４７２位に相当する位置以外は配列番号１０に示すアミノ酸配列を有する、（１）または（２）に記載の変異グルコース脱水素酵素。
（８）前記アミノ酸配列において３２６位および３６５位に相当するアミノ酸残基がそれぞれグルタミンおよびチロシンで置換されているが４７２位は置換されていないグルコース脱水素酵素と比較して、グルコースに対する基質特異性が向上し、二糖類に対する反応性が低下したことを特徴とする、（１）〜（７）のいずれか１項に記載の変異グルコース脱水素酵素。
（９）二糖類がマルトースであることを特徴とする（１）〜（８）のいずれか１項に記載の変異グルコース脱水素酵素。
（１０）（１）〜（９）のいずれか１項に記載の変異グルコース脱水素酵素と、電子伝達サブユニットとを少なくとも含む変異グルコース脱水素酵素複合体。
（１１）電子伝達サブユニットがシトクロムＣであることを特徴とする（１０）に記載のグルコース脱水素酵素複合体。
（１２）（１）〜（９）のいずれか１項に記載の変異グルコース脱水素酵素をコードするＤＮＡ。
（１３）（１２）に記載のＤＮＡを保持し、（１）〜（９）のいずれか１項に記載の変異グルコース脱水素酵素、あるいは（１０）または（１１）に記載の変異グルコース脱水素酵素複合体を産生する微生物。
（１４）（１）〜（９）のいずれか１項に記載の変異グルコース脱水素酵素、（１０）または（１１）に記載の変異グルコース脱水素酵素複合体、あるいは（１３）に記載の微生物を含む、グルコースアッセイキット。
（１５）（１）〜（９）のいずれか１項に記載の変異グルコース脱水素酵素、（１０）または（１１）に記載の変異グルコース脱水素酵素複合体、あるいは（１３）に記載の微生物を含む、グルコースセンサ。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の変異ＧＤＨは、野生型ＧＤＨのαサブユニットに特定の変異を導入することにより、製造することができる。野生型ＧＤＨとしては、ブルクホリデリア・セパシアが産生するＧＤＨが挙げられる。ブルクホリデリア・セパシアのＧＤＨとしては、ブルクホリデリア・セパシアＫＳ１株、ＪＣＭ２８００株又はＪＣＭ２８０１株が産生するＧＤＨが挙げられる。ＫＳ１株は、平成１２年９月２５日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、受託番号第ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０６として寄託されている。
本発明の変異ＧＤＨは、野生型ＧＤＨのαサブユニットに特定の変異を導入することにより、製造することができる。野生型ＧＤＨとしては、ブルクホリデリア・セパシアが産生するＧＤＨが挙げられる。ブルクホリデリア・セパシアのＧＤＨとしては、ブルクホリデリア・セパシアＫＳ１株、ＪＣＭ２８００株又はＪＣＭ２８０１株が産生するＧＤＨが挙げられる。ＫＳ１株は、平成１２年９月２５日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、受託番号第ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０６として寄託されている。
ＫＳ１株のＧＤＨ αサブユニット遺伝子、及びβサブユニット遺伝子の一部を含む染色体ＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号１に示す（米国特許出願公開第２００４／００２３３３０号）。この塩基配列には３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在し、５’末端側から２番目及び３番目のＯＲＦは、それぞれαサブユニット（配列番号３）、及びβサブユニット（配列番号４）をコードしている。また、１番目のＯＲＦはγサブユニット（配列番号２）をコードしていると推定される。また、配列番号５に、βサブユニット遺伝子全長を含む断片の塩基配列を示す。さらに、βサブユニットのアミノ酸配列を配列番号６に示す（欧州特許出願公開第１４９８４８４号）。配列番号６において、アミノ酸番号１〜２２はシグナルペプチドであると推定される。
また、これらの他に、ブルクホリデリア・セパシアＫＳ１株のＧＤＨのホモログである、ブルクホルデリア・セノセパシアＪ２３１５株のputative oxidoreductase（配列番号７）、ブルクホルデリア・タイランデンシスＴＸＤＯＨ株のhypothetical protein BthaT#07876（配列番号８）、ラルストニア・ピッケティ１２Ｄ株のFAD dependent oxidoreductase（配列番号９）、ラルストニア・ソラナセアラムＩＰＯ１６０９株のtransmembrane dehydrogenase（配列番号１０）およびブルクホルデリア・フィトフィルマンスＰｓＪＮ株のglucose-methanol-choline oxidoreductase（配列番号１１）のそれぞれのαサブユニットも、ブルクホリデリア・セパシアＫＳ１株のＧＤＨと同様に用いることができる。
なお、配列番号７〜１１に示したアミノ酸配列については、いずれもアメリカの国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information, NCBI）のデータベースに登録されている。それぞれの登録番号は、配列番号７がYP_002234347、配列番号８がZP_02370914、配列番号９がYP_002980762、配列番号１０がYP_002260434、配列番号１１がYP_001890482である。
また、ブルクホルデリア・セノセパシアＪ２３１５株は、LMG 16656、ATCC BAA-245、CCM 4899、CCUG 48434、NCTC 13227として寄託されている。ブルクホルデリア・フィトフィルマンスＰｓＪＮ株は、LMG 22487、CCUG 49060として寄託されている。
なお、配列番号７〜１１に示したアミノ酸配列については、いずれもアメリカの国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information, NCBI）のデータベースに登録されている。それぞれの登録番号は、配列番号７がYP_002234347、配列番号８がZP_02370914、配列番号９がYP_002980762、配列番号１０がYP_002260434、配列番号１１がYP_001890482である。
また、ブルクホルデリア・セノセパシアＪ２３１５株は、LMG 16656、ATCC BAA-245、CCM 4899、CCUG 48434、NCTC 13227として寄託されている。ブルクホルデリア・フィトフィルマンスＰｓＪＮ株は、LMG 22487、CCUG 49060として寄託されている。
また、ブルクホリデリア・セパシアＫＳ１株と同属である、ブルクホリデリア・セパシア株、例えばＪＣＭ２８００、ＪＣＭ２８０１、ＪＣＭ５５０６、ＪＣＭ５５０７、ＩＦＯ１４５９５由来のそれぞれのＧＤＨのαサブユニット（配列番号１２〜１６）も、ブルクホリデリア・セパシアＫＳ１株のＧＤＨと同様に用いることができる。なお、ＪＣＭ２８００、ＪＣＭ２８０１、ＪＣＭ５５０６、およびＪＣＭ５５０７は、独立行政法人理化学研究所微生物系統保存施設（Japan Collection of Microorganisms, JCM）に保存されている。ＩＦＯ１４５９５は、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に保存されている。
本発明の変異ＧＤＨは、αサブユニットのみであってもよいし、αサブユニットとβサブユニットとの複合体、αサブユニットとγサブユニットとの複合体、又はαサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットからなる複合体であってもよい。本明細書において、βサブユニットを含むＧＤＨ複合体をＣｙＧＤＨと称し、βサブユニットを含まないＧＤＨ複合体をＧＤＨと称する。本発明の変異ＧＤＨは、いずれの場合もαサブユニットに特定の変異（３２６位、３６５位及び４７２位における変異、またはこれらに対応する位置における変異）が導入されたものであるが、この特定の変異の他に、保存的な変異を有していてもよい。また、他のサブユニットは野生型であっても、保存的な変異を有するものであってもよい。尚、「保存的変異」とは、ＧＤＨ活性に実質的に影響しない変異をいう。
本発明の変異型αサブユニットは、好ましくは、前記特定の変異以外は、配列番号３、７〜１１に示すアミノ酸配列を有する。また、変異型αサブユニットは、ＧＤＨ活性を有する限り、前述したような保存的変異を有していてもよい。すなわち、配列番号３、７〜１１のアミノ酸配列において、前記特定の変異以外に、１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。尚、配列番号３には、配列番号１の塩基配列によってコードされ得るアミノ酸配列を示してあるが、Ｎ末端のメチオニン残基は、翻訳後に脱落している可能性がある。前記「１又は複数」とは、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個である。なお、本発明の変異型αサブユニットは、配列番号３に示すアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％のアミノ酸同一性を有する。
また、βサブユニットは、典型的には配列番号６のアミノ酸配列を有する。しかし、ＣｙＧＤＨのβサブユニットとして機能し得る限り、配列番号６のアミノ酸番号２３〜４２５からなるアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。また、ＣｙＧＤＨのβサブユニットとして機能し得る限り、ＫＳ１株以外のβサブユニットおよび同βサブユニットのアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。前記「１又は複数」とは、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個である。
