JP5341312B2 - 変異グルコース脱水素酵素 - Google Patents

変異グルコース脱水素酵素 Download PDF

Info

Publication number
JP5341312B2
JP5341312B2 JP2006541525A JP2006541525A JP5341312B2 JP 5341312 B2 JP5341312 B2 JP 5341312B2 JP 2006541525 A JP2006541525 A JP 2006541525A JP 2006541525 A JP2006541525 A JP 2006541525A JP 5341312 B2 JP5341312 B2 JP 5341312B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
amino acid
glucose dehydrogenase
mutant
acid sequence
acid residue
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2006541525A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2006137283A1 (ja
Inventor
秀亮 山岡
理志 塚田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Arkray Inc
Original Assignee
Arkray Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Arkray Inc filed Critical Arkray Inc
Priority to JP2006541525A priority Critical patent/JP5341312B2/ja
Publication of JPWO2006137283A1 publication Critical patent/JPWO2006137283A1/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5341312B2 publication Critical patent/JP5341312B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14Fungi; Culture media therefor
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/54Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving glucose or galactose
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12YENZYMES
    • C12Y101/00Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01049Glucose-6-phosphate dehydrogenase (1.1.1.49)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

本発明は、基質特異性の向上した変異グルコース脱水素酵素に関する。本発明の変異グルコース脱水素酵素は、グルコースセンサ、及びグルコースアッセイキット等に好適に使用することができ、生化学分野、臨床分野等で有用である。
近年バイオセンサ素子として様々な酵素が用いられている。糖尿病の診断を目的とした血液中のグルコース濃度を測定するセンサ素子として、グルコースオキシダーゼ(GOD)がすでに実用化されているが、GODはサンプル中の溶存酸素に影響を受けることが問題となっている。そこでサンプル中の溶存酸素に影響を受けないグルコース脱水素酵素(GDH)がGODに代わるものとして注目されている。
GDHには、NAD(P)+を補酵素とするもの(E.C. 1.1.1.47)やピロロキノリンキノン(PQQ)を補酵素とするもの(PQQGDH; E.C. 1.1.99.17)などが報告されている。NAD(P)+を補酵素とするGDHは、測定系にNAD(P)+を添加する必要があるという点でセンサ素子として問題がある。一方、PQQGDHなどの補酵素結合型GDHは測定系に補酵素を添加する必要がない。
また、センサ素子には、連続使用や室温に放置していてもセンサとしての機能を失わないというような安定性が望まれる。
高温下で生育する好熱性細菌由来の酵素は、一般に高い熱安定性を有し、長期保存や連続使用などにおいても高い安定性を示すことから、センサ素子としての応用が期待されている。しかし、好熱菌由来の耐熱性GDHについては、サーモゲネス・アシドフィラム(Thermoplasma acidophilm)、スルファロバス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)由来のGDHが報告されているが、いずれもNAD(P)+を補酵素とするものである。
一方、中度好熱性細菌であるブルクホリデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)が産生する耐熱性GDHはFAD結合型であり、すでに至適反応温度、熱安定性、基質特異性などの酵素学的性質が明らかとなっている(特許文献1)。このGDHは、通常は、高い耐熱性を持つ触媒サブユニット(αサブユニット)、チトクロームCである電子伝達サブユニッ
ト(βサブユニット)、機能不明のγサブユニットから構成されるヘテロオリゴマーとして存在し、45℃に至適反応温度を持つが、50℃以上の熱処理を行うことによりサブユニットの解離が起こり、75℃に至適反応温度をもつαサブユニット単量体になる。αサブユニット単量体は熱に安定であり、60℃30分の熱処理後にも80%以上の残存活性を示す。これらのサブユニットをコードする遺伝子も単離されている(特許文献1、特許文献2)。
しかし、補酵素結合型GDHは一般的に基質特性が広く、グルコース以外にマルトースやガラクトースなどとも反応するため、糖尿病患者向け血糖測定向けのグルコースセンサとして応用した場合で、糖尿病患者が腹膜透析を実施しなければならないような重篤な症状の場合は、透析液にマルトースが大量に含まれているため、本来の血糖値より高く測定値が出てしまう危険性がある。ブルクホリデリア・セパシアのGDHも同様に、グルコース以外にマルトースやガラクトースとも反応性を有している。
アミノ酸置換変異を導入することによって、GDHの基質特異性を変化させる技術が知られている。このような変異GDHとしては、例えば、E. coli(特許文献3、4)、アシネトバクター・カルコアセティカス(Gluconobacter calcoaceticus)(特許文献5)、又はアシネトバクター・バウマンニ(特許文献6〜8)由来の、ピロロキノリンキノンを補酵素とするPQQGDHが知られている。
米国特許出願公開第2004/0023330号 国際公開第03/091430号パンフレット 特開平10−243786号公報 特開2001−197888号公報 特開2004−173538号公報 特開2004−313172号公報 特開2004−313180号公報 特開2004−344145号公報
本発明は、グルコースに対する基質特異性の向上したFAD結合型GDHを提供することを課題とする。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ブルクホリデリア・セパシアのFAD結合型GDHの特定の部位のアミノ酸配列を改変することにより、グルコースに対する反応性を維持しながら、他の糖に対する反応性が低下させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
(1)配列番号3に示すアミノ酸配列、又は、同アミノ酸配列において365位以外の1又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質であって、前記アミノ酸配列の365位に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された、グルコースに対する基質特異性が向上した変異グルコース脱水素酵素。
(2)365位に相当する位置以外は配列番号3に示すアミノ酸配列を有する、(1)に記載の変異グルコース脱水素酵素。
(3)365位に相当する位置のアミノ酸残基が野生型であるグルコース脱水素酵素と比較し、二糖類に対する反応性が低下したことを特徴とする、(1)または(2)に記載の変異グルコース脱水素酵素。
(4)2糖類がマルトースであることを特徴とする(3)に記載の変異グルコース脱水素
酵素。
(5)マルトースに対する反応性がグルコースに対する反応性の20%以下であることを特徴とする(4)に記載の変異グルコース脱水素酵素。
(6)前記他のアミノ酸残基が、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン及びヒスチジンから選ばれるアミノ酸残基であることを特徴とする(1)〜(5)のいずれかに記載の変異グルコース脱水素酵素。
(7)さらに、配列番号3のアミノ酸配列における324、326、333、334、368、369、376、377、418、419、436、433、448、472、475、525、及び529から選ばれる少なくとも1つの位置に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された、(1)〜(6)のいずれかに記載の変異型グルコース脱水素酵素。
(8)前記位置が、326、472、475、及び529から選ばれる少なくとも1つである(7)に記載の変異型グルコース脱水素酵素。
(9)前記位置が、472位である(8)に記載の変異型グルコース脱水素酵素。
(10)前記位置が、475位である(8)に記載の変異型グルコース脱水素酵素。
(11)前記位置が、472位及び475位の両方である(8)に記載の変異型グルコース脱水素酵素。
(12)前記位置が、326位である(8)に記載の変異型グルコース脱水素酵素。
(13)前記位置が、529位である(8)に記載の変異型グルコース脱水素酵素。
(14)472位に相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸、及びヒスチジンから選ばれるアミノ酸に置換されたことを特徴とする(9)に記載の変異グルコース脱水素酵素。
(15)475位に相当するアミノ酸残基がヒスチジン又はセリンに置換されたことを特徴とする(10)に記載の変異グルコース脱水素酵素。
(16)326位のセリンに相当するアミノ酸残基がグルタミン又はバリンに置換されたことを特徴とする(12)に記載の変異グルコース脱水素酵素
