JP5341312B2 - 変異グルコース脱水素酵素 - Google Patents
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Description
高温下で生育する好熱性細菌由来の酵素は、一般に高い熱安定性を有し、長期保存や連続使用などにおいても高い安定性を示すことから、センサ素子としての応用が期待されている。しかし、好熱菌由来の耐熱性GDHについては、サーモゲネス・アシドフィラム(Thermoplasma acidophilm)、スルファロバス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)由来のGDHが報告されているが、いずれもNAD(P)+を補酵素とするものである。
ト(βサブユニット)、機能不明のγサブユニットから構成されるヘテロオリゴマーとして存在し、45℃に至適反応温度を持つが、50℃以上の熱処理を行うことによりサブユニットの解離が起こり、75℃に至適反応温度をもつαサブユニット単量体になる。αサブユニット単量体は熱に安定であり、60℃30分の熱処理後にも80%以上の残存活性を示す。これらのサブユニットをコードする遺伝子も単離されている(特許文献1、特許文献2)。
(1)配列番号3に示すアミノ酸配列、又は、同アミノ酸配列において365位以外の1又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質であって、前記アミノ酸配列の365位に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された、グルコースに対する基質特異性が向上した変異グルコース脱水素酵素。
(2)365位に相当する位置以外は配列番号3に示すアミノ酸配列を有する、(1)に記載の変異グルコース脱水素酵素。
(3)365位に相当する位置のアミノ酸残基が野生型であるグルコース脱水素酵素と比較し、二糖類に対する反応性が低下したことを特徴とする、(1)または(2)に記載の変異グルコース脱水素酵素。
(4)2糖類がマルトースであることを特徴とする(3)に記載の変異グルコース脱水素
酵素。
(5)マルトースに対する反応性がグルコースに対する反応性の20%以下であることを特徴とする(4)に記載の変異グルコース脱水素酵素。
(6)前記他のアミノ酸残基が、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン及びヒスチジンから選ばれるアミノ酸残基であることを特徴とする(1)〜(5)のいずれかに記載の変異グルコース脱水素酵素。
(7)さらに、配列番号3のアミノ酸配列における324、326、333、334、368、369、376、377、418、419、436、433、448、472、475、525、及び529から選ばれる少なくとも1つの位置に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された、(1)〜(6)のいずれかに記載の変異型グルコース脱水素酵素。
(8)前記位置が、326、472、475、及び529から選ばれる少なくとも1つである(7)に記載の変異型グルコース脱水素酵素。
(9)前記位置が、472位である(8)に記載の変異型グルコース脱水素酵素。
(10)前記位置が、475位である(8)に記載の変異型グルコース脱水素酵素。
(11)前記位置が、472位及び475位の両方である(8)に記載の変異型グルコース脱水素酵素。
(12)前記位置が、326位である(8)に記載の変異型グルコース脱水素酵素。
(13)前記位置が、529位である(8)に記載の変異型グルコース脱水素酵素。
(14)472位に相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸、及びヒスチジンから選ばれるアミノ酸に置換されたことを特徴とする(9)に記載の変異グルコース脱水素酵素。
(15)475位に相当するアミノ酸残基がヒスチジン又はセリンに置換されたことを特徴とする(10)に記載の変異グルコース脱水素酵素。
(16)326位のセリンに相当するアミノ酸残基がグルタミン又はバリンに置換されたことを特徴とする(12)に記載の変異グルコース脱水素酵素
(17)529位のロイシンに相当するアミノ酸残基がチロシン、ヒスチジン又はトリプトファンに置換されたことを特徴とする(13)に記載の変異グルコース脱水素酵素。