尚、ＣｙＧＤＨのβサブユニットとして機能するとは、αサブユニットとともに複合体を形成したときに同複合体のＧＤＨ活性を損なわずに電子伝達サブユニット、すなわち、チトクロームＣとして機能することをいう。
尚、ＣｙＧＤＨのβサブユニットとして機能するとは、αサブユニットとともに複合体を形成したときに同複合体のＧＤＨ活性を損なわずに電子伝達サブユニット、すなわち、チトクロームＣとして機能することをいう。
野生型αサブユニット遺伝子として具体的には、配列番号１の塩基番号７６４〜２３８０からなる塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。また、αサブユニット遺伝子は、配列番号１の塩基配列の塩基番号７６４〜２３８０からなる塩基配列を有するＤＮＡ、又はこの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
また、βサブユニット遺伝子として具体的には、配列番号５の塩基番号１８７〜１３９８からなる塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。またβサブユニット遺伝子は、配列番号５の塩基番号１８７〜１３９８からなる塩基配列を有するＤＮＡ、又はこの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、βサブユニットとして機能し得るタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
前記ストリンジェントな条件としては、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズする条件、具体的には、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃が挙げられる。
αサブユニット遺伝子及びβサブユニット遺伝子は、例えば、ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲによって、取得することができる。ＰＣＲ用プライマーは、前記の塩基配列に基づいて化学合成することによって調製することができる。また、前記配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーションによって、ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株の染色体ＤＮＡから取得することもできる。なお、ＫＳ１株以外のブルクホルデリア・セノセパシアＪ２３１５株、ブルクホルデリア・タイランデンシスＴＸＤＯＨ株、ラルストニア・ピッケティ１２Ｄ株、ラルストニア・ソラナセアラムＩＰＯ１６０９株およびブルクホルデリア・フィトフィルマンスＰｓＪＮ株も用いることができる。
本発明の変異ＧＤＨは、上記のような野生型ＧＤＨ又は保存的変異を有するＧＤＨが特定の変異を有することによって、グルコースに対する基質特異性が向上したものである。「グルコースに対する基質特異性が向上した」とは、グルコースに対する反応性を実質的に維持したまま、他の単糖類、二糖類又はオリゴ糖等の糖類、例えばマルトース、ガラクトース、キシロース等に対する反応性が低下したこと、あるいは、グルコースに対する反応性が他の糖類に対する反応性に比べて向上したことを含む。例えば、グルコースに対する反応性が低下しても、他の糖類に対する反応性がそれ以上に低下すれば、グルコースに対する基質特異性は向上する。また、他の糖類に対する反応性が上昇しても、グルコースに対する基質特異性がそれ以上に上昇すれば、グルコースに対する基質特異性は向上する。具体的には例えば、野生型酵素に対する変異型酵素の基質特異性（グルコースに対する比活性と、他の糖類、例えばマルトース、に対する比活性との比）の向上（下記式で表される）が、１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは４０％以上であれば、グルコースに対する基質特異性は向上している。例えば、基質特異性が、野生型酵素では６０％、変異型ＧＤＨでは４０％の場合、グルコースに対する基質特異性は、３３％向上している。
基質特異性＝（グルコース以外の糖類に対する比活性／グルコースに対する比活性）×１００）
基質特異性の向上＝（Ａ−Ｂ）×１００／Ａ
Ａ：野生型酵素の基質特異性
Ｂ：変異型酵素の基質特異性
また、変異型ＧＤＨは、マルトースに対する反応性（比活性）が、グルコースに対する反応性（比活性）の１％以下、好ましくは０．５％以下である。
基質特異性＝（グルコース以外の糖類に対する比活性／グルコースに対する比活性）×１００）
基質特異性の向上＝（Ａ−Ｂ）×１００／Ａ
Ａ：野生型酵素の基質特異性
Ｂ：変異型酵素の基質特異性
また、変異型ＧＤＨは、マルトースに対する反応性（比活性）が、グルコースに対する反応性（比活性）の１％以下、好ましくは０．５％以下である。
本発明の変異型ＧＤＨは、好ましくは、配列番号３に示すアミノ酸配列の３２６位および３６５位に相当するアミノ酸残基がそれぞれグルタミンおよびチロシンで置換されているが４７２位は置換されていないグルコース脱水素酵素と比較して、グルコースに対する基質特異性が向上し、二糖類に対する反応性が低下している。
本発明における変異とは、具体的には以下のとおりである。
（１）配列番号３に示すアミノ酸配列の３２６位に相当するセリン残基のグルタミンへの置換。
（２）配列番号３に示すアミノ酸配列の３６５位に相当するセリン残基のチロシンへの置換。
（３）配列番号３に示すアミノ酸配列の４７２位に相当するアラニン残基のチロシンへの置換。
（１）配列番号３に示すアミノ酸配列の３２６位に相当するセリン残基のグルタミンへの置換。
（２）配列番号３に示すアミノ酸配列の３６５位に相当するセリン残基のチロシンへの置換。
（３）配列番号３に示すアミノ酸配列の４７２位に相当するアラニン残基のチロシンへの置換。
上記アミノ酸置換変異の位置は、配列番号３、すなわちブルクホリデリア・セパシアＫＳ１株の野生型ＧＤＨ αサブユニットのアミノ酸配列における位置であるが、配列番号３のアミノ酸配列において、前記特定の変異以外に、１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するＧＤＨ αサブユニットのホモログ又はバリアントにおいては、配列番号３のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、前記アミノ酸置換の位置に相当する位置を示す。例えば、１〜３６４位の領域において１個のアミノ酸残基の欠失を有するＧＤＨ αサブユニットの保存的バリアントにおいては、３６５位とは、前記バリアントの３６４位を示す。
配列番号７においては、配列番号３の３２６位、３６５位および４７２位に相当する残基はそれぞれ３２６位、３６５位および４７２位で同じである。
配列番号８においては、配列番号３の３２６位、３６５位および４７２位に相当する残基はそれぞれ３２４位、３６３位および４７０位である。
配列番号９においては、配列番号３の３２６位、３６５位および４７２位に相当する残基はそれぞれ３２７位、３６６位および４７３位である。
配列番号１０においては、配列番号３の３２６位、３６５位および４７２位に相当する残基はそれぞれ３２７位、３６６位および４７３位である。
配列番号１１においては、配列番号３の３２６位、３６５位および４７２位に相当する残基はそれぞれ３２２位、３６１位および４６６位である。
なお、配列番号３に示すアミノ酸配列は、配列番号７〜１１に対して、それぞれ、９６％、９３％、８２％、８２％、６３％のアミノ酸配列同一性を有する。
以下の表１において、配列番号３，７〜１１のアミノ酸配列アライメントを示す。
以下の表１において、配列番号３，７〜１１のアミノ酸配列アライメントを示す。
本発明者は、変異体グルコース脱水素酵素（ＣｙＧＤＨ（ＱＹ））と比較して、グルコースに対する基質特異性を増加すべく、遺伝的アルゴリズムを用いて、最適な３２６位、３６５位および４７２位の組み合わせについて検討した。その結果、基質特異性を向上することができる組み合わせを発見した。
本発明の変異型ＧＤＨの好ましい変異の態様を以下に示す。
（数字はアミノ酸配列における位置を、アミノ酸残基は前記位置における置換後のアミノ酸残基を示し、「＋」は同時に２つのアミノ酸置換を有することを示す。）
３２６Ｇｌｎ＋３６５Ｔｙｒ＋４７２Ｔｙｒ
（数字はアミノ酸配列における位置を、アミノ酸残基は前記位置における置換後のアミノ酸残基を示し、「＋」は同時に２つのアミノ酸置換を有することを示す。）
３２６Ｇｌｎ＋３６５Ｔｙｒ＋４７２Ｔｙｒ
所望の変異を有するＧＤＨ αサブユニットは、ＧＤＨ αサブユニットをコードするＤＮＡ（αサブユニット遺伝子）に、部位特異的変異法によって、所望のアミノ酸変異に対応するヌクレオチド変異を導入し、得られる変異ＤＮＡを適当な発現系を用いて発現させることによって、取得することができる。また、変異ＧＤＨ αサブユニットをコードするＤＮＡを、βサブユニットをコードするＤＮＡ（βサブユニット遺伝子）、又はβサブユニット遺伝子とγサブユニットをコードするＤＮＡ（γサブユニット遺伝子）とともに発現させることによって、変異ＣｙＧＤＨ複合体を取得することができる。尚、ＧＤＨ
αサブユニットをコードするＤＮＡへの変異の導入は、γサブユニット、αサブユニット及びβサブユニットをこの順にコードするポリシストロニックなＤＮＡ断片を用いてもよい。
αサブユニットをコードするＤＮＡへの変異の導入は、γサブユニット、αサブユニット及びβサブユニットをこの順にコードするポリシストロニックなＤＮＡ断片を用いてもよい。
変異が導入されたＧＤＨ αサブユニット又はＣｙＧＤＨ複合体の基質特異性は、実施例に記載された方法によって各種糖類に対する反応性を調べ、野生型ＧＤＨαサブユニット又は野生型ＣｙＧＤＨ複合体の反応性と比較することよって、決定することができる。
γサブユニット、αサブユニット及びβサブユニットをこの順にコードするポリシストロニックなＤＮＡ断片は、例えば、ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１９、２０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲによって取得することができる（後記実施例参照）。