(17)529位のロイシンに相当するアミノ酸残基がチロシン、ヒスチジン又はトリプトファンに置換されたことを特徴とする(13)に記載の変異グルコース脱水素酵素。
(18)配列番号3に示すアミノ酸配列、又は、同アミノ酸配列において、1又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質であって、(i)前記アミノ酸配列における324、326、333、334、365、368、369、376、377、418、419、436、433、448、525、及び529から選ばれる少なくとも1つの位置に相当するアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換、(ii)472位に相当する位置のアミノ酸残基のアスパラギン酸への置換、及び(iii)475位に相当するアミノ酸残基のヒスチジンへの置換を含む、グルコースに対する基質特異性が向上した変異グルコース脱水素酵素。
(19)前記他アミノ酸残基がフェニルアラニン、チロシン又はトリプトファンであることを特徴とする(18)に記載の変異グルコース脱水素酵素
(20)前記位置が326位であり、同位置に相当するアミノ酸残基がグルタミン又はバリンに置換されたことを特徴とする(18)に記載の変異グルコース脱水素酵素
(21)前記位置が529位であり、同位置に相当するアミノ酸残基がチロシン、ヒスチジン又はトリプトファンに置換されたことを特徴とする(18)に記載の変異グルコース脱水素酵素。
(22)配列番号7のアミノ酸配列を含む、FAD結合型変異グルコース脱水素酵素。
(23)(1)〜(22)のいずれかに記載の変異グルコース脱水素酵素と、電子伝達サブユニットとを少なくとも含む変異グルコース脱水素酵素複合体。
(24)電子伝達サブユニットがシトクロムCであることを特徴とする(23)に記載のグルコース脱水素酵素複合体。
(25)(1)〜(22)のいずれかに記載の変異グルコース脱水素酵素をコードするDNA。
(26)(25)に記載のDNAを保持し、(1)〜(22)のいずれかに記載の変異グルコース脱水素酵素又は(23)に記載の変異グルコース脱水素酵素複合体を産生する微生物。
(27)(1)〜(22)に記載の変異グルコース脱水素酵素、(23)に記載の変異グルコース脱水素酵素複合体、又は(26)に記載の微生物を含む、グルコースアッセイキット。
(28)(1)〜(22)に記載の変異グルコース脱水素酵素、(23)に記載の変異グルコース脱水素酵素複合体、又は(26)に記載の微生物を含む、グルコースセンサ。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の変異GDHは、野生型GDHに特定の変異を導入することにより、製造される。野生型GDHとしては、ブルクホリデリア・セパシアが産生するGDHが挙げられる。ブルクホリデリア・セパシアのGDHとしては、ブルクホリデリア・セパシアKS1株、JCM2800株又はJCM2801株が産生するGDHが挙げられる。KS1株は、平成12年9月25日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(〒305-8566 日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)に、受託番号第FERM BP−7306として寄託されている。JCM2800株又はJCM2801株は、独立行政法人理化学研究所微生物系統保存施設(Japan Collection of Microorganisms, JCM)に保存されている。
KS1株のGDH αサブユニット遺伝子、及びβサブユニット遺伝子の一部を含む染色体DNA断片の塩基配列を配列番号1に示す(米国特許出願公開第2004/0023330号)。この塩基配列には3つのオープンリーディングフレーム(ORF)が存在し、5'末端側から2番目及び3番目のORFは、それぞれαサブユニット(配列番号3)、及びβサブユニット(配列番号4)をコードしている。また、1番目のORFはγサブユニット(配列番号2)をコードしていると推定される。また、配列番号5に、βサブユニット遺伝子全長を含む断片の塩基配列を示す。さらに、βサブユニットのアミノ酸配列を配列番号6に示す(欧州特許出願公開第1498484号)。配列番号6において、アミノ酸番号1〜22はシグナルペプチドであると推定される。尚、配列番号5及び6において、第1番目のアミノ酸残基はValと記載されているが、Metである可能性が高く、また、翻訳後に脱落している可能性がある。
本発明の変異GDHは、αサブユニットのみであってもよいし、αサブユニットとβサブユニットとの複合体、又はαサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットからなる複合体であってもよい。本発明の変異GDHは、いずれの場合もαサブユニットに特定の変異が導入されたものであるが、この特定の変異の他に、保存的な変異を有していてもよい。また、他のサブユニットは野生型であっても、保存的な変異を有するものであってもよい。尚、「保存的変異」とは、GDH活性に実質的に影響しない変異をいう。
本発明の変異型αサブユニットは、好ましくは、後述する特定の変異以外は、配列番号に示すアミノ酸配列を有する。また、変異型αサブユニットは、GDH活性を有する限り、前述したような保存的変異を有していてもよい。すなわち、配列番号のアミノ酸配列において、前記特定の変異以外に、1又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。尚、配列番号には、配列番号の塩基配列によってコードされ得るアミノ酸配列を示してあるが、N末端のメチオニン残基は、翻訳後に脱落している可能性がある。前記「1又は複数」とは、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個、特に好ましくは1〜3個である。
また、βサブユニットは、典型的には配列番号のアミノ酸配列を有する。しかし、GDHのβサブユニットとして機能し得る限り、配列番号のアミノ酸番号23〜425からなるアミノ酸配列において、1又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。前記「1又は複数」とは、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、特に好ましくは1〜5個である。尚、GDHのβサブユニットとして機能するとは、αサブユニットとともに複合体を形成したときに同複合体のGDH活性を損なわずにチトクロームCとして機能することをいう。
野生型αサブユニット遺伝子として具体的には、配列番号の塩基番号764〜2380からなる塩基配列を含むDNAが挙げられる。また、αサブユニット遺伝子は、配列番号の塩基配列の塩基番号764〜2380からなる塩基配列を有するDNA、又はこの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、GDH活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。
また、βサブユニット遺伝子として具体的には、配列番号の塩基番号187〜1398からなる塩基配列を含むDNAが挙げられる。またβサブユニット遺伝子は、配列番号の塩基番号187〜1398からなる塩基配列を有するDNA、又はこの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、βサブユニットとして機能し得るタンパク質をコードするDNAであってもよい。
前記ストリンジェントな条件としては、70%、好ましくは80%、より好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズする条件、具体的には、1×SSC、0.1%SDS、60℃が挙げられる。
αサブユニット遺伝子及びβサブユニット遺伝子は、例えば、ブルクホルデリア・セパシアKS1株の染色体DNAを鋳型とするPCRによって、取得することができる。PCR用プライマーは、前記の塩基配列に基づいて化学合成することによって調製することができる。また、前記配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーションによって、ブルクホルデリア・セパシアKS1株の染色体DNAから取得することもできる。また、ブルクホルデリア・セパシアの他の菌株からも、同様にしてバリアントを取得することができる。他の菌株としては、前記のJCM2800株及びJCM2801株が挙げられる。これらの菌株が産生するGDHのαサブユニットは、KS1株のαサブユニットと各々95.4%及び93.7%の相同性を有している。
また、他の微生物が産生するGDHであっても、ブルクホルデリア・セパシアのGDHと類似の構造及び酵素学的性質を有するものであれば、本発明の変異GDHの製造に用いることができる。このようなGDHとしては、例えば(i)Burkholderia pseudomallei, (ii)Burkholderia mallei, (iii)Ralstonia solanacearum由来のGDHが挙げられる((i)、(ii)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (39), 14240-14245 (2004), (iii)Nature 415 (6871), 497-502 (2002))。
本発明の変異GDHは、上記のような野生型GDH又は保存的変異を有するGDHが特定の変異を有することによって、グルコースに対する基質特異性が向上したものである。「グルコースに対する基質特異性が向上した」とは、グルコースに対する反応性を実質的に維持したまま、他の単糖類、二糖類又はオリゴ糖等の糖類、例えばマルトース、ガラクトース、キシロース等に対する反応性が低下したこと、あるいは、グルコースに対する反応性が他の糖類に対する反応性に比べて向上したことを含む。例えば、グルコースに対する反応性が低下しても、他の糖類に対する反応性がそれ以上に低下すれば、グルコースに対する基質特異性は向上する。また、他の糖類に対する反応性が上昇しても、グルコースに対する基質特異性がそれ以上に上昇すれば、グルコースに対する基質特異性は向上する。具体的
には例えば、野生型酵素に対する変異型酵素の基質特異性(グルコースに対する比活性と、他の糖類、例えばマルトース、に対する比活性との比)の向上(下記式で表される)が、10%以上、好ましくは20%以上、より好ましくは40%以上であれば、グルコースに対する基質特異性は向上している。例えば、基質特異性が、野生型酵素では60%、変異型GDHでは40%の場合、グルコース以外の糖類に対する反応性は、33%低下している。