(18)配列番号3に示すアミノ酸配列、又は、同アミノ酸配列において、1又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質であって、(i)前記アミノ酸配列における324、326、333、334、365、368、369、376、377、418、419、436、433、448、525、及び529から選ばれる少なくとも1つの位置に相当するアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換、(ii)472位に相当する位置のアミノ酸残基のアスパラギン酸への置換、及び(iii)475位に相当するアミノ酸残基のヒスチジンへの置換を含む、グルコースに対する基質特異性が向上した変異グルコース脱水素酵素。
(19)前記他アミノ酸残基がフェニルアラニン、チロシン又はトリプトファンであることを特徴とする(18)に記載の変異グルコース脱水素酵素
(20)前記位置が326位であり、同位置に相当するアミノ酸残基がグルタミン又はバリンに置換されたことを特徴とする(18)に記載の変異グルコース脱水素酵素
(21)前記位置が529位であり、同位置に相当するアミノ酸残基がチロシン、ヒスチジン又はトリプトファンに置換されたことを特徴とする(18)に記載の変異グルコース脱水素酵素。
(22)配列番号7のアミノ酸配列を含む、FAD結合型変異グルコース脱水素酵素。
(23)(1)〜(22)のいずれかに記載の変異グルコース脱水素酵素と、電子伝達サブユニットとを少なくとも含む変異グルコース脱水素酵素複合体。
(24)電子伝達サブユニットがシトクロムCであることを特徴とする(23)に記載のグルコース脱水素酵素複合体。
(25)(1)〜(22)のいずれかに記載の変異グルコース脱水素酵素をコードするDNA。
(26)(25)に記載のDNAを保持し、(1)〜(22)のいずれかに記載の変異グルコース脱水素酵素又は(23)に記載の変異グルコース脱水素酵素複合体を産生する微生物。
(27)(1)〜(22)に記載の変異グルコース脱水素酵素、(23)に記載の変異グルコース脱水素酵素複合体、又は(26)に記載の微生物を含む、グルコースアッセイキット。
(28)(1)〜(22)に記載の変異グルコース脱水素酵素、(23)に記載の変異グルコース脱水素酵素複合体、又は(26)に記載の微生物を含む、グルコースセンサ。
本発明の変異GDHは、野生型GDHに特定の変異を導入することにより、製造される。野生型GDHとしては、ブルクホリデリア・セパシアが産生するGDHが挙げられる。ブルクホリデリア・セパシアのGDHとしては、ブルクホリデリア・セパシアKS1株、JCM2800株又はJCM2801株が産生するGDHが挙げられる。KS1株は、平成12年9月25日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(〒305-8566 日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)に、受託番号第FERM BP−7306として寄託されている。JCM2800株又はJCM2801株は、独立行政法人理化学研究所微生物系統保存施設(Japan Collection of Microorganisms, JCM)に保存されている。
には例えば、野生型酵素に対する変異型酵素の基質特異性(グルコースに対する比活性と、他の糖類、例えばマルトース、に対する比活性との比)の向上(下記式で表される)が、10%以上、好ましくは20%以上、より好ましくは40%以上であれば、グルコースに対する基質特異性は向上している。例えば、基質特異性が、野生型酵素では60%、変異型GDHでは40%の場合、グルコース以外の糖類に対する反応性は、33%低下している。
基質特異性=(グルコース以外の糖類に対する比活性/グルコースに対する比活性)×100)
基質特異性の向上=(A−B)×100/A
A:野生型酵素の基質特異性
B:変異型酵素の基質特異性
また、変異型GDHは、マルトースに対する反応性(比活性)がグルコースに対する反応性(比活性)の30%以下、好ましくは20%以下であることが好ましい。
(1)配列番号3に示すアミノ酸配列の365位に相当するアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換。
(2)配列番号3に示すアミノ酸配列の365位に相当するアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換、及び、324、326、333、334、368、369、376、377、418、419、436、433、448、472、475、525、及び529の少なくとも1つ、又は任意の2以上の位置に相当するアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換。