ＧＤＨの各サブユニットの遺伝子の取得、変異の導入、遺伝子の発現等に用いるベクターとしては、例えばエシェリヒア属細菌で機能するベクター、具体的にはｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＢＲ１２２等が挙げられる。遺伝子の発現に用いるプロモーターとしては、例えばｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ＰL、ｔｅｔ、ＰｈｏＡ等が挙げられる。また、プロモーターを含む発現ベクターの適当な部位に、αサブユニット遺伝子又は他のサブユニット遺伝子を挿入することによって、これらの遺伝子のベクターへの挿入とプロモーターの連結とを同じ工程で行うことができる。このような発現ベクターとしては、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＫＫ２２３−３等が挙げられる。
また、αサブユニット遺伝子又は他のサブユニット遺伝子は、発現可能な形態で宿主微生物の染色体ＤＮＡ中に組み込まれてもよい。
組換えベクターで微生物を形質転換するには、例えばカルシウム処理によるコンピテントセル法、プロトプラスト法又はエレクトロポレーション法等が挙げられる。
宿主微生物としては、バチルス・サブチリス等のバチルス属細菌、サッカロマイセス・セレビシエ等の酵母、アスペルギルス・ニガー等の糸状菌が挙げられるが、これらに限られず、異種タンパク質生産に適した宿主微生物であれば用いることができる。
本発明の変異αサブユニットもしくは変異ＣｙＧＤＨ複合体又はこれらを発現する微生物は、グルコースセンサの酵素電極、又はグルコースのアッセイキットの構成要素として用いることができる。ブルクホルデリア・セパシアの野生型ＧＤＨを用いたグルコースセンサ及びグルコースアッセイキットは、米国特許公開第２００４／００２３３３０Ａ１に記載されている。本発明の変異ＧＤＨも、同様にして使用することができる。
次に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
〔実施例１〕ブルクホルデリア・セパシアのＧＤＨまたはＣｙＧＤＨを発現するプラスミド
ブルクホルデリア・セパシアのＧＤＨを発現するプラスミドとして、ＧＤＨのαサブユニット及びγサブユニットを発現するプラスミド、並びに、ＣｙＧＤＨを発現するプラスミドとして、αサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットを発現するプラスミドを用意した。
ブルクホルデリア・セパシアのＧＤＨを発現するプラスミドとして、ＧＤＨのαサブユニット及びγサブユニットを発現するプラスミド、並びに、ＣｙＧＤＨを発現するプラスミドとして、αサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットを発現するプラスミドを用意した。
＜１＞ＧＤＨのαサブユニット及びγサブユニットを発現するプラスミド
αサブユニット及びγサブユニットを発現するプラスミドとしては、ＷＯ０２／０３６７７９（ＥＰ１３３１２７２Ａ１、ＵＳ２００４０２３３３０Ａ１、ＣＮ１４８４７０３Ａに対応）に記載のプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ／γ＋αを使用した。同プラスミドは、ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０６）染色体ＤＮＡから単離された、ＧＤＨ γサブユニット構造遺伝子とαサブユニット構造遺伝子を連続して含むＤＮＡ断片が、ベクターｐＴｒｃ９９Ａのクローニング部位であるＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩに挿入されてなるプラスミドである。本プラスミド中のＧＤＨγα遺伝子は、ｔｒｃプロモーターによって制御される。ｐＴｒｃ９９Ａ／γ＋αは、アンピシリン耐性遺伝子を保持している。
前記プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ／γ＋αを鋳型として、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲにより、ＧＤＨのαサブユニットＣ末端に６個のヒスチジン残基が付加されたＤＮＡ断片を含むプラスミド全体を増幅した。
αサブユニット及びγサブユニットを発現するプラスミドとしては、ＷＯ０２／０３６７７９（ＥＰ１３３１２７２Ａ１、ＵＳ２００４０２３３３０Ａ１、ＣＮ１４８４７０３Ａに対応）に記載のプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ／γ＋αを使用した。同プラスミドは、ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０６）染色体ＤＮＡから単離された、ＧＤＨ γサブユニット構造遺伝子とαサブユニット構造遺伝子を連続して含むＤＮＡ断片が、ベクターｐＴｒｃ９９Ａのクローニング部位であるＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩに挿入されてなるプラスミドである。本プラスミド中のＧＤＨγα遺伝子は、ｔｒｃプロモーターによって制御される。ｐＴｒｃ９９Ａ／γ＋αは、アンピシリン耐性遺伝子を保持している。
前記プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ／γ＋αを鋳型として、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲにより、ＧＤＨのαサブユニットＣ末端に６個のヒスチジン残基が付加されたＤＮＡ断片を含むプラスミド全体を増幅した。
〔フォワードプライマー〕
５’−ＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡＴＡＡＧＧＡＧＧＴＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＧＧＡＡＡＴＣＴＡＣ−３’（配列番号１７）
〔リバースプライマー〕
５’−ＡＧＣＣＴＧＴＧＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣＣＴＴＣＡＧＣＧＡＴＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ−３’（配列番号１８）
５’−ＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡＴＡＡＧＧＡＧＧＴＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＧＧＡＡＡＴＣＴＡＣ−３’（配列番号１７）
〔リバースプライマー〕
５’−ＡＧＣＣＴＧＴＧＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣＣＴＴＣＡＧＣＧＡＴＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ−３’（配列番号１８）
増幅した断片の両端を平滑末端化した後、５’末端をリン酸化し、ライゲーションによって環状化した。得られた組換えベクターでエシェリヒア・コリＤＨ５αを形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地で生じるコロニーを採取した。得られた形質転換体を液体のＬＢ培地で培養してプラスミドを抽出し、その挿入ＤＮＡ断片を解析したところ、約２．１ｋｂの挿入断片が確認された。本プラスミド中のＧＤＨの各構造遺伝子は、ｔｒｃプロモーターによって制御される。本プラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子を保持している。
＜２＞ＣｙＧＤＨのαサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットを発現するプラスミド
ＣｙＧＤＨのαサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットを発現するプラスミドは、以下のようにして調製した。
ＣｙＧＤＨのαサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットを発現するプラスミドは、以下のようにして調製した。
（１）ブルクホルデリア・セパシア ＫＳ１株からの染色体ＤＮＡの調製
ブルクホルデリア・セパシア ＫＳ１株より染色体遺伝子を常法に従って調製した。すなわち、同菌株をＴＬ液体倍地（ポリペプトン １０ｇ、酵母抽出液 １ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ、グルコース ５ｇ；１Ｌ、ｐＨ ７．２）を用いて、３４℃で一晩振盪した。増殖した菌体を遠心分離により回収した。この菌体を１０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む溶液に懸濁し、５０℃で６時間処理した。ここに等量のフェノール−クロロホルムを加えて室温で１０分間撹拌した後、遠心分離により上清を回収した。これに終濃度０．３Ｍになるように酢酸ナトリウムを加え、２倍量のエタノールを重層して中間層に染色体ＤＮＡを析出させた。これをガラス棒を用いてすくいとり、７０％エタノールで洗浄した後、適当量のＴＥバッファーに溶解させ、染色体ＤＮＡ溶液とした。