基質特異性=(グルコース以外の糖類に対する比活性/グルコースに対する比活性)×100)

基質特異性の向上=(A−B)×100/A
A:野生型酵素の基質特異性
B:変異型酵素の基質特異性

また、変異型GDHは、マルトースに対する反応性(比活性)がグルコースに対する反応性(比活性)の30%以下、好ましくは20%以下であることが好ましい。
前記特定の変異とは、具体的には以下のとおりである。
(1)配列番号3に示すアミノ酸配列の365位に相当するアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換。
(2)配列番号3に示すアミノ酸配列の365位に相当するアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換、及び、324、326、333、334、368、369、376、377、418、419、436、433、448、472、475、525、及び529の少なくとも1つ、又は任意の2以上の位置に相当するアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換。
(3)(i)配列番号3に示すアミノ酸配列の324、326、333、334、365、368、369、376、377、418、419、436、433、448、525、及び529から選ばれる少なくとも1つ、又は任意の2以上の位置に相当するアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換、(ii)472位に相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換、及び(iii)475位に相当するアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換。
また、前記特定の変異としては、GDHのアミノ酸配列中に、配列番号7に示すアミノ酸配列を含む変異が挙げられる。配列番号7に示すアミノ酸配列は、配列番号3に示すGDHにおいては、360位〜366位に相当する。ブルクホリデリア・セパシア以外のFAD結合型GDHであっても、野生型GDHが配列番号7に示すアミノ酸配列を含まない場合、配列番号7のアミノ酸配列を含む変異型GDHは、基質特異性が向上していると考えられる。
前記(1)の変異において、他のアミノ酸残基としては、セリン以外のアミノ酸、具体的にはフェニルアラニン、チロシン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニン、トリプトファン、リシン、アスパラギン、ロイシン、システイン、トレオニン、イソロイシン、グリシン、バリン、メチオニン、グルタミン、グルタミン酸、アラニン、プロリンが挙げられる。これらの中では、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン及びヒスチジンが好ましい。
前記(2)の変異において、他のアミノ酸残基としては、野生型GDHの各々の位置におけるアミノ酸残基以外のアミノ酸が挙げられる。前記のアミノ酸置換の位置の中でも、326位、472位、475位、及び529位が好ましく、472位及び475位がさらに好ましい。472位及び475位に相当するアミノ酸残基の置換は、それぞれ単独でもよいが、両方置換されていることがより好ましい。
472位においては、置換後のアミノ酸残基は、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸、又はヒスチジンが好ましく、アスバラギン酸が特に好ましい。
475位においては、置換後のアミノ酸残基はヒスチジン又はセリンが好ましく、ヒスチジンが特に好ましい。
326位においては、置換後のアミノ酸残基は、グルタミン又はバリンが好ましい。
529位においては、置換後のアミノ酸残基は、チロシン、ヒスチジン又はトリプトファンが好ましい。
上記の好ましいアミノ酸置換の態様は、前記(3)の変異においても同様である。
上記アミノ酸置換変異の位置は、配列番号3、すなわちブルクホリデリア・セパシアKS1株の野生型GDH αサブユニットのアミノ酸配列における位置であるが、配列番号3のアミノ酸配列において、前記特定の変異以外に、1又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するGDH αサブユニットのホモログ又はバリアントにおいては、配列番号3のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、前記アミノ酸置換の位置に相当する位置を示す。例えば、1〜364位の領域において1個のアミノ酸残基の欠失を有するGDH αサブユニットの保存的バリアントにおいては、365位とは、前記バリアントの364位を示す。
本発明の変異型GDHの好ましい変異の態様を以下に示す。
(数字はアミノ酸配列における位置を、アミノ酸残基は前記位置における置換後のアミノ酸残基を示し、「+」は同時に2つのアミノ酸置換を有することを示す。)
(A)365Arg、365Asn、365Asp、365Cys、365Glu、365Gly、365His、365Ile、365Leu、365Met、365Phe、365Pro、365Trp、365Tyr、365Val、365Lys、365Gln、365Thr、365Ala
(B)326Gln、326Val、326Arg
(C)529His、529Tyr、529Trp
(D)365Tyr+326Gln、365Tyr+326Val、365Tyr+326Arg、365Tyr+472Phe、365Tyr+472Ile、365Tyr+472Asn、365Tyr+472Asp、365Tyr+472His、365Tyr+472Leu、365Tyr+472Ser、365Tyr+475Ser、365Tyr+475His、365Phe+472Phe
(E)472Asp+475His+365Phe、472Asp+475His+326Gln、472Asp+475His+326Thr、472Asp+475His+326Val、472Asp+475His+529Trp、472Asp+475His+529His、472Asp+475His+529Tyr、472Tyr+475His+365Phe、472Tyr+475His+365His、472Tyr+475His+326Val、472Ile+475His+326Gln
(F)472Asp+475His+529His+326Gln、472Asp+475His+529Trp+326Gln
本発明者は、FADを補酵素として有するGMCオキシドレダクターゼファミリーであるグルコノバクター・オキシダンスのソルビトール脱水素酵素(GenBank accession AB039821)、エルビニア・ヘルビコーラの2−ケトグルタル酸脱水素酵素(GenBank accession AF068066)、ファネロケート・クリソスポリウムのセロビオース脱水素酵素(CDH)(J. Mol. Biol., 315(3), 421-34 (2002))、ストレプトマイセス・スピシーズのコレステロールオキシターゼ(COD)(J. Struct. Biol. 116(2), 317-9(1996))、ペニシリウム
・アマガサキエンスのグルコースオキシダーゼ(Eur. J. Biochem. 252, 90-99(1998))のアミノ酸配列を比較し、FAD結合ドメイン及びFAD-covering lid等の保存された領域、およびタンパク質の折りたたみに関与するアミノ酸残基であるプロリンが保存されている領域を見い出した。そして、これらの領域と他の領域との境界付近の配列を改変することにより、基質特異性を向上できる可能性について検討を行った。具体的にはR53〜H73、E88〜A108、N308〜G336、K362〜A377、A391〜R497、S509〜V539を検討した。その結果、上記領域の中において基質特異性を向上することができる場所をいくつか発見した。
所望の変異を有するGDH αサブユニットは、GDH αサブユニットをコードするDNA(αサブユニット遺伝子)に、部位特異的変異法によって、所望のアミノ酸変異に対応するヌクレオチド変異を導入し、得られる変異DNAを適当な発現系を用いて発現させることによって、取得することができる。また、変異GDH αサブユニットをコードするDNAを、βサブユニットをコードするDNA(βサブユニット遺伝子)、又はβサブユニット遺伝子とγサブユニットをコードするDNA(γサブユニット遺伝子)とともに発現させることによって、変異GDH複合体を取得することができる。尚、GDH αサブユニットをコードするDNAへの変異の導入は、γサブユニット、αサブユニット及びβサブユニットをこの順にコードするポリシストロニックなDNA断片を用いてもよい。