(3)(i)配列番号3に示すアミノ酸配列の324、326、333、334、365、368、369、376、377、418、419、436、433、448、525、及び529から選ばれる少なくとも1つ、又は任意の2以上の位置に相当するアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換、(ii)472位に相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換、及び(iii)475位に相当するアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換。
475位においては、置換後のアミノ酸残基はヒスチジン又はセリンが好ましく、ヒスチジンが特に好ましい。
326位においては、置換後のアミノ酸残基は、グルタミン又はバリンが好ましい。
529位においては、置換後のアミノ酸残基は、チロシン、ヒスチジン又はトリプトファンが好ましい。
(数字はアミノ酸配列における位置を、アミノ酸残基は前記位置における置換後のアミノ酸残基を示し、「+」は同時に2つのアミノ酸置換を有することを示す。)
(A)365Arg、365Asn、365Asp、365Cys、365Glu、365Gly、365His、365Ile、365Leu、365Met、365Phe、365Pro、365Trp、365Tyr、365Val、365Lys、365Gln、365Thr、365Ala
(B)326Gln、326Val、326Arg
(C)529His、529Tyr、529Trp
(D)365Tyr+326Gln、365Tyr+326Val、365Tyr+326Arg、365Tyr+472Phe、365Tyr+472Ile、365Tyr+472Asn、365Tyr+472Asp、365Tyr+472His、365Tyr+472Leu、365Tyr+472Ser、365Tyr+475Ser、365Tyr+475His、365Phe+472Phe
(E)472Asp+475His+365Phe、472Asp+475His+326Gln、472Asp+475His+326Thr、472Asp+475His+326Val、472Asp+475His+529Trp、472Asp+475His+529His、472Asp+475His+529Tyr、472Tyr+475His+365Phe、472Tyr+475His+365His、472Tyr+475His+326Val、472Ile+475His+326Gln
(F)472Asp+475His+529His+326Gln、472Asp+475His+529Trp+326Gln
・アマガサキエンスのグルコースオキシダーゼ(Eur. J. Biochem. 252, 90-99(1998))のアミノ酸配列を比較し、FAD結合ドメイン及びFAD-covering lid等の保存された領域、およびタンパク質の折りたたみに関与するアミノ酸残基であるプロリンが保存されている領域を見い出した。そして、これらの領域と他の領域との境界付近の配列を改変することにより、基質特異性を向上できる可能性について検討を行った。具体的にはR53〜H73、E88〜A108、N308〜G336、K362〜A377、A391〜R497、S509〜V539を検討した。その結果、上記領域の中において基質特異性を向上することができる場所をいくつか発見した。
の変異GDHも、同様にして使用することかできる。
ブルクホルデリア・セパシアのGDHを発現するプラスミドとして、GDHのαサブユニット及びγサブユニットを発現するプラスミド、並びに、αサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットを発現するプラスミドを用意した。
αサブユニット及びγサブユニットを発現するプラスミドとしては、WO02/036779(EP1331272A1、US2004023330A1、CN1484703Aに対応)に記載のプラスミドpTrc99A/γ+αを使用した。同プラスミドは、ブルクホルデリア・セパシアKS1株(FERM BP-7306)染色体DNAから単離された、GDH γサブユニット構造遺伝子とαサブユニット構造遺伝子を連続して含むDNA断片が、ベクターpTrc99A(Pharmacia社)のクローニング部位であるNcoI/HindIIIに挿入されてなるプラスミドである。本プラスミド中のGDHγα遺伝子は、trcプロモーターによって制御される。pTrc99A/γ+αは、アンピシリン耐性遺伝子を保持している。
GDHのαサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットを発現するプラスミドは、以下のようして調製した。