ブルクホルデリア・セパシア ＫＳ１株より染色体遺伝子を常法に従って調製した。すなわち、同菌株をＴＬ液体倍地（ポリペプトン １０ｇ、酵母抽出液 １ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ、グルコース ５ｇ；１Ｌ、ｐＨ ７．２）を用いて、３４℃で一晩振盪した。増殖した菌体を遠心分離により回収した。この菌体を１０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む溶液に懸濁し、５０℃で６時間処理した。ここに等量のフェノール−クロロホルムを加えて室温で１０分間撹拌した後、遠心分離により上清を回収した。これに終濃度０．３Ｍになるように酢酸ナトリウムを加え、２倍量のエタノールを重層して中間層に染色体ＤＮＡを析出させた。これをガラス棒を用いてすくいとり、７０％エタノールで洗浄した後、適当量のＴＥバッファーに溶解させ、染色体ＤＮＡ溶液とした。
（２）ＣｙＧＤＨのγサブユニット、αサブユニット及びβサブユニットをコードするＤＮＡ断片の調製
前記染色体ＤＮＡを鋳型として、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲにより、ＣｙＧＤＨのγサブユニット、αサブユニット及びβサブユニットをコードするＤＮＡ断片を増幅した。
前記染色体ＤＮＡを鋳型として、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲにより、ＣｙＧＤＨのγサブユニット、αサブユニット及びβサブユニットをコードするＤＮＡ断片を増幅した。
〔フォワードプライマー〕
５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＡＣＡＣＡＡＣＧＡＣＡＡＣＡＣ−３’（配列番号１９）〔リバースプライマー〕
５’−ＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＴＴＣＴＴＣＣＡＧＣＣＧＡＡＣＡＴＣＡＣ−３’（配列番号２０）
５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＡＣＡＣＡＡＣＧＡＣＡＡＣＡＣ−３’（配列番号１９）〔リバースプライマー〕
５’−ＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＴＴＣＴＴＣＣＡＧＣＣＧＡＡＣＡＴＣＡＣ−３’（配列番号２０）
増幅した断片のＣ末端側を平滑末端化した後、Ｎ末端側をＮｃｏＩで消化し、同様に処理したｐＴｒｃ９９Ａにライゲーションした。得られた組換えベクターでエシェリヒア・コリＤＨ５αを形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地で生じるコロニーを採取した。得られた形質転換体を液体のＬＢ培地で培養してプラスミドを抽出し、その挿入ＤＮＡ断片を解析したところ、約３．８ｋｂの挿入断片が確認された。本プラスミドをｐＴｒｃ９９Ａγαβと命名した。本プラスミド中のＣｙＧＤＨの各構造遺伝子は、ｔｒｃプロモーターによって制御される。ｐＴｒｃ９９Ａγαβは、アンピシリン耐性遺伝子及びカナマイシン耐性遺伝子を保持している。
〔実施例２〕ＣｙＧＤＨ αサブユニット遺伝子への変異導入による基質相互作用部位の探索
（１）３２６位、３６５位、および４７２位への変異導入
実施例１で得られたｐＴｒｃ９９Ａγαβに含まれるＧＤＨ αサブユニット遺伝子に、同遺伝子がコードするαサブユニットの３２６位のセリン残基、３６５位のセリン残基、および４７２位のアラニン残基を他のアミノ酸残基に置換されるように変異を導入した。
具体的には、市販の部位特異的変異導入キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ）を用いて、実施例１に記載のプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ／γ＋α及びｐＴｒｃ９９Ａγαβに含まれるＧＤＨ αサブユニット遺伝子の３２６位のセリンのコドン（ＴＣＧ）、３６５位のセリンのコドン（ＴＣＧ）、および４７２位のアラニンのコドン（ＧＣＧ）を他のアミノ酸のコドンに置換した。
（１）３２６位、３６５位、および４７２位への変異導入
実施例１で得られたｐＴｒｃ９９Ａγαβに含まれるＧＤＨ αサブユニット遺伝子に、同遺伝子がコードするαサブユニットの３２６位のセリン残基、３６５位のセリン残基、および４７２位のアラニン残基を他のアミノ酸残基に置換されるように変異を導入した。
具体的には、市販の部位特異的変異導入キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ）を用いて、実施例１に記載のプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ／γ＋α及びｐＴｒｃ９９Ａγαβに含まれるＧＤＨ αサブユニット遺伝子の３２６位のセリンのコドン（ＴＣＧ）、３６５位のセリンのコドン（ＴＣＧ）、および４７２位のアラニンのコドン（ＧＣＧ）を他のアミノ酸のコドンに置換した。
前記アミノ酸残基置換に用いたフォワードプライマーおよびリバースプライマーの配列を以下の表２に示す。また、３変異作製のために用いたリバースプライマーを表３に表す。
尚、変異を表す表記において、数字はアミノ酸配列における位置を、数字の前のアルファベットはアミノ酸置換前のアミノ酸残基を、数字の後のアルファベットはアミノ酸置換後のアミノ酸残基を示す。例えば、Ｒ５３Ｆは、５３位のアルギニンからフェニルアラニンへの置換を示す。
尚、変異を表す表記において、数字はアミノ酸配列における位置を、数字の前のアルファベットはアミノ酸置換前のアミノ酸残基を、数字の後のアルファベットはアミノ酸置換後のアミノ酸残基を示す。例えば、Ｒ５３Ｆは、５３位のアルギニンからフェニルアラニンへの置換を示す。
ＰＣＲ反応は、以下の反応組成で、９５℃、３０秒の後、９５℃ ３０秒、５５℃ １分、６８℃ ８分を１５サイクル繰り返し、６８℃ ３０分の反応を行った後、４℃で保持した。
〔反応液組成〕
鋳型ＤＮＡ（５ｎｇ／μｌ） ２μｌ
（３変異導入ｐＴｒｃ９９Ａ／γ＋α及びｐＴｒｃ９９Ａγαβ）
１０×反応緩衝液 ５μｌ
フォワードプライマー（１００ｎｇ／μｌ） １．２５μｌ
リバースプライマー（１００ｎｇ／μｌ） １．２５μｌ
ｄＮＴＰ １μｌ
蒸留水 ３８．５μｌ
ＤＮＡポリメラーゼ １μｌ
合計 ５０μｌ
鋳型ＤＮＡ（５ｎｇ／μｌ） ２μｌ
（３変異導入ｐＴｒｃ９９Ａ／γ＋α及びｐＴｒｃ９９Ａγαβ）
１０×反応緩衝液 ５μｌ
フォワードプライマー（１００ｎｇ／μｌ） １．２５μｌ
リバースプライマー（１００ｎｇ／μｌ） １．２５μｌ
ｄＮＴＰ １μｌ
蒸留水 ３８．５μｌ
ＤＮＡポリメラーゼ １μｌ
合計 ５０μｌ
ＰＣＲ反応の後、反応液にＤｐｎＩを０．５μｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートし、鋳型プラスミドを分解させた。
得られた反応液で、エシェリヒア・コリＤＨ５α（ｓｕｐＥ４４， ΔｌａｃＵ１６９（φ８０ｌａｃＺΔＭ１５）， ｈｓｄＲ１７， ｒｅｃＡｉ， ｅｎｄＡ１， ｇｙｒＡ９６， ｔｈｉ−１， ｒｅｌＡ１）のコンピンテントセルを形質転換した。アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地（バクトリプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１％、寒天１．５％）上に生育してきたコロニー数個からプラスミドＤＮＡを調製し、配列解析を行って、ＧＤＨ αサブユニット遺伝子に目的の変異が導入されたことを確認した。
得られた反応液で、エシェリヒア・コリＤＨ５α（ｓｕｐＥ４４， ΔｌａｃＵ１６９（φ８０ｌａｃＺΔＭ１５）， ｈｓｄＲ１７， ｒｅｃＡｉ， ｅｎｄＡ１， ｇｙｒＡ９６， ｔｈｉ−１， ｒｅｌＡ１）のコンピンテントセルを形質転換した。アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地（バクトリプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１％、寒天１．５％）上に生育してきたコロニー数個からプラスミドＤＮＡを調製し、配列解析を行って、ＧＤＨ αサブユニット遺伝子に目的の変異が導入されたことを確認した。
〔実施例３〕変異ＧＤＨの基質特異性の解析
実施例２で得られた変異ＧＤＨ発現プラスミドを用いて、変異ＧＤＨを製造し、基質特異性を検討した。
実施例２で得られた変異ＧＤＨ発現プラスミドを用いて、変異ＧＤＨを製造し、基質特異性を検討した。
（１）培養
変異導入したエシェリヒア・コリＤＨ５α株を、各々２ｍｌのＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ及びカナマイシン３０μｇ／ｍｌ含有）で、Ｌ字管を用いて３７℃で一晩振とう培養した。それらの培養液を、１５０ｍｌのＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌおよびカナマイシン３０μｇ／ｍｌ含有）を含む５００ｍｌの坂口フラスコに植菌し、３７℃で振とう培養した。培養開始から３時間後にＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を終濃度０．１ｍＭになるように添加し、さらに２時間培養した。
変異導入したエシェリヒア・コリＤＨ５α株を、各々２ｍｌのＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ及びカナマイシン３０μｇ／ｍｌ含有）で、Ｌ字管を用いて３７℃で一晩振とう培養した。それらの培養液を、１５０ｍｌのＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌおよびカナマイシン３０μｇ／ｍｌ含有）を含む５００ｍｌの坂口フラスコに植菌し、３７℃で振とう培養した。培養開始から３時間後にＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を終濃度０．１ｍＭになるように添加し、さらに２時間培養した。
（２）粗酵素サンプルの調製