変異が導入されたGDH αサブユニット又はGDH複合体の糖類に対する基質特異性は、実施例に記載された方法によって各種糖類に対する反応性を調べ、野生型GDH αサブユニット又は野生型GDH複合体の反応性と比較することよって、決定することができる。
γサブユニット、αサブユニット及びβサブユニットをこの順にコードするポリシストロニックなDNA断片は、例えば、ブルクホルデリア・セパシアKS1株の染色体DNAを鋳型とし、配列番号8、9の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするPCRによって取得することができる(後記実施例参照)。
GDHの各サブユニットの遺伝子の取得、変異の導入、遺伝子の発現等に用いるベクターとしては、例えばエシェリヒア属細菌で機能するベクター、具体的にはpTrc99A、pBR322、pUC18、pUC118、pUC19、pUC119、pACYC184、pBBR122等が挙げられる。遺伝子の発現に用いるプロモーターとしては、例えばlac、trp、tac、trc、PL、tet、PhoA等が挙げられる。また、プロモーターを含む発現ベクターの適当な部位に、αサブユニット遺伝子又は他のサブユニット遺伝子を挿入することによって、これらの遺伝子のベクターへの挿入とプロモーターの連結とを同じ工程で行うことができる。このような発現ベクターとしては、pTrc99A、 pBluescript、pKK223-3等が挙げられる。
また、αサブユニット遺伝子又は他のサブユニット遺伝子は、発現可能な形態で宿主微生物の染色体DNA中に組み込まれてもよい。
組換えベクターで微生物を形質転換するには、例えばカルシウム処理によるコンピテントセル法、プロトプラスト法又はエレクトロポレーション法等が挙げられる。
宿主微生物としては、バチルス・サブチリス等のバチルス属細菌、サッカロマイセス・セレビシエ等の酵母、アスペルギルス・ニガー等の糸状菌が挙げられるが、これらに限られず、異種タンパク質生産に適した宿主微生物であれば用いることができる。
本発明の変異αサブユニットもしくは変異GDH複合体又はこれらを発現する微生物は、グルコースセンサの酵素電極、又はグルコースのアッセイキットの構成要素として用いることができる。ブルクホルデリア・セパシアの野生型GDHを用いたグルコースセンサ及びグルコースアッセイキットは、米国特許公開第2004/0023330A1に記載されている。本発明
の変異GDHも、同様にして使用することかできる。
次に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
〔実施例1〕ブルクホルデリア・セパシアのGDHを発現するプラスミド
ブルクホルデリア・セパシアのGDHを発現するプラスミドとして、GDHのαサブユニット及びγサブユニットを発現するプラスミド、並びに、αサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットを発現するプラスミドを用意した。
<1>GDHのαサブユニット及びγサブユニットを発現するプラスミド
αサブユニット及びγサブユニットを発現するプラスミドとしては、WO02/036779(EP1331272A1、US2004023330A1、CN1484703Aに対応)に記載のプラスミドpTrc99A/γ+αを使用した。同プラスミドは、ブルクホルデリア・セパシアKS1株(FERM BP-7306)染色体DNAから単離された、GDH γサブユニット構造遺伝子とαサブユニット構造遺伝子を連続して含むDNA断片が、ベクターpTrc99A(Pharmacia社)のクローニング部位であるNcoI/HindIIIに挿入されてなるプラスミドである。本プラスミド中のGDHγα遺伝子は、trcプロモーターによって制御される。pTrc99A/γ+αは、アンピシリン耐性遺伝子を保持している。
<2>GDHのαサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットを発現するプラスミド
GDHのαサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットを発現するプラスミドは、以下のようして調製した。
(1)ブルクホルデリア・セパシア KS1株からの染色体DNAの調製
ブルクホルデリア・セパシア KS1株より染色体遺伝子を常法に従って調製した。すなわち、同菌株をTL液体倍地(ポリペプトン 10g、酵母抽出液 1g、NaCl 5g、KH2PO4 2g、グルコース 5g;1L、pH 7.2)を用いて、34℃で一晩振盪した。増殖した菌体を遠心分離により回収した。この菌体を10mM NaCl、20mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、0.5% SDS、100μg/mlのプロテイナーゼKを含む溶液に懸濁し、50℃で6時間処理した。ここに等量のフェノール−クロロホルムを加えて室温で10分間撹拌した後、遠心分離により上清を回収した。これに終濃度0.3Mになるように酢酸ナトリウムを加え、2倍量のエタノールを重層して中間層に染色体DNAを析出させた。これをガラス棒を用いてすくいとり、70%エタノールで洗浄した後、適当量のTEバッファーに溶解させ、染色体DNA溶液とした。
(2)GDHのγサブユニット、αサブユニット及びβサブユニットをコードするDNA断片の調製
前記染色体DNAを鋳型として、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするPCRにより、GDHのγサブユニット、αサブユニット及びβサブユニットをコードするDNA断片を増幅した。
〔フォワードプライマー〕
5'-CATGCCATGGCACACAACGACAACAC-3'(配列番号8)
〔リバースプライマー〕
5'-GTCGACGATCTTCTTCCAGCCGAACATCAC-3'(配列番号9)
増幅した断片のC末端側を平滑末端化した後、N末端側をNcoIで消化し、同様に処理したpTrc99A(Pharmacia社)にライゲーションした。得られた組換えベクターでE. coli DH5αを形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天培地で生じるコロニーを採取した。
得られた形質転換体を液体のLB培地で培養してプラスミドを抽出し、その挿入DNA断片を解析したところ、約3.8kbの挿入断片が確認された。本プラスミドをpTrc99Aγαβと命名した。本プラスミド中のGDHの各構造遺伝子は、trcプロモーターによって制御される。pTrc99Aγαβは、アンピシリン耐性遺伝子及びカナマイシン耐性遺伝子を保持している。
〔実施例2〕GDH αサブユニット遺伝子への変異導入による基質相互作用部位の探索
(1)472位及び475位への変異導入
実施例1で得られたpTrc99Aγαβに含まれるGDH αサブユニット遺伝子に、同遺伝子がコードするαサブユニットの472位のアラニン残基をアスパラギン酸残基に、および475位のアスパラギン残基をヒスチジン残基に置換されるような変異を導入した。この変異体を472D+475H変異体と称する。これらの変異により基質特性が改善されることは、本発明者らはすでに確認している。
具体的には、市販の部位特異的変異導入キット(Stratagene社、QuikChangeII Site-Directed Mutagenesis Kit)を用いて、実施例1に記載のプラスミドpTrc99A/γ+α及びpTrc99Aγαβに含まれるGDH αサブユニット遺伝子の475位のアスパラギンのコドン(AAT)をアスパラギン酸(GAT)又はグルタミン酸(GAA)のコドンに置換した。プライマーには、下記のオリゴヌクレオチドを使用した。
〔A472D変異導入用プライマー〕
フォワードプライマー:配列番号224
5'-CGTGTTCAACGACGAATTCGATCCGAACAATCACATCACGG-3'
リバースプライマー :配列番号225
5'-CCGTGATGTGATTGTTCGGATCGAATTCGTCGTTGAACACG-3'
〔N475H変異導入用プライマー〕
フォワードプライマー:配列番号226