ブルクホルデリア・セパシア KS1株より染色体遺伝子を常法に従って調製した。すなわち、同菌株をTL液体倍地(ポリペプトン 10g、酵母抽出液 1g、NaCl 5g、KH2PO4 2g、グルコース 5g;1L、pH 7.2)を用いて、34℃で一晩振盪した。増殖した菌体を遠心分離により回収した。この菌体を10mM NaCl、20mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、0.5% SDS、100μg/mlのプロテイナーゼKを含む溶液に懸濁し、50℃で6時間処理した。ここに等量のフェノール−クロロホルムを加えて室温で10分間撹拌した後、遠心分離により上清を回収した。これに終濃度0.3Mになるように酢酸ナトリウムを加え、2倍量のエタノールを重層して中間層に染色体DNAを析出させた。これをガラス棒を用いてすくいとり、70%エタノールで洗浄した後、適当量のTEバッファーに溶解させ、染色体DNA溶液とした。
前記染色体DNAを鋳型として、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするPCRにより、GDHのγサブユニット、αサブユニット及びβサブユニットをコードするDNA断片を増幅した。
5'-CATGCCATGGCACACAACGACAACAC-3'(配列番号8)
〔リバースプライマー〕
5'-GTCGACGATCTTCTTCCAGCCGAACATCAC-3'(配列番号9)
得られた形質転換体を液体のLB培地で培養してプラスミドを抽出し、その挿入DNA断片を解析したところ、約3.8kbの挿入断片が確認された。本プラスミドをpTrc99Aγαβと命名した。本プラスミド中のGDHの各構造遺伝子は、trcプロモーターによって制御される。pTrc99Aγαβは、アンピシリン耐性遺伝子及びカナマイシン耐性遺伝子を保持している。
(1)472位及び475位への変異導入
実施例1で得られたpTrc99Aγαβに含まれるGDH αサブユニット遺伝子に、同遺伝子がコードするαサブユニットの472位のアラニン残基をアスパラギン酸残基に、および475位のアスパラギン残基をヒスチジン残基に置換されるような変異を導入した。この変異体を472D+475H変異体と称する。これらの変異により基質特性が改善されることは、本発明者らはすでに確認している。
具体的には、市販の部位特異的変異導入キット(Stratagene社、QuikChangeII Site-Directed Mutagenesis Kit)を用いて、実施例1に記載のプラスミドpTrc99A/γ+α及びpTrc99Aγαβに含まれるGDH αサブユニット遺伝子の475位のアスパラギンのコドン(AAT)をアスパラギン酸(GAT)又はグルタミン酸(GAA)のコドンに置換した。プライマーには、下記のオリゴヌクレオチドを使用した。
フォワードプライマー:配列番号224
5'-CGTGTTCAACGACGAATTCGATCCGAACAATCACATCACGG-3'
リバースプライマー :配列番号225
5'-CCGTGATGTGATTGTTCGGATCGAATTCGTCGTTGAACACG-3'
フォワードプライマー:配列番号226
5'-AATTCGCGCCGAACCACCACATCACGGGCTC-3'
リバースプライマー :配列番号227
5'-GAGCCCGTGATGTGGTGGTTCGGCGCGAATT-3'
(ii)E88〜A108
(iii)N308〜G336
(iv)K362〜A377
(v)A391〜R497
(vi)S509〜V539
ライマーの配列は、フォワードプライマーの完全相補鎖とした。
尚、変異を表す表記において、数字はアミノ酸配列における位置を、数字の前のアルファベットはアミノ酸置換前のアミノ酸残基を、数字の後のアルファベットはアミノ酸置換後のアミノ酸残基を示す。例えば、R53Fは、53位のアルギニンからフェニルアラニンへの置換を示す。
鋳型DNA(5ng/μl) 2μl
(472D+475H導入pTrc99A/γ+α及びpTrc99Aγαβ)
10×反応緩衝液 5μl
フォワードプライマー(100ng/μl) 1.25μl
リバースプライマー(100ng/μl ) 1.25μl
dNTP 1μl
蒸留水 38.5μl
DNAポリメラーゼ 1μl
合計 50μl
実施例2で得られた変異GDH発現プラスミドを用いて、変異GDHを製造し、基質特異性を検討した。
変異導入したエシェリヒア・コリDH5α株を、各々2mlのLB培地(アンピシリン50μg/ml及びカナマイシン30μg/ml含有)で、L字管を用いて37℃で一晩振とう培養した。それらの培養液を、150mlのLB培地(アンピシリン50μg/mlおよびカナマイシン30μg/ml含有)を含む500mlの坂口フラスコに植菌し、37℃で振とう培養した。培養開始から3時間後にIPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド)を終濃度0.1mMになるように添加し、さらに2時間培養した。