前記で培養した培養液から菌体を集め、洗浄後、湿菌体０．３ｍｇあたり１ｍｌの０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を含む１０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ＰＰＢ）（ｐＨ７．０）で菌体を懸濁し、超音波破砕した。この懸濁液遠心分離（１００００ｒ．ｐ．ｍ、１０分、４℃）して残渣を除去した後、上清を超遠心分離（５０，０００ｒ．ｐ．ｍ．、６０分、４℃）し、得られた上清（水溶性画分）を、粗酵素サンプルとした。また、このサンプルを、通常の疎水性クロマトグラフィー（カラム名：オクチルセファロース（アマシャム・バイオサイエンス製）およびイオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−セファロース（アマシャム・バイオサイエンス製）により精製して、精製酵素サンプルを得た。目的とする酵素画分の決定は、ＧＤＨ活性を指標として行った。
前記で培養した培養液から菌体を集め、洗浄後、湿菌体０．３ｍｇあたり１ｍｌの０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を含む１０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ＰＰＢ）（ｐＨ７．０）で菌体を懸濁し、超音波破砕した。この懸濁液遠心分離（１００００ｒ．ｐ．ｍ、１０分、４℃）して残渣を除去した後、上清を超遠心分離（５０，０００ｒ．ｐ．ｍ．、６０分、４℃）し、得られた上清（水溶性画分）を、粗酵素サンプルとした。また、このサンプルを、通常の疎水性クロマトグラフィー（カラム名：オクチルセファロース（アマシャム・バイオサイエンス製）およびイオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−セファロース（アマシャム・バイオサイエンス製）により精製して、精製酵素サンプルを得た。目的とする酵素画分の決定は、ＧＤＨ活性を指標として行った。
なお、Ｈｉｓｔａｇを有するタンパク質の精製は、以下のようにして行った。
培養した培養液から菌体を集め、洗浄後、湿菌体０．３ｍｇあたり１ｍｌの０．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）で菌体を懸濁し、超音波破砕した。この懸濁液遠心分離（１００００ｒ．ｐ．ｍ、１０分、４℃）して残渣を除去した後、上清を超遠心分離（５０，０００ｒ．ｐ．ｍ．、６０分、４℃）し、得られた上清（水溶性画分）を、粗酵素サンプルとした。このサンプルを、０．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）で平衡化したHistrap FFカラム（アマシャム・バイオサイエンス製）に添加し、０．５Ｍ塩化ナトリウム、６０ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）で洗浄した後、０．５Ｍ塩化ナトリウム、１５０ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）で溶出させ、精製酵素サンプルを得た。目的とする酵素画分の決定は、ＧＤＨ活性を指標として行った。
培養した培養液から菌体を集め、洗浄後、湿菌体０．３ｍｇあたり１ｍｌの０．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）で菌体を懸濁し、超音波破砕した。この懸濁液遠心分離（１００００ｒ．ｐ．ｍ、１０分、４℃）して残渣を除去した後、上清を超遠心分離（５０，０００ｒ．ｐ．ｍ．、６０分、４℃）し、得られた上清（水溶性画分）を、粗酵素サンプルとした。このサンプルを、０．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）で平衡化したHistrap FFカラム（アマシャム・バイオサイエンス製）に添加し、０．５Ｍ塩化ナトリウム、６０ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）で洗浄した後、０．５Ｍ塩化ナトリウム、１５０ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）で溶出させ、精製酵素サンプルを得た。目的とする酵素画分の決定は、ＧＤＨ活性を指標として行った。
（３）ＧＤＨ活性の測定
前記粗酵素サンプル８μｌに、活性測定用試薬（１２μｌの６００ｍＭ メチルフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、１２０μｌの６ ｍＭ ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）に、０．２（ｗ／ｖ）％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １０ｍＭ ＰＰＢを加え、全量４８０μｌとした溶液）を８μｌ添加した。これをアルミブロック恒温槽を用いて、各反応温度で１分間プレインキュベートした後、素早く各濃度の基質（グルコース又はマルトース）、または蒸留水を８μｌ加えて攪拌し、分光光度計を用いてＤＣＩＰ由来の吸収波長である６００ ｎｍの吸光度を測定した。各試薬の終濃度はＤＣＩＰ：０．０６ｍＭ、ＰＭＳ、０．６ｍＭ。基質の終濃度は１０ｍＭまたは５ｍＭである。
結果を、表４に示す。尚、野生型ＧＤＨの反応比は、１０ｍＭまたは５ｍＭの基質濃度において、それぞれ２３．３２％および１８．８８％であった。
前記粗酵素サンプル８μｌに、活性測定用試薬（１２μｌの６００ｍＭ メチルフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、１２０μｌの６ ｍＭ ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）に、０．２（ｗ／ｖ）％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １０ｍＭ ＰＰＢを加え、全量４８０μｌとした溶液）を８μｌ添加した。これをアルミブロック恒温槽を用いて、各反応温度で１分間プレインキュベートした後、素早く各濃度の基質（グルコース又はマルトース）、または蒸留水を８μｌ加えて攪拌し、分光光度計を用いてＤＣＩＰ由来の吸収波長である６００ ｎｍの吸光度を測定した。各試薬の終濃度はＤＣＩＰ：０．０６ｍＭ、ＰＭＳ、０．６ｍＭ。基質の終濃度は１０ｍＭまたは５ｍＭである。
結果を、表４に示す。尚、野生型ＧＤＨの反応比は、１０ｍＭまたは５ｍＭの基質濃度において、それぞれ２３．３２％および１８．８８％であった。
表中、ＱＹＡは、３２６位および３６５位に相当するアミノ酸残基がそれぞれグルタミンおよびチロシンで置換されているが、４７２位は置換されていない（すなわちアラニン残基のままである）変異グルコース脱水素酵素（すなわち、ＧＤＨ（ＱＹ））を示す。
この結果、３２６Ｇｌｕ＋３６５Ａｒｇ＋４７２Ｔｙｒ、３２６Ｇｌｎ＋３６５Ｔｙｒ＋４７２Ａｒｇ、３２６Ｌｙｓ＋３６５Ｔｙｒ＋４７２Ｔｈｒ、３２６Ｉｌｅ＋３６５Ｐｈｅ＋４７２Ｌｙｓ、３２６Ａｒｇ＋３６５Ａｒｇ＋４７２Ｔｙｒ、３２６Ｌｙｓ＋３６５Ｔｙｒ＋４７２Ａｒｇ、３２６Ｌｙｓ＋３６５Ｔｙｒ＋４７２Ｓｅｒ、３２６Ｇｌｎ＋３６５Ｔｙｒ＋４７２Ｔｙｒが、グルコースに対する反応性を維持しつつ、マルトースとの反応性が低下する大変効果の高い変異であった。
すなわち、３２６位、３６５位、および４７２位の３箇所の変異の組み合わせのうちいくつかの組み合わせにおいて、変異ＧＤＨ（ＱＹ）と同等またはそれ以上の相乗効果が確認された。
すなわち、３２６位、３６５位、および４７２位の３箇所の変異の組み合わせのうちいくつかの組み合わせにおいて、変異ＧＤＨ（ＱＹ）と同等またはそれ以上の相乗効果が確認された。
〔実施例４〕精製酵素の調製（αサブユニットおよびγサブユニットの複合体）
実施例３で基質特異性の改善が認められた８つの変異ＧＤＨについて精製を実施した。方法は実施例３に記載の通りに行なった。各精製酵素のグルコースおよびマルトースに対する比活性（Ｕ／ｍｇ）、反応比（マルトースに対する比活性／グルコースに対する比活性）、グルコースに対するＫｍ値およびＶｍａｘを表５に示す。
その結果、ＱＹＡのマルトースとの反応比が、１０ｍＭおよび５ｍＭにおいて、それぞれ１％台であるのに対し、ＥＲＹおよびＫＹＴでは、反応比が１％以下まで低下し、ＱＹＹでは、マルトースとの反応比が０．３％台まで低下していた。
実施例３で基質特異性の改善が認められた８つの変異ＧＤＨについて精製を実施した。方法は実施例３に記載の通りに行なった。各精製酵素のグルコースおよびマルトースに対する比活性（Ｕ／ｍｇ）、反応比（マルトースに対する比活性／グルコースに対する比活性）、グルコースに対するＫｍ値およびＶｍａｘを表５に示す。
その結果、ＱＹＡのマルトースとの反応比が、１０ｍＭおよび５ｍＭにおいて、それぞれ１％台であるのに対し、ＥＲＹおよびＫＹＴでは、反応比が１％以下まで低下し、ＱＹＹでは、マルトースとの反応比が０．３％台まで低下していた。
〔実施例５〕精製酵素の調製（αサブユニット、βサブユニット、およびγサブユニットの複合体）
実施例３で基質特異性の改善が認められた変異ＣｙＧＤＨ（ＱＹＹ）について精製を実施した。方法は実施例３に記載の通りに行なった。各精製酵素のグルコースに対する比活性（Ｕ／ｍｇ）を表６に示す。
その結果、αサブユニット、βサブユニット、およびγサブユニットの複合体の形態においては、ＱＹＹ（３２６Ｇｌｎ＋３６５Ｔｙｒ＋４７２Ｔｙｒ）は、ＱＹＡ（３２６Ｇｌｎ＋３６５Ｔｙｒ）と比較して、マルトースとの反応性が約１／２〜１／３に低下していた。
実施例３で基質特異性の改善が認められた変異ＣｙＧＤＨ（ＱＹＹ）について精製を実施した。方法は実施例３に記載の通りに行なった。各精製酵素のグルコースに対する比活性（Ｕ／ｍｇ）を表６に示す。
その結果、αサブユニット、βサブユニット、およびγサブユニットの複合体の形態においては、ＱＹＹ（３２６Ｇｌｎ＋３６５Ｔｙｒ＋４７２Ｔｙｒ）は、ＱＹＡ（３２６Ｇｌｎ＋３６５Ｔｙｒ）と比較して、マルトースとの反応性が約１／２〜１／３に低下していた。
〔実施例６〕変異酵素（ＱＹＸ変異）の基質特異性の解析