5'-AATTCGCGCCGAACCACCACATCACGGGCTC-3'
リバースプライマー :配列番号227
5'-GAGCCCGTGATGTGGTGGTTCGGCGCGAATT-3'
(2)472位及び475位以外の位置への変異導入
前記で得られた472D+475H変異体をコードする変異遺伝子を用いて、さらに以下に示す領域のアミノ酸残基のフェニルアラニンへの置換を実施した。ただし、野生型のアミノ酸残基がフェニルアラニンである位置については、アミノ酸置換は行わなかった。尚、下記の数字はアミノ酸配列における位置を、数字の前のアルファベットはアミノ酸の種類を示す。例えば、R53は、53位のアルギニンを示す。
(i)R53〜H73
(ii)E88〜A108
(iii)N308〜G336
(iv)K362〜A377
(v)A391〜R497
(vi)S509〜V539
なお変異を導入するターゲットのαサブユニット遺伝子に関しては、変異の組み合わせによる相乗効果を狙って、既に基質特性改善効果を確認済みである472D+475H変異体を用いた。
前記アミノ酸残基置換に用いたフォワードプライマーの配列を以下に示す。リバースプ
ライマーの配列は、フォワードプライマーの完全相補鎖とした。
尚、変異を表す表記において、数字はアミノ酸配列における位置を、数字の前のアルファベットはアミノ酸置換前のアミノ酸残基を、数字の後のアルファベットはアミノ酸置換後のアミノ酸残基を示す。例えば、R53Fは、53位のアルギニンからフェニルアラニンへの置換を示す。
PCR反応は、以下の反応組成で、95℃、30秒の後、95℃ 30秒、55℃ 1分、68℃ 8分を15サイクル繰り返し、68℃ 30分の反応を行った後、4℃で保持した。
〔反応液組成〕
鋳型DNA(5ng/μl) 2μl
(472D+475H導入pTrc99A/γ+α及びpTrc99Aγαβ)
10×反応緩衝液 5μl
フォワードプライマー(100ng/μl) 1.25μl
リバースプライマー(100ng/μl ) 1.25μl
dNTP 1μl
蒸留水 38.5μl
DNAポリメラーゼ 1μl
合計 50μl
PCR反応の後、反応液にDNAポリメラーゼIを0.5μl添加し、37℃で1時間インキュベートし、鋳型プラスミドを分解させた。
得られた反応液で、エシェリヒア・コリDH5α(supE44, ΔlacU169(φ80lacZΔM15), hsdR17, recAi, endA1, gyrA96, thi-1, relA1)のコンピンテントセルを形質転換した。アンピシリン(50μg/ml)およびカナマイシン(30μg/ml)を含むLB寒天培地(バクトリプトン1%、酵母エキス0.5%、塩化ナトリウム1%、寒天1.5%)上に生育してきたコロニー数個からプラスミドDNAを調製し、配列解析を行って、GDH αサブユニット遺伝子に目的の変異が導入されたことを確認した。
Figure 0005341312
Figure 0005341312
Figure 0005341312
Figure 0005341312
Figure 0005341312
Figure 0005341312
Figure 0005341312
〔実施例3〕変異GDHの基質特異性の解析
実施例2で得られた変異GDH発現プラスミドを用いて、変異GDHを製造し、基質特異性を検討した。
(1)培養
変異導入したエシェリヒア・コリDH5α株を、各々2mlのLB培地(アンピシリン50μg/ml及びカナマイシン30μg/ml含有)で、L字管を用いて37℃で一晩振とう培養した。それらの培養液を、150mlのLB培地(アンピシリン50μg/mlおよびカナマイシン30μg/ml含有)を含む500mlの坂口フラスコに植菌し、37℃で振とう培養した。培養開始から3時間後にIPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド)を終濃度0.1mMになるように添加し、さらに2時間培養した。
(2)粗酵素サンプルの調製
前記で培養した培養液から菌体を集め、洗浄後、湿菌体0.3mgあたり1mlの0.2% Triton X100を含む10mMリン酸カリウムバッファー(PPB)(pH7.0)で菌体を懸濁し、超音波破砕した。この懸濁液遠心分離(10000r.p.m、10分、4℃)して残渣を除去した後、上清を超遠心分離(50,000r.p.m.、60分、4℃)し、得られた上清(水溶性画分)を、粗酵素サンプルとした。また、このサンプルを、通常の疎水性クロマトグラフィー(カラム名:オクチルセファロース(アマシャム・バイオサイエンス製)およびイオン交換クロマトグラフィー(Q-セファロース(アマシャム・バイオサイエンス製)により精製して、精製酵素サンプルを得た。目的とする酵素画分の決定は、GDH活性を指標として行った。
(3)GDH活性の測定
前記酵素サンプル8μlに、活性測定用試薬(12μlの600mM メチルフェナジンメトサルフェート(PMS)、120μlの6 mM 2,6-ジクロロフェノールインドフェノール(DCIP)に、0.2(w/v)% Triton X-100 10mM PPBを加え、全量480μlとした溶液)を8μl添加した。これをアルミブロック恒温槽を用いて、各反応温度で1分間プレインキュベートした後、素早く各濃度の基質(グルコース又はマルトース)、または蒸留水を8μl加えて攪拌し、分光光
度計を用いてDCIP由来の吸収波長である600 nmの吸光度を測定した。各試薬の終濃度はDCIP:0.06mM、PMS、0.6mM。基質の終濃度は5mMである。
結果を、表8〜14に示す。尚、野生型GDHの反応比は48%であった。
Figure 0005341312
Figure 0005341312
Figure 0005341312
Figure 0005341312
Figure 0005341312
Figure 0005341312
Figure 0005341312
この結果、472D+475H+365Fが、グルコース対する反応性を維持しつつ、
マルトースとの反応性が1%台まで低下する大変効果の高い変異であった。
365位以外の変異では、G324、S326、L333、W334、S368、R369、K376、I377、V418、P419、Y436、K433、H448、A525、L529のフェニルアラニンへの変異がマルトースとの反応性において変異導入前の60%以下となり効果が見られた。
〔実施例4〕365位への変異導入の検証
実施例3で得られた結果から、365位はマルトースとの反応性低下において大変効果的な部位であることが推察された。よってこの部位の詳細な検討を行なう事とした。
具体的にはαサブユニット遺伝子に対する、365位への単変異導入による基質特性改善効果を検証した。
pTrc99Aγαβに含まれる野生型GDH αサブユニット遺伝子の365位に変異導入を実施し、変異酵素の基質特異性を評価した。変異導入に関しては実施例2と同様に行なった。
変異導入用フォワードプライマーは以下の通りである。リバースプライマーは、フォワードプライマーの完全相補鎖とした。
Figure 0005341312
〔実施例5〕変異GDHの基質特異性の解析
実施例4で得られた変異GDH発現プラスミドを用いて、実施例3と同様にして、変異GDHを製造し、基質特異性を検討した。酵素活性は、粗酵素サンプルを用いて行った。それぞれの変異GDHのグルコースに対する比活性、マルトースに対する比活性、反応比(マルトースに対する比活性/グルコースに対する比活性。単位はU/ml)を、表16に示す。基質濃度に関しては5mMおよび10mMにて評価した。
Figure 0005341312
その結果、365位に関しては、野生型でのセリン残基以外の19種類全てのアミノ酸置換で基質特性改善効果が認められた。具体的には全てのアミノ酸置換で、野生型と比較し、マルトースに対する反応性が50%以上低下していた。特にチロシン、トリプトファンへの置換では、基質濃度5mM, 10mMのいずれにおいても、野生型が反応比40%程度であるのに対し、2%以下と、マルトースに対する反応性が野生型の90%以上低下し、極めて大きな基質特性改善効果が認められた。
〔実施例6〕365位と他の部位との組み合わせ効果の検証
実施例2および実施例5の結果により、365位は少なくとも365Fと472D+475Hの組み合わせにおいて効果が確認され、さらに365位のみの単変異導入において全てのアミノ酸置換にて効果が見られた事から、基質特性改善効果の大変高い部位であることが明らかになった。よって、365位のアミノ酸置換と他の部位とのアミノ酸置換との組み合わせによる、更なる基質特性改善を目指し、さらに鋭意検討を行なった。具体的には365位と326位、529位、472位の何れかとの組み合わせに2変異導入、並びに472及び475位の変異との組み合わせによる3変異導入を検討した。