前記で培養した培養液から菌体を集め、洗浄後、湿菌体0.3mgあたり1mlの0.2% Triton X100を含む10mMリン酸カリウムバッファー(PPB)(pH7.0)で菌体を懸濁し、超音波破砕した。この懸濁液遠心分離(10000r.p.m、10分、4℃)して残渣を除去した後、上清を超遠心分離(50,000r.p.m.、60分、4℃)し、得られた上清(水溶性画分)を、粗酵素サンプルとした。また、このサンプルを、通常の疎水性クロマトグラフィー(カラム名:オクチルセファロース(アマシャム・バイオサイエンス製)およびイオン交換クロマトグラフィー(Q-セファロース(アマシャム・バイオサイエンス製)により精製して、精製酵素サンプルを得た。目的とする酵素画分の決定は、GDH活性を指標として行った。
前記酵素サンプル8μlに、活性測定用試薬(12μlの600mM メチルフェナジンメトサルフェート(PMS)、120μlの6 mM 2,6-ジクロロフェノールインドフェノール(DCIP)に、0.2(w/v)% Triton X-100 10mM PPBを加え、全量480μlとした溶液)を8μl添加した。これをアルミブロック恒温槽を用いて、各反応温度で1分間プレインキュベートした後、素早く各濃度の基質(グルコース又はマルトース)、または蒸留水を8μl加えて攪拌し、分光光
度計を用いてDCIP由来の吸収波長である600 nmの吸光度を測定した。各試薬の終濃度はDCIP:0.06mM、PMS、0.6mM。基質の終濃度は5mMである。
結果を、表8〜14に示す。尚、野生型GDHの反応比は48%であった。
マルトースとの反応性が1%台まで低下する大変効果の高い変異であった。
365位以外の変異では、G324、S326、L333、W334、S368、R369、K376、I377、V418、P419、Y436、K433、H448、A525、L529のフェニルアラニンへの変異がマルトースとの反応性において変異導入前の60%以下となり効果が見られた。
実施例3で得られた結果から、365位はマルトースとの反応性低下において大変効果的な部位であることが推察された。よってこの部位の詳細な検討を行なう事とした。
具体的にはαサブユニット遺伝子に対する、365位への単変異導入による基質特性改善効果を検証した。
pTrc99Aγαβに含まれる野生型GDH αサブユニット遺伝子の365位に変異導入を実施し、変異酵素の基質特異性を評価した。変異導入に関しては実施例2と同様に行なった。
変異導入用フォワードプライマーは以下の通りである。リバースプライマーは、フォワードプライマーの完全相補鎖とした。
実施例4で得られた変異GDH発現プラスミドを用いて、実施例3と同様にして、変異GDHを製造し、基質特異性を検討した。酵素活性は、粗酵素サンプルを用いて行った。それぞれの変異GDHのグルコースに対する比活性、マルトースに対する比活性、反応比(マルトースに対する比活性/グルコースに対する比活性。単位はU/ml)を、表16に示す。基質濃度に関しては5mMおよび10mMにて評価した。
実施例2および実施例5の結果により、365位は少なくとも365Fと472D+475Hの組み合わせにおいて効果が確認され、さらに365位のみの単変異導入において全てのアミノ酸置換にて効果が見られた事から、基質特性改善効果の大変高い部位であることが明らかになった。よって、365位のアミノ酸置換と他の部位とのアミノ酸置換との組み合わせによる、更なる基質特性改善を目指し、さらに鋭意検討を行なった。具体的には365位と326位、529位、472位の何れかとの組み合わせに2変異導入、並びに472及び475位の変異との組み合わせによる3変異導入を検討した。
実施例6の結果により、基質特性改善効果のあるアミノ酸置換は、それらの部位同士の組み合わせにより相乗効果的に基質特性が改善される可能性が示唆された。
よって、すでに発明者らによって基質特性改善効果が確認されている部位である472、475位と365以外の部位との組み合わせ効果を検証した。
具体的には472位と475位の組み合わせにおいて最も基質特性改善効果の高かった472D+475Hと、326位又は529位との組み合わせを検証した。また、472位及び475位の他の変異についても、同様に検証した。
実施例5および6で基質特異性の改善が認められたいくつかの変異GDHについて精製を実施した。方法は実施例3に記載の通りに行なった。各精製酵素のグルコースに対する比活性(U/mg)を表8に示す。
その結果、S365Yを含む変異は、グルコースに対する比活性を90%近く維持し、グルコース測定の観点からは好適な変異であることが明らかとなった。またS326Q変異はグルコースに対する比活性を上げる効果があることも判明した。