実施例２と同様にして、ｐＴｒｃ９９Ａ／γ＋αに含まれるＧＤＨ αサブユニット遺伝子に、同遺伝子がコードするαサブユニットの３２６位のセリン残基および３６５位のセリン残基をそれぞれグルタミンおよびチロシンに置換されるように、そして４７２位のアラニン残基を他のアミノ酸残基に置換されるように変異を導入した。得られた変異酵素発現プラスミドを用いて、実施例３と同様にして、変異酵素を製造し、基質特異性を検討した。結果を以下の表７に示す。
実施例２と同様にして、ｐＴｒｃ９９Ａ／γ＋αに含まれるＧＤＨ αサブユニット遺伝子に、同遺伝子がコードするαサブユニットの３２６位のセリン残基および３６５位のセリン残基をそれぞれグルタミンおよびチロシンに置換されるように、そして４７２位のアラニン残基を他のアミノ酸残基に置換されるように変異を導入した。得られた変異酵素発現プラスミドを用いて、実施例３と同様にして、変異酵素を製造し、基質特異性を検討した。結果を以下の表７に示す。
その結果、ＱＹＤ、ＱＹＧ、ＱＹＫ、ＱＹＬ、ＱＹＰ、ＱＹＱ、ＱＹＲ、ＱＹＴ、ＱＹＶ、およびＱＹＹが、グルコースに対する反応性を維持しつつ、マルトースとの反応性が低下する変異であることが認められた。
［実施例７］精製酵素の調製（αサブユニットおよびγサブユニットの複合体）
実施例６で基質特異性の改善が認められた１０種類の変異ＧＤＨ（ＱＹＤ、ＱＹＧ、ＱＹＫ、ＱＹＬ、ＱＹＰ、ＱＹＱ、ＱＹＲ、ＱＹＴ、ＱＹＶ、およびＱＹＹ）について精製を実施した。方法は実施例３に記載の通りに行なった。各精製酵素のグルコースおよびマルトースに対する比活性（Ｕ／ｍｇ）、反応比（マルトースに対する比活性／グルコースに対する比活性）、グルコースに対するＫｍ値およびＶｍａｘを表８に示す。
その結果、いずれの変異ＧＤＨについてもマルトースとの反応比は低いものの、ＱＹＹを除いて酵素活性が低下しており、グルコース濃度の測定には適していないことが示唆される。すなわち、ＱＹＸで示される１０種類の変異ＧＤＨのうちで、ＱＹＹが最もグルコース濃度の測定に適していることが示唆される。
実施例６で基質特異性の改善が認められた１０種類の変異ＧＤＨ（ＱＹＤ、ＱＹＧ、ＱＹＫ、ＱＹＬ、ＱＹＰ、ＱＹＱ、ＱＹＲ、ＱＹＴ、ＱＹＶ、およびＱＹＹ）について精製を実施した。方法は実施例３に記載の通りに行なった。各精製酵素のグルコースおよびマルトースに対する比活性（Ｕ／ｍｇ）、反応比（マルトースに対する比活性／グルコースに対する比活性）、グルコースに対するＫｍ値およびＶｍａｘを表８に示す。
その結果、いずれの変異ＧＤＨについてもマルトースとの反応比は低いものの、ＱＹＹを除いて酵素活性が低下しており、グルコース濃度の測定には適していないことが示唆される。すなわち、ＱＹＸで示される１０種類の変異ＧＤＨのうちで、ＱＹＹが最もグルコース濃度の測定に適していることが示唆される。
〔実施例８〕変異ＣｙＧＤＨを用いた血糖測定用比色式センサの作製
最も比活性が優れていたＱＹＹに関して、実施例５で得られた精製変異酵素を用いてグルコースセンサを作製した。
最も比活性が優れていたＱＹＹに関して、実施例５で得られた精製変異酵素を用いてグルコースセンサを作製した。
図１に示す基本構成を有するグルコースセンサを作製した。すなわち、前記グルコースセンサは、透明基板２に対してスペーサー３を介して透明カバー４（材質ＰＥＴ）を積層した形態を有し、各要素２〜４によってキャピラリ５が規定されている。キャピラリ５の寸法は、１．３ｍｍ×９ｍｍ×５０μｍである（図１）。透明基板２および透明カバー４は、厚みが２５０μｍであるＰＥＴにより形成し、スペーサー３は黒色の両面テープにより構成した。
グルコースセンサは、図２に示す第１試薬部〜第３試薬部を有し、それぞれ成分及び塗布量を表９に示す。表中、「Ｒｕ」は、ヘキサルテニウムアンミン錯体（Ｒｕ（ＮＨ3）6Ｃｌ3）を、ＡＣＥＳはＮ−（２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄを、ＷＳＴ−４は２−Ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｙｌ−３−（４−ｃａｒｂｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−［４−（２−ｓｕｌｆｏｅｔｈｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍを、ＳＷＮはＬｉｔｈｉｕｍ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｓｏｄｉｕｍ Ｓｉｌｉｃａｔｅを、各々示す。
上記グルコースセンサのキャピラリに測定試料を供給し、その時点から５秒後のエンドポイントの吸光度をプロットした。各回の吸光度の測定においては、第３試薬部に対して、キャピラリの高さ方向に沿って光を照射し、そのときにグルコースセンサを透過した光を受光した。光の照射は、発光ダイオードを用いて６３０ｎｍの光を照射することにより行なった。透過光は、フォトダイオードにおいて受光した。
マルトース影響に関してであるが、グルコース５０ｍｇ／ｄｌにマルトースを添加した場合、野生型ではマルトース濃度に依存して吸光度が大きく増加し、マルトースと強く反応していることが示唆される。一方、変異ＣｙＧＤＨ（ＱＹ）を用いたセンサでは、マルトース濃度に応じた吸光度の増加が抑えられており、マルトースの影響が少なくなっていることがわかる。変異ＣｙＧＤＨ（ＱＹＹ）を用いたセンサでは、さらに、マルトース濃度に応じた吸光度の増加が抑えられており、マルトースの影響が少なくなっていることがわかる。これらのデータを見かけの血糖上昇値に換算した結果を図３に示す。
野生型酵素を用いたセンサでは、低血糖（５０ｍｇ／ｄｌグルコース）がマルトースの混入によって正常域以上の（１７４．８ｍｇ／ｄｌグルコース）に見かけ上表示されてしまう（変化率は３００％）。また、改変ＣｙＧＤＨ（ＱＹ）を用いたセンサであっても、マルトースの混入によって６４．８ｍｇ／ｄｌグルコースに見かけ上表示されてしまう（変化率は５４％）。一方、改変ＣｙＧＤＨ（ＱＹＹ）を用いたセンサでは、マルトースが最大３００ｍｇ／ｄｌ混入している場合でも、見かけの血糖値が最大でも４６．１ｍｇ／ｄｌまでしか上昇せず、影響は大幅に押さえられていると言える（変化率は１４％）。結論としてはＱＹＹ変異体が、グルコースに対する反応性（直線性）とマルトース影響の観点から最適であることが示唆される。
野生型酵素を用いたセンサでは、低血糖（５０ｍｇ／ｄｌグルコース）がマルトースの混入によって正常域以上の（１７４．８ｍｇ／ｄｌグルコース）に見かけ上表示されてしまう（変化率は３００％）。また、改変ＣｙＧＤＨ（ＱＹ）を用いたセンサであっても、マルトースの混入によって６４．８ｍｇ／ｄｌグルコースに見かけ上表示されてしまう（変化率は５４％）。一方、改変ＣｙＧＤＨ（ＱＹＹ）を用いたセンサでは、マルトースが最大３００ｍｇ／ｄｌ混入している場合でも、見かけの血糖値が最大でも４６．１ｍｇ／ｄｌまでしか上昇せず、影響は大幅に押さえられていると言える（変化率は１４％）。結論としてはＱＹＹ変異体が、グルコースに対する反応性（直線性）とマルトース影響の観点から最適であることが示唆される。
以上の結果から明らかなように、変異ＣｙＧＤＨ（ＱＹＹ）を用いたグルコースセンサは、変異ＣｙＧＤＨ（ＱＹ）を用いたグルコースセンサよりも、マルトースとの反応性が大きく低下している。この変異ＣｙＧＤＨ（ＱＹＹ）を用いたグルコースセンサを用いれば、病院等で投与される血中マルトース濃度の上限値である２００ｍｇ／ｄｌにおいては正誤差は無いと言え、上限値以上の３００ｍｇ／ｄｌにおいても低血糖（５０ｍｇ／ｄｌ以下）が正常値や高血糖と判定されること無く、安全な治療が行なえる。
〔実施例９〕変異ＣｙＧＤＨを用いた電極式血糖センサの作製
最も比活性が優れていたＱＹＹに関して、実施例５で得られた精製変異酵素を用いて電極式グルコースセンサを作製した。
最も比活性が優れていたＱＹＹに関して、実施例５で得られた精製変異酵素を用いて電極式グルコースセンサを作製した。
（作製手順）
電極式グルコースセンサの作製方法を、図５を参照して以下に示す。絶縁基板１として、ＰＥＴ製基板（長さ２８ｍｍ、幅７ｍｍ、厚み２５０μｍ）を準備し、その一方の表面に、カーボンインクのスクリーン印刷により、リード部２および３をそれぞれ有する作用極４および対極５からなるカーボン電極系を形成した。つぎに、絶縁性ペーストを調製し、これを前記電極上にスクリーン印刷して絶縁層６とし、前記絶縁層を形成しない部分を検出部およびリード部とした。次に、合成スメクタイトである商品名「ルーセンタイトＳＷＮ」（コープケミカル社製）０．６ｇを精製水１００ｍＬに懸濁し、約８〜２４時間攪拌した。この合成スメクタイト懸濁液１０ｍＬに、１０％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ（同仁化学研究所製）水溶液０．１ｍＬ、１．０Ｍ ＡＣＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４：同仁化学研究所製）５．０ｍＬおよび精製水４．０ｍＬをこの順序で添加し、さらにメディエータとして［Ｒｕ（ＮＨ3）6］Ｃｌ3（アルドリッチ社製）１．０ｇを混合した。この混合液１．０μＬを、検出部に分注した。そして、これを、３０℃、相対湿度１０％の条件下で１０分間乾燥させて、試薬層７を形成した。さらに、前記試薬層７上に酵素試薬層８を形成した。これは、２７００Ｕ／ｍＬの本願発明のグルコース脱水素酵素水溶液１．０μＬを、検出部の試薬層の上に分注して、３０℃、相対湿度１０％の条件下で１０分間乾燥させて形成した。最後に、スリット１５を有するスペーサー１１を絶縁層上に配置し、さらに、前記スペーサー上に空気孔１４となる貫通孔を有するカバー１２を配置してバイオセンサを作製した。