Figure 0005341312
Figure 0005341312
検討した全ての部位との組み合わせにおいて相乗効果的に基質特性が改善されることが見出され、365位は基質特性を改善する別の部位におけるアミノ酸置換との組み合わせにより更に基質特性を改善できることが明らかとなった。
〔実施例7〕472位及び475位と、他の部位との組み合わせ効果の検証
実施例6の結果により、基質特性改善効果のあるアミノ酸置換は、それらの部位同士の組み合わせにより相乗効果的に基質特性が改善される可能性が示唆された。
よって、すでに発明者らによって基質特性改善効果が確認されている部位である472、475位と365以外の部位との組み合わせ効果を検証した。
具体的には472位と475位の組み合わせにおいて最も基質特性改善効果の高かった472D+475Hと、326位又は529位との組み合わせを検証した。また、472位及び475位の他の変異についても、同様に検証した。
Figure 0005341312
Figure 0005341312
Figure 0005341312
472及び475位と、他の部位との組み合わせにおいても相乗効果が確認された。特に472、475、326、529位の4変異導入はマルトースに対する反応性低下効果が高く、この結果からも基質特性改善効果のあるアミノ酸置換同士の組み合わせにより相乗効果的に基質特性を改善できることが示された。
〔実施例〕精製酵素の調製
実施例5および6で基質特異性の改善が認められたいくつかの変異GDHについて精製を実施した。方法は実施例3に記載の通りに行なった。各精製酵素のグルコースに対する比活性(U/mg)を表8に示す。
その結果、S365Yを含む変異は、グルコースに対する比活性を90%近く維持し、グルコース測定の観点からは好適な変異であることが明らかとなった。またS326Q変異はグルコースに対する比活性を上げる効果があることも判明した。
Figure 0005341312
〔実施例〕変異GDHを用いた血糖測定用比色式センサの作製
実施例で得られた精製変異酵素を用いてグルコースセンサを作製した。
図1に示す基本構成を有するグルコースセンサを作製した。すなわち、前記グルコースセンサは、透明基板2Aに対してスペーサー3を介して透明カバー4A(材質PET)を積層した形態を有し、各要素2A〜4Aによってキャピラリ5Aが規定されている。キャピラリ5Aの寸法は、1.3mm×9mm×50μmである(図1)。透明基板2Aおよび透明カバー4Aは、厚みが250μmであるPETにより形成し、スペーサー3Aは黒色の両面テープにより構成した。
グルコースセンサは、図2に示す第1試薬部〜第3試薬部を有し、それぞれ成分及び塗
布量を表23に示す。表中、「Ru」は、ヘキサルテニウムアンミン錯体(Ru(NH3)6Cl3)を、CHAPSは3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio] propanesulfonic acidを、ACESはN-(2-acetamido)-2-aminoethanesulfonic acidを、MTTは3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromideを、各々示す。
Figure 0005341312
上記グルコースセンサのキャピラリに測定試料を供給し、その時点から0.1秒毎に吸光度を繰り返し測定して、吸光度のタイムコースを作成した。各回の吸光度の測定においては、第3試薬部に対して、キャピラリの高さ方向に沿って光を照射し、そのときにグルコースセンサを透過した光を受光した。光の照射は、発光ダイオードを用いて630nmの光を照射することにより行なった。透過光は、フォトダイオードにおいて受光した。
測定試料としては、グルコースを添加した血液を用いた。ヘマトクリットを42%に調整した血液に、0,100,200,400,600又は800mg/dlの濃度になるようにグルコースを添加したものを用いて、グルコースセンサの直線性を評価した。なお直線性評価は測定試料のセンサへの導入5秒後のエンドポイントの吸光度をプロットする事により行なった。結果を、図3に示す。
また、ヘマトクリット値45%、グルコース濃度45mg/dlに調整した血液に、さらにマルトースを0,100,200又は300mg/dlになるように添加したものを用いて、マルトースの影響を評価した。結果を、図4に示す。この試験も同様に測定試料導入5秒後の吸光度をプロットする事により行なった。
グルコースを基質として用いた直線性評価では、全ての酵素に関して濃度依存的に吸光度が増加し、グルコースを測定可能であることが分かる。特に365を含む変異である365Yおよび326Q365Yは野生型より直線性が伸びており、より高濃度域(600mg/dl付近)まで測定可能であることが示唆される。
次にマルトース影響に関してであるが、グルコース45mg/dlにマルトースを添加した場合、野生型ではマルトース濃度に依存して吸光度が大きく増加し、マルトースと強く反応していることが示唆される。一方変異酵素を用いたセンサでは、マルトース濃度に応じた吸光度の増加が抑えられており、マルトースの影響が少なくなっていることがわかる。これらのデータを見かけの血糖上昇値に換算した結果を図5及び表24に示す。野生型酵素
を用いたセンサでは、低血糖(45mg/dlグルコース)がマルトースの混入によって正常域以上の(138mg/dlグルコース)に見かけ上表示されてしまう。一方、改変GDHを用いたセンサでは、マルトースが最大300mg/dl混入している場合でも、見かけの血糖値が最大でも60mg/dlまでしか上昇せず、影響は大幅に押さえられていると言える。結論としては365を含む変異が、グルコースに対する反応性(直線性)とマルトース影響の観点から最適であることが示唆される。
Figure 0005341312
以上の結果から明らかなように、変異GDHを用いたグルコースセンサは、直線性も野生型と同程度以上確保されているにも関わらず、マルトースとの反応性が大きく低下している。この変異GDHを用いたグルコースセンサを用いれば、病院等で投与される血中マルトース濃度の上限値である200mg/dlにおいては正誤差は無いと言え、上限値以上の300mg/dlにおいても低血糖(50mg/dl以下)が正常値や高血糖と判定されること無く、安全な治療が行なえる。また前述の通りGDHは溶存酸素とも反応しないことから、この変異GDHを用いたセンサを提供することで、糖尿病患者の正確な診断治療が行なえる。
〔実施例10〕精製酵素のSVプロット評価
実施例5および6で特に基質特異性改善効果が認められた365Yおよび326Q+365Y変異GDHについて、精製酵素を用いたSVプロットを取得した。
その結果、精製した酵素においても、試験した全ての基質濃度に関して、反応比(マルトースに対する比活性/グルコースに対する比活性)が野生型と比べて大幅に低くなり改善されていることが確認できた。また結果に関しても粗酵素溶液による測定結果とほぼ一致したことから、粗酵素による改変酵素の評価は十分可能であることが確認できた。さらに付け加えると、マルトース輸液による、血中のマルトース濃度の上昇は最大でも200mg/dlまでしか上昇しないことから、特に基質濃度10mM(360mg/dl)と5mM(180mg/dl)における反応比に注目した。その結果、この濃度域におけるS365Y変異のマルトース/グルコース反応比は0.1%と、殆どマルトースとは反応しないことが示唆された。
また326Qを365Yに付加することで、グルコースに対する比活性を上げ、相対的にマルトースとの反応性を下げることが出来ることも明らかとなった。
Figure 0005341312
本発明の変異GDHは、グルコースに対する基質特異性が向上しており、グルコースセンサ等を用いたグルコースの測定に好適に使用することができる。
グルコースセンサの構造を示す図。 グルコースセンサの各試薬部を示す図。 変異型GDHを用いたグルコースセンサのグルコースに対する反応性を示す図。 変異型GDHを用いたグルコースセンサの、グルコース存在下におけるマルトースに対する反応性を示す図。 野生型GDH及び変異GDHを用いたグルコースセンサを用いて測定された見かけ上の血糖値を示す図。