実施例8で得られた精製変異酵素を用いてグルコースセンサを作製した。
布量を表23に示す。表中、「Ru」は、ヘキサルテニウムアンミン錯体(Ru(NH3)6Cl3)を、CHAPSは3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio] propanesulfonic acidを、ACESはN-(2-acetamido)-2-aminoethanesulfonic acidを、MTTは3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromideを、各々示す。
を用いたセンサでは、低血糖(45mg/dlグルコース)がマルトースの混入によって正常域以上の(138mg/dlグルコース)に見かけ上表示されてしまう。一方、改変GDHを用いたセンサでは、マルトースが最大300mg/dl混入している場合でも、見かけの血糖値が最大でも60mg/dlまでしか上昇せず、影響は大幅に押さえられていると言える。結論としては365を含む変異が、グルコースに対する反応性(直線性)とマルトース影響の観点から最適であることが示唆される。
実施例5および6で特に基質特異性改善効果が認められた365Yおよび326Q+365Y変異GDHについて、精製酵素を用いたSVプロットを取得した。
その結果、精製した酵素においても、試験した全ての基質濃度に関して、反応比(マルトースに対する比活性/グルコースに対する比活性)が野生型と比べて大幅に低くなり改善されていることが確認できた。また結果に関しても粗酵素溶液による測定結果とほぼ一致したことから、粗酵素による改変酵素の評価は十分可能であることが確認できた。さらに付け加えると、マルトース輸液による、血中のマルトース濃度の上昇は最大でも200mg/dlまでしか上昇しないことから、特に基質濃度10mM(360mg/dl)と5mM(180mg/dl)における反応比に注目した。その結果、この濃度域におけるS365Y変異のマルトース/グルコース反応比は0.1%と、殆どマルトースとは反応しないことが示唆された。
また326Qを365Yに付加することで、グルコースに対する比活性を上げ、相対的にマルトースとの反応性を下げることが出来ることも明らかとなった。
Claims (25)
- 配列番号3に示すアミノ酸配列、又は、同アミノ酸配列において365位以外の1又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質において、配列番号3に示すアミノ酸配列の365位に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換され、365位に相当する位置のアミノ酸残基が野生型であるグルコース脱水素酵素と比較し、マルトースに対する反応性が低下したことを特徴とする、グルコースに対する基質特異性が向上した変異グルコース脱水素酵素。
- 365位に相当する位置以外は配列番号3に示すアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の変異グルコース脱水素酵素。
- 精製酵素の5mMマルトースに対する反応性が5mMグルコースに対する反応性の20%以下であるか、および/または、精製酵素の10mMマルトースに対する反応性が10mMグルコースに対する反応性の20%以下であることを特徴とする請求項1または2に記載の変異グルコース脱水素酵素。
- 前記他のアミノ酸残基が、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン及びヒスチジンから選ばれるアミノ酸残基であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか一項に記載の変異グルコース脱水素酵素。
- 前記365位以外の1又は複数のアミノ酸残基が、配列番号3のアミノ酸配列における324、326、333、334、368、369、376、377、418、419、436、433、448、472、475、525、及び529から選ばれる少なくとも1つの位置に相当するアミノ酸残基であり、当該アミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された、請求項1〜4のいずれか一項に記載の変異グルコース脱水素酵素。
- 前記位置が、326、472、475、及び529から選ばれる少なくとも1つである請求項5に記載の変異グルコース脱水素酵素。
- 前記位置が、472位である請求項6に記載の変異グルコース脱水素酵素。
- 前記位置が、475位である請求項6に記載の変異グルコース脱水素酵素。