電極式グルコースセンサの作製方法を、図５を参照して以下に示す。絶縁基板１として、ＰＥＴ製基板（長さ２８ｍｍ、幅７ｍｍ、厚み２５０μｍ）を準備し、その一方の表面に、カーボンインクのスクリーン印刷により、リード部２および３をそれぞれ有する作用極４および対極５からなるカーボン電極系を形成した。つぎに、絶縁性ペーストを調製し、これを前記電極上にスクリーン印刷して絶縁層６とし、前記絶縁層を形成しない部分を検出部およびリード部とした。次に、合成スメクタイトである商品名「ルーセンタイトＳＷＮ」（コープケミカル社製）０．６ｇを精製水１００ｍＬに懸濁し、約８〜２４時間攪拌した。この合成スメクタイト懸濁液１０ｍＬに、１０％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ（同仁化学研究所製）水溶液０．１ｍＬ、１．０Ｍ ＡＣＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４：同仁化学研究所製）５．０ｍＬおよび精製水４．０ｍＬをこの順序で添加し、さらにメディエータとして［Ｒｕ（ＮＨ3）6］Ｃｌ3（アルドリッチ社製）１．０ｇを混合した。この混合液１．０μＬを、検出部に分注した。そして、これを、３０℃、相対湿度１０％の条件下で１０分間乾燥させて、試薬層７を形成した。さらに、前記試薬層７上に酵素試薬層８を形成した。これは、２７００Ｕ／ｍＬの本願発明のグルコース脱水素酵素水溶液１．０μＬを、検出部の試薬層の上に分注して、３０℃、相対湿度１０％の条件下で１０分間乾燥させて形成した。最後に、スリット１５を有するスペーサー１１を絶縁層上に配置し、さらに、前記スペーサー上に空気孔１４となる貫通孔を有するカバー１２を配置してバイオセンサを作製した。
マルトース影響に関してであるが、グルコース５０ｍｇ／ｄｌにマルトースを添加した場合、野生型ではマルトース濃度に依存して電流値が大きく増加し、マルトースと強く反応していることが示唆される。一方、変異ＣｙＧＤＨ（ＱＹ）を用いたセンサでは、マルトース濃度に応じた電流値の増加が抑えられており、マルトースの影響が少なくなっていることがわかる。変異ＣｙＧＤＨ（ＱＹＹ）を用いたセンサでは、さらに、マルトース濃度に応じた電流値の増加が抑えられており、マルトースの影響が少なくなっていることがわかる。これらのデータを見かけの血糖上昇値に換算した結果を図４に示す。
野生型酵素を用いたセンサでは、低血糖（５０ｍｇ／ｄｌグルコース）がマルトースの混入によって正常域以上の（２８８．２ｍｇ／ｄｌグルコース）に見かけ上表示されてしまう（変化率は５４９％）。また、改変ＣｙＧＤＨ（ＱＹ）を用いたセンサであっても、マルトースの混入によって９３．９ｍｇ／ｄｌグルコースに見かけ上表示されてしまう（変化率は１１４％）。一方、改変ＣｙＧＤＨ（ＱＹＹ）を用いたセンサでは、マルトースが最大３００ｍｇ／ｄｌ混入している場合でも、見かけの血糖値が最大でも６０．０ｍｇ／ｄｌまでしか上昇せず、影響は大幅に押さえられていると言える（変化率は３７％）。結論としてはＱＹＹ変異体が、グルコースに対する反応性（直線性）とマルトース影響の観点から最適であることが示唆される。
野生型酵素を用いたセンサでは、低血糖（５０ｍｇ／ｄｌグルコース）がマルトースの混入によって正常域以上の（２８８．２ｍｇ／ｄｌグルコース）に見かけ上表示されてしまう（変化率は５４９％）。また、改変ＣｙＧＤＨ（ＱＹ）を用いたセンサであっても、マルトースの混入によって９３．９ｍｇ／ｄｌグルコースに見かけ上表示されてしまう（変化率は１１４％）。一方、改変ＣｙＧＤＨ（ＱＹＹ）を用いたセンサでは、マルトースが最大３００ｍｇ／ｄｌ混入している場合でも、見かけの血糖値が最大でも６０．０ｍｇ／ｄｌまでしか上昇せず、影響は大幅に押さえられていると言える（変化率は３７％）。結論としてはＱＹＹ変異体が、グルコースに対する反応性（直線性）とマルトース影響の観点から最適であることが示唆される。
以上の結果から明らかなように、変異ＣｙＧＤＨ（ＱＹＹ）を用いたグルコースセンサは、変異ＣｙＧＤＨ（ＱＹ）を用いたグルコースセンサよりも、マルトースとの反応性が大きく低下している。この変異ＣｙＧＤＨ（ＱＹＹ）を用いたグルコースセンサを用いれば、病院等で投与される血中マルトース濃度の上限値である２００ｍｇ／ｄｌにおいては正誤差は無いと言え、上限値以上の３００ｍｇ／ｄｌにおいても低血糖（５０ｍｇ／ｄｌ以下）が正常値や高血糖と判定されること無く、安全な治療が行なえる。
〔実施例１０〕ＧＤＨホモログへの変異導入
実施例１と同様にして、ブルクホルデリア・セノセパシアＪ２３１５株のputative oxidoreductase、ブルクホルデリア・タイランデンシスＴＸＤＯＨ株のhypothetical protein BthaT#07876、ラルストニア・ピッケティ１２Ｄ株のFAD dependent oxidoreductase、ラルストニア・ソラナセアラムＩＰＯ１６０９株のtransmembrane dehydrogenaseおよびブルクホルデリア・フィトフィルマンスＰｓＪＮ株のglucose-methanol-choline oxidoreductaseの各αサブユニットおよびγサブユニットを発現するプラスミドを用意した。
実施例１と同様にして、ブルクホルデリア・セノセパシアＪ２３１５株のputative oxidoreductase、ブルクホルデリア・タイランデンシスＴＸＤＯＨ株のhypothetical protein BthaT#07876、ラルストニア・ピッケティ１２Ｄ株のFAD dependent oxidoreductase、ラルストニア・ソラナセアラムＩＰＯ１６０９株のtransmembrane dehydrogenaseおよびブルクホルデリア・フィトフィルマンスＰｓＪＮ株のglucose-methanol-choline oxidoreductaseの各αサブユニットおよびγサブユニットを発現するプラスミドを用意した。
これらの発現プラスミドはγサブユニット構造遺伝子とαサブユニット構造遺伝子を連続して含むＤＮＡ断片が、ベクターｐＥＴ３０ｃ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のクローニング部位であるＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩに挿入されてなるプラスミドである。本プラスミド中のγα遺伝子は、Ｔ７プロモーターによって制御される。本プラスミドは、カナマイシン耐性遺伝子を保持している。
上記プラスミドに含まれるαサブユニット遺伝子に対し、ブルクホリデリア・セパシアＫＳ１株の野生型ＧＤＨ αサブユニットにおける３２６位、３６５位、および４７２位に相当する残基がそれぞれグルタミン、チロシン、チロシンに置換されるように、市販の部位特異的変異導入キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ）を用いて変異を導入した。
前記アミノ酸残基置換に用いたフォワードプライマーの配列を以下に示す。リバースプライマーの配列は、フォワードプライマーの完全相補鎖とした。
尚、変異を表す表記において、数字はアミノ酸配列における位置を、数字の前のアルファベットはアミノ酸置換前のアミノ酸残基を、数字の後のアルファベットはアミノ酸置換後のアミノ酸残基を示す。例えば、Ｒ５３Ｆは、５３位のアルギニンからフェニルアラニンへの置換を示す。
尚、変異を表す表記において、数字はアミノ酸配列における位置を、数字の前のアルファベットはアミノ酸置換前のアミノ酸残基を、数字の後のアルファベットはアミノ酸置換後のアミノ酸残基を示す。例えば、Ｒ５３Ｆは、５３位のアルギニンからフェニルアラニンへの置換を示す。
ＰＣＲ反応は、以下の反応組成で、９５℃、３０秒の後、９５℃ ３０秒、５５℃ １分、６８℃ ８分を１５サイクル繰り返し、６８℃ ３０分の反応を行った後、４℃で保持した。
〔反応液組成〕
鋳型ＤＮＡ（５ｎｇ／μｌ） ２μｌ
（３変異導入ｐＴｒｃ９９Ａ／γ＋α及びｐＴｒｃ９９Ａγαβ）
１０×反応緩衝液 ５μｌ
フォワードプライマー（１００ｎｇ／μｌ） １．２５μｌ
リバースプライマー（１００ｎｇ／μｌ） １．２５μｌ
ｄＮＴＰ １μｌ
蒸留水 ３８．５μｌ
ＤＮＡポリメラーゼ １μｌ
合計 ５０μｌ
鋳型ＤＮＡ（５ｎｇ／μｌ） ２μｌ
（３変異導入ｐＴｒｃ９９Ａ／γ＋α及びｐＴｒｃ９９Ａγαβ）
１０×反応緩衝液 ５μｌ
フォワードプライマー（１００ｎｇ／μｌ） １．２５μｌ
リバースプライマー（１００ｎｇ／μｌ） １．２５μｌ
ｄＮＴＰ １μｌ
蒸留水 ３８．５μｌ
ＤＮＡポリメラーゼ １μｌ
合計 ５０μｌ
ＰＣＲ反応の後、反応液にＤｐｎＩを０．５μｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートし、鋳型プラスミドを分解させた。
得られた反応液で、エシェリヒア・コリＤＨ５α（ｓｕｐＥ４４， ΔｌａｃＵ１６９（φ８０ｌａｃＺΔＭ１５）， ｈｓｄＲ１７， ｒｅｃＡｉ， ｅｎｄＡ１， ｇｙｒＡ９６， ｔｈｉ−１， ｒｅｌＡ１）のコンピンテントセルを形質転換した。アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地（バクトリプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１％、寒天１．５％）上に生育してきたコロニー数個からプラスミドＤＮＡを調製し、配列解析を行って、各αサブユニット遺伝子に目的の変異が導入されたことを確認した。
得られた反応液で、エシェリヒア・コリＤＨ５α（ｓｕｐＥ４４， ΔｌａｃＵ１６９（φ８０ｌａｃＺΔＭ１５）， ｈｓｄＲ１７， ｒｅｃＡｉ， ｅｎｄＡ１， ｇｙｒＡ９６， ｔｈｉ−１， ｒｅｌＡ１）のコンピンテントセルを形質転換した。アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地（バクトリプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１％、寒天１．５％）上に生育してきたコロニー数個からプラスミドＤＮＡを調製し、配列解析を行って、各αサブユニット遺伝子に目的の変異が導入されたことを確認した。
〔実施例１１〕変異酵素の基質特異性の解析
実施例１０で得られた変異酵素発現プラスミドを用いて、変異酵素を製造し、基質特異性を検討した。
実施例１０で得られた変異酵素発現プラスミドを用いて、変異酵素を製造し、基質特異性を検討した。
（１）培養