Claims (25)

  1. 配列番号3に示すアミノ酸配列、又は、同アミノ酸配列において365位以外の1又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質において、配列番号3に示すアミノ酸配列の365位に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換され、365位に相当する位置のアミノ酸残基が野生型であるグルコース脱水素酵素と比較し、マルトースに対する反応性が低下したことを特徴とする、グルコースに対する基質特異性が向上した変異グルコース脱水素酵素。
  2. 365位に相当する位置以外は配列番号3に示すアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の変異グルコース脱水素酵素。
  3. 精製酵素の5mMマルトースに対する反応性が5mMグルコースに対する反応性の20%以下であるか、および/または、精製酵素の10mMマルトースに対する反応性が10mMグルコースに対する反応性の20%以下であることを特徴とする請求項1または2に記載の変異グルコース脱水素酵素。
  4. 前記他のアミノ酸残基が、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン及びヒスチジンから選ばれるアミノ酸残基であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか一項に記載の変異グルコース脱水素酵素。
  5. 前記365位以外の1又は複数のアミノ酸残基が、配列番号3のアミノ酸配列における324、326、333、334、368、369、376、377、418、419、436、433、448、472、475、525、及び529から選ばれる少なくとも1つの位置に相当するアミノ酸残基であり、当該アミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された、請求項1〜4のいずれか一項に記載の変異グルコース脱水素酵素。
  6. 前記位置が、326、472、475、及び529から選ばれる少なくとも1つである請求項5に記載の変異グルコース脱水素酵素。
  7. 前記位置が、472位である請求項6に記載の変異グルコース脱水素酵素。
  8. 前記位置が、475位である請求項6に記載の変異グルコース脱水素酵素。
  9. 前記位置が、472位及び475位の両方である請求項6に記載の変異グルコース脱水素酵素。
  10. 前記位置が、326位である請求項6に記載の変異グルコース脱水素酵素。
  11. 前記位置が、529位である請求項6に記載の変異グルコース脱水素酵素。
  12. 472位に相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸、及びヒスチジンから選ばれるアミノ酸に置換されたことを特徴とする請求項7に記載の変異グルコース脱水素酵素。
  13. 475位に相当するアミノ酸残基がヒスチジン又はセリンに置換されたことを特徴とする請求項8に記載の変異グルコース脱水素酵素。
  14. 326位のセリンに相当するアミノ酸残基がグルタミン又はバリンに置換されたことを特徴とする請求項10に記載の変異グルコース脱水素酵素。
  15. 529位のロイシンに相当するアミノ酸残基がチロシン、ヒスチジン又はトリプトファンに置換されたことを特徴とする請求項11に記載の変異グルコース脱水素酵素。
  16. 配列番号3に示すアミノ酸配列、又は、同アミノ酸配列において、1又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質において、(i)配列番号3に示すアミノ酸配列における324、326、333、334、365、368、369、376、377、418、419、436、433、448、525、及び529から選ばれる少なくとも1つの位置に相当するアミノ酸残基のフェニルアラニンへの置換、(ii)472位に相当する位置のアミノ酸残基のアスパラギン酸への置換、及び(iii)475位に相当するアミノ酸残基のヒスチジンへの置換を含み、(i)において選択された位置のアミノ酸残基が野生型であるグルコース脱水素酵素と比較し、グルコースに対する比活性とマルトースに対する比活性との比が向上したことを特徴とする、グルコースに対する基質特異性が向上した変異グルコース脱水素酵素。
  17. 配列番号3に示すアミノ酸配列、又は、同アミノ酸配列において、1又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質において、(i)配列番号3に示すアミノ酸配列における326位に相当するアミノ酸残基のグルタミン又はバリンへの置換、(ii)472位に相当する位置のアミノ酸残基のアスパラギン酸への置換、及び(iii)475位に相当するアミノ酸残基のヒスチジンへの置換を含み、326位に相当する位置のアミノ酸残基が野生型であるグルコース脱水素酵素と比較し、マルトースに対する反応性が低下したことを特徴とする、グルコースに対する基質特異性が向上した変異グルコース脱水素酵素。
  18. 配列番号3に示すアミノ酸配列、又は、同アミノ酸配列において、1又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質において、(i)配列番号3に示すアミノ酸配列における529位に相当するアミノ酸残基のチロシン、ヒスチジン又はトリプトファンへの置換、(ii)472位に相当する位置のアミノ酸残基のアスパラギン酸への置換、及び(iii)
    475位に相当するアミノ酸残基のヒスチジンへの置換を含み、529位に相当する位置のアミノ酸残基が野生型であるグルコース脱水素酵素と比較し、マルトースに対する反応性が低下したことを特徴とする、グルコースに対する基質特異性が向上した変異グルコース脱水素酵素。
  19. 配列番号3のアミノ酸配列の360〜366位のアミノ酸配列に対応する位置に配列番号7のアミノ酸配列を含み、配列番号3に示すアミノ酸配列と93.7%以上の同一性を有する、FAD結合型変異グルコース脱水素酵素。
  20. 請求項1〜19のいずれか一項に記載の変異グルコース脱水素酵素と、電子伝達サブユニットとを少なくとも含む変異グルコース脱水素酵素複合体。
  21. 電子伝達サブユニットがシトクロムCであることを特徴とする請求項20に記載のグルコース脱水素酵素複合体。
  22. 請求項1〜19のいずれか一項に記載の変異グルコース脱水素酵素をコードするDNA。
  23. 請求項22に記載のDNAを保持し、請求項1〜19のいずれか一項に記載の変異グルコース脱水素酵素又は請求項20に記載の変異グルコース脱水素酵素複合体を産生する微生物。
  24. 請求項1〜19のいずれか一項に記載の変異グルコース脱水素酵素、請求項20に記載の変異グルコース脱水素酵素複合体、又は請求項23に記載の微生物を含む、グルコースアッセイキット。
  25. 請求項1〜19のいずれか一項に記載の変異グルコース脱水素酵素、請求項20に記載の変異グルコース脱水素酵素複合体、又は請求項23に記載の微生物を含む、グルコースセンサ。
JP2006541525A 2005-06-20 2006-06-12 変異グルコース脱水素酵素 Active JP5341312B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006541525A JP5341312B2 (ja) 2005-06-20 2006-06-12 変異グルコース脱水素酵素