- 前記位置が、472位及び475位の両方である請求項6に記載の変異グルコース脱水素酵素。
- 前記位置が、326位である請求項6に記載の変異グルコース脱水素酵素。
- 前記位置が、529位である請求項6に記載の変異グルコース脱水素酵素。
- 472位に相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸、及びヒスチジンから選ばれるアミノ酸に置換されたことを特徴とする請求項7に記載の変異グルコース脱水素酵素。
- 475位に相当するアミノ酸残基がヒスチジン又はセリンに置換されたことを特徴とする請求項8に記載の変異グルコース脱水素酵素。
- 326位のセリンに相当するアミノ酸残基がグルタミン又はバリンに置換されたことを特徴とする請求項10に記載の変異グルコース脱水素酵素。
- 529位のロイシンに相当するアミノ酸残基がチロシン、ヒスチジン又はトリプトファンに置換されたことを特徴とする請求項11に記載の変異グルコース脱水素酵素。
- 配列番号3に示すアミノ酸配列、又は、同アミノ酸配列において、1又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質において、(i)配列番号3に示すアミノ酸配列における324、326、333、334、365、368、369、376、377、418、419、436、433、448、525、及び529から選ばれる少なくとも1つの位置に相当するアミノ酸残基のフェニルアラニンへの置換、(ii)472位に相当する位置のアミノ酸残基のアスパラギン酸への置換、及び(iii)475位に相当するアミノ酸残基のヒスチジンへの置換を含み、(i)において選択された位置のアミノ酸残基が野生型であるグルコース脱水素酵素と比較し、グルコースに対する比活性とマルトースに対する比活性との比が向上したことを特徴とする、グルコースに対する基質特異性が向上した変異グルコース脱水素酵素。
- 配列番号3に示すアミノ酸配列、又は、同アミノ酸配列において、1又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質において、(i)配列番号3に示すアミノ酸配列における326位に相当するアミノ酸残基のグルタミン又はバリンへの置換、(ii)472位に相当する位置のアミノ酸残基のアスパラギン酸への置換、及び(iii)475位に相当するアミノ酸残基のヒスチジンへの置換を含み、326位に相当する位置のアミノ酸残基が野生型であるグルコース脱水素酵素と比較し、マルトースに対する反応性が低下したことを特徴とする、グルコースに対する基質特異性が向上した変異グルコース脱水素酵素。
- 配列番号3に示すアミノ酸配列、又は、同アミノ酸配列において、1又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質において、(i)配列番号3に示すアミノ酸配列における529位に相当するアミノ酸残基のチロシン、ヒスチジン又はトリプトファンへの置換、(ii)472位に相当する位置のアミノ酸残基のアスパラギン酸への置換、及び(iii)
475位に相当するアミノ酸残基のヒスチジンへの置換を含み、529位に相当する位置のアミノ酸残基が野生型であるグルコース脱水素酵素と比較し、マルトースに対する反応性が低下したことを特徴とする、グルコースに対する基質特異性が向上した変異グルコース脱水素酵素。 - 配列番号3のアミノ酸配列の360〜366位のアミノ酸配列に対応する位置に配列番号7のアミノ酸配列を含み、配列番号3に示すアミノ酸配列と93.7%以上の同一性を有する、FAD結合型変異グルコース脱水素酵素。
- 請求項1〜19のいずれか一項に記載の変異グルコース脱水素酵素と、電子伝達サブユニットとを少なくとも含む変異グルコース脱水素酵素複合体。
- 電子伝達サブユニットがシトクロムCであることを特徴とする請求項20に記載のグルコース脱水素酵素複合体。
- 請求項1〜19のいずれか一項に記載の変異グルコース脱水素酵素をコードするDNA。
- 請求項22に記載のDNAを保持し、請求項1〜19のいずれか一項に記載の変異グルコース脱水素酵素又は請求項20に記載の変異グルコース脱水素酵素複合体を産生する微生物。
- 請求項1〜19のいずれか一項に記載の変異グルコース脱水素酵素、請求項20に記載の変異グルコース脱水素酵素複合体、又は請求項23に記載の微生物を含む、グルコースアッセイキット。
- 請求項1〜19のいずれか一項に記載の変異グルコース脱水素酵素、請求項20に記載の変異グルコース脱水素酵素複合体、又は請求項23に記載の微生物を含む、グルコースセンサ。
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