変異酵素発現プラスミドでエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｆ−, ｄｃｍ, ｏｍｐＴ, ｈｓｄＳ（ｒＢ− ｍＢ−）, ｇａｌ, λ（ＤＥ３））のコンピンテントセルを形質転換した。得られた形質転換体を各々３ｍｌのＬＢ培地（カナマイシン２５μｇ／ｍｌ含有）で、Ｌ字管を用いて３７℃で一晩振とう培養した。それらの培養液を、１００ｍｌのＬＢ培地（０．５％グリセロール、０．０５％グルコース、０．２％ラクトース、１００ｍＭ ＰＯ4、 ２５ｍＭ ＳＯ4、５０ｍＭ ＮＨ4、１００ｍＭ Ｎａ、５０ｍＭ Ｋ、１ｍＭ ＭｇＳＯ4およびカナマイシン２５μｇ／ｍｌ含有）を含む５００ｍｌの坂口フラスコに植菌し、２０℃で２４時間振とう培養した。
変異酵素発現プラスミドでエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｆ−, ｄｃｍ, ｏｍｐＴ, ｈｓｄＳ（ｒＢ− ｍＢ−）, ｇａｌ, λ（ＤＥ３））のコンピンテントセルを形質転換した。得られた形質転換体を各々３ｍｌのＬＢ培地（カナマイシン２５μｇ／ｍｌ含有）で、Ｌ字管を用いて３７℃で一晩振とう培養した。それらの培養液を、１００ｍｌのＬＢ培地（０．５％グリセロール、０．０５％グルコース、０．２％ラクトース、１００ｍＭ ＰＯ4、 ２５ｍＭ ＳＯ4、５０ｍＭ ＮＨ4、１００ｍＭ Ｎａ、５０ｍＭ Ｋ、１ｍＭ ＭｇＳＯ4およびカナマイシン２５μｇ／ｍｌ含有）を含む５００ｍｌの坂口フラスコに植菌し、２０℃で２４時間振とう培養した。
（２）粗酵素サンプルの調製
前記で培養した培養液から菌体を集め、洗浄後、湿菌体０．１ｇあたり１ｍｌの１０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ＰＰＢ）（ｐＨ７．０）で菌体を懸濁し、超音波破砕した。この懸濁液を遠心分離（１００００ｒ．ｐ．ｍ、１０分、４℃）して残渣を除去した後、上清を超遠心分離（５０，０００ｒ．ｐ．ｍ．、６０分、４℃）し、得られた上清（水溶性画分）を、粗酵素サンプルとした。
前記で培養した培養液から菌体を集め、洗浄後、湿菌体０．１ｇあたり１ｍｌの１０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ＰＰＢ）（ｐＨ７．０）で菌体を懸濁し、超音波破砕した。この懸濁液を遠心分離（１００００ｒ．ｐ．ｍ、１０分、４℃）して残渣を除去した後、上清を超遠心分離（５０，０００ｒ．ｐ．ｍ．、６０分、４℃）し、得られた上清（水溶性画分）を、粗酵素サンプルとした。
（３）ＧＤＨ活性の測定
前記粗酵素サンプル１０μｌに、活性測定用試薬（９４μｌの６００ｍＭ メチルフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、９．４μｌの６ｍＭ ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）に、１０ｍＭ ＰＰＢを加え、全量８ｍｌとした溶液）を１７０μｌ添加した。これに各濃度の基質（グルコース又はマルトース）、または蒸留水を２０μｌ加えて攪拌し、分光光度計を用いてＤＣＩＰ由来の吸収波長である６００ｎｍの吸光度を測定した。各試薬の終濃度はＤＣＩＰ：０．０６ｍＭ、ＰＭＳ：０．６ｍＭである。
結果を表１１に示す。いずれの変異酵素も、変異導入前の野生型酵素に比べてマルトースへの反応性が低下しており、グルコースに対する基質特異性が向上していることが確認された。
前記粗酵素サンプル１０μｌに、活性測定用試薬（９４μｌの６００ｍＭ メチルフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、９．４μｌの６ｍＭ ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）に、１０ｍＭ ＰＰＢを加え、全量８ｍｌとした溶液）を１７０μｌ添加した。これに各濃度の基質（グルコース又はマルトース）、または蒸留水を２０μｌ加えて攪拌し、分光光度計を用いてＤＣＩＰ由来の吸収波長である６００ｎｍの吸光度を測定した。各試薬の終濃度はＤＣＩＰ：０．０６ｍＭ、ＰＭＳ：０．６ｍＭである。
結果を表１１に示す。いずれの変異酵素も、変異導入前の野生型酵素に比べてマルトースへの反応性が低下しており、グルコースに対する基質特異性が向上していることが確認された。
以上の結果より、ブルクホルデリア・セパシア以外のＧＤＨホモログにおいても、ＱＹＹ変異が有効であることが示唆される。
本発明の変異ＧＤＨは、グルコースに対する基質特異性が向上しており、グルコースセンサ等を用いたグルコースの測定に好適に使用することができる。
Claims (18)
- 配列番号３と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有する変異グルコース脱水素酵素であって、
前記アミノ酸配列の３２６位、３６５位および４７２位に相当するアミノ酸残基が、それぞれグルタミン、チロシンおよびチロシンで置換されており、
グルコースに対する基質特異性が向上し、二糖類に対する反応性が低下したことを特徴とする、変異グルコース脱水素酵素。 - 配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の変異グルコース脱水素酵素。
- 配列番号３、７、または８に示すアミノ酸配列からなり、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有する変異グルコース脱水素酵素であって、
前記アミノ酸配列は、１〜１０個のアミノ酸残基が保存的に置換されていてもよく、
配列番号３のアミノ酸配列の３２６位、３６５位および４７２位に相当するアミノ酸残基が、それぞれグルタミン、チロシン、及びチロシンで置換されており、
グルコースに対する基質特異性が向上し、二糖類に対する反応性が低下したことを特徴とする、変異グルコース脱水素酵素。 - 配列番号９と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有する変異グルコース脱水素酵素であって、
配列番号３のアミノ酸配列の３２６位、３６５位および４７２位に相当するアミノ酸残基が、それぞれグルタミン、チロシンおよびチロシンで置換されており、
グルコースに対する基質特異性が向上し、二糖類に対する反応性が低下したことを特徴とする、変異グルコース脱水素酵素。 - 配列番号９または１０に示すアミノ酸配列からなり、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有する変異グルコース脱水素酵素であって、
前記アミノ酸配列は、１〜１０個のアミノ酸残基が保存的に置換されていてもよく、
配列番号３のアミノ酸配列の３２６位、３６５位および４７２位に相当するアミノ酸残基が、それぞれグルタミン、チロシン、及びチロシンで置換されており、
グルコースに対する基質特異性が向上し、二糖類に対する反応性が低下したことを特徴とする、変異グルコース脱水素酵素。 - ３２６位、３６５位および４７２位に相当する位置以外は配列番号３に示すアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異グルコース脱水素酵素。
- ３２６位、３６５位および４７２位に相当する位置以外は配列番号７に示すアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異グルコース脱水素酵素。
- ３２６位、３６５位および４７２位に相当する位置以外は配列番号８に示すアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異グルコース脱水素酵素。
- ３２６位、３６５位および４７２位に相当する位置以外は配列番号９に示すアミノ酸配列を有する、請求項４または５に記載の変異グルコース脱水素酵素。
- ３２６位、３６５位および４７２位に相当する位置以外は配列番号１０に示すアミノ酸配列を有する、請求項４または５に記載の変異グルコース脱水素酵素。
- 前記アミノ酸配列において３２６位および３６５位に相当するアミノ酸残基がそれぞれグルタミンおよびチロシンで置換されているが４７２位は置換されていないグルコース脱水素酵素と比較して、グルコースに対する基質特異性が向上し、二糖類に対する反応性が低下したことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の変異グルコース脱水素酵素。
- 二糖類がマルトースであることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の変異グルコース脱水素酵素。
- 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の変異グルコース脱水素酵素と、電子伝達サブユニットとを少なくとも含む変異グルコース脱水素酵素複合体。
- 電子伝達サブユニットがシトクロムＣであることを特徴とする請求項１３に記載のグルコース脱水素酵素複合体。
- 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の変異グルコース脱水素酵素をコードするＤＮＡ。
- 請求項１５に記載のＤＮＡを保持し、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の変異グルコース脱水素酵素、あるいは請求項１３または１４に記載の変異グルコース脱水素酵素複合体を産生する微生物。
- 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の変異グルコース脱水素酵素、請求項１３または１４に記載の変異グルコース脱水素酵素複合体、あるいは請求項１６に記載の微生物を含む、グルコースアッセイキット。
- 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の変異グルコース脱水素酵素、請求項１３または１４に記載の変異グルコース脱水素酵素複合体、あるいは請求項１６に記載の微生物を含む、グルコースセンサ。
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