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005179231 2005-06-20
JP2005179231 2005-06-20
JP2006541525A JP5341312B2 (ja) 2005-06-20 2006-06-12 変異グルコース脱水素酵素
PCT/JP2006/311774 WO2006137283A1 (ja) 2005-06-20 2006-06-12 変異グルコース脱水素酵素

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2006137283A1 JPWO2006137283A1 (ja) 2009-01-15
JP5341312B2 true JP5341312B2 (ja) 2013-11-13

Family

ID=37570313

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2006541525A Active JP5341312B2 (ja) 2005-06-20 2006-06-12 変異グルコース脱水素酵素

Country Status (9)

Country Link
US (2) US7604969B2 (ja)
EP (2) EP2077321B1 (ja)
JP (1) JP5341312B2 (ja)
KR (2) KR101387240B1 (ja)
CN (1) CN101107353B (ja)
AT (2) ATE520771T1 (ja)
DE (1) DE602006011858D1 (ja)
TW (2) TWI485249B (ja)
WO (1) WO2006137283A1 (ja)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE60331477D1 (de) 2002-12-24 2010-04-08 Ikeda Food Res Co Ltd Coenzymbindende glukosedehydrogenase
CN100479750C (zh) * 2003-09-02 2009-04-22 早出广司 葡萄糖传感器和葡萄糖浓度测定装置
EP2365074A1 (en) 2005-03-25 2011-09-14 Ikeda Food Research Co. Ltd. Coenzyme-linked glucose dehydrogenase and polynucleotide encoding the same
CN101970656A (zh) * 2007-12-28 2011-02-09 池田食研株式会社 经修饰葡萄糖脱氢酶基因
CA2759911A1 (en) * 2009-04-30 2010-11-04 Ikeda Food Research Co. Ltd. Protein electron mediator
JP5803081B2 (ja) * 2009-10-09 2015-11-04 東洋紡株式会社 Fadジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼの温度依存性を改善する方法
CN103003440B (zh) 2010-07-23 2015-11-25 霍夫曼-拉罗奇有限公司 含两性离子缓冲液的组合物及其在电分析装置和方法中的用途
JP5824205B2 (ja) * 2010-10-27 2015-11-25 アークレイ株式会社 変異グルコース脱水素酵素
CN102559624B (zh) * 2012-03-05 2013-10-16 浙江德清汇宁生物科技有限公司 一种吡咯喹啉醌依赖型葡萄糖脱氢酶的热稳定性突变体及其高通量筛选方法
JP6694871B2 (ja) * 2014-08-12 2020-05-20 ファルマツェル、ゲーエムベーハー 3アルファ−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ変異体およびウルソデオキシコール酸調製のためのプロセス
EP3227439A4 (en) 2014-12-04 2018-06-27 Smartzyme Biopharma Ltd. Compositions and methods for measuring blood glucose levels
CN106349392A (zh) * 2015-07-14 2017-01-25 达尔生技股份有限公司 一种融合多肽
KR20180040595A (ko) 2015-07-23 2018-04-20 스마트자임 바이오파마 리미티드 혈당치를 측정하기 위한 조성물 및 방법
JP6856344B2 (ja) * 2015-10-29 2021-04-07 アークレイ株式会社 変異グルコース脱水素酵素およびその利用
EP3249050B1 (en) 2016-05-23 2019-01-23 ARKRAY, Inc. Enzyme electrode and biosensor using the same
JP7339723B2 (ja) * 2017-07-04 2023-09-06 アークレイ株式会社 変異型シトクロムタンパク質およびその利用
CN109425643B (zh) 2017-08-25 2022-10-25 爱科来株式会社 基于酶电化学阻抗测量法的新型生物传感技术
CN108486027A (zh) * 2018-04-04 2018-09-04 江南大学 一种fad为辅基的葡萄糖脱氢酶的生产、纯化方法
EP3578665B1 (en) 2018-05-22 2024-02-21 ARKRAY, Inc. Biosensing method
EP3640344B1 (en) 2018-10-03 2024-03-13 ARKRAY, Inc. Direct electron transfer-type oxidoreductase-modified molecular recognition element
EP4067483A1 (en) 2021-03-29 2022-10-05 The University of North Carolina at Chapel Hill Mutant glucose dehydrogenase having improved thermal stability, and use thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004089052A (ja) * 2002-08-30 2004-03-25 Koji Hayade グルコース脱水素酵素の製造方法
JP4639302B2 (ja) * 2004-04-23 2011-02-23 アークレイ株式会社 変異グルコース脱水素酵素

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10243786A (ja) * 1997-03-03 1998-09-14 Koji Hayade 改変型グルコース脱水素酵素
TWI224136B (en) * 1999-04-30 2004-11-21 Koji Sode Glucose dehydrogenase
JP2001197888A (ja) 2000-01-18 2001-07-24 Koji Hayade 基質特異性に優れたグルコース脱水素酵素
JP2000312588A (ja) * 1999-04-30 2000-11-14 Koji Hayade グルコース脱水素酵素
AU1596602A (en) 2000-10-27 2002-05-06 Peter Kratzsch Variants of soluble pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase
AU2002210991B2 (en) * 2000-10-31 2006-08-10 Koji Sode Novel glucose dehydrogenase and process for producing the dehydrogenase
JP4036667B2 (ja) 2002-03-25 2008-01-23 広司 早出 新規グルコース脱水素酵素及びそれをコードする遺伝子
AU2003235854A1 (en) 2002-04-26 2003-11-10 Koji Sode GLUCOSE DEHYDROGENASE Beta-SUBUNIT AND DNA ENCODING THE SAME
JP2004344145A (ja) 2002-05-27 2004-12-09 Toyobo Co Ltd 基質特異性または安定性に優れたピロロキノリンキノン(pqq)依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体
US7476525B2 (en) * 2002-05-27 2009-01-13 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Modified pyrroloquinoline quinone (PQQ) dependent glucose dehydrogenase with superior substrate specificity and stability
JP2004173538A (ja) 2002-11-25 2004-06-24 Amano Enzyme Inc ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素
JP4029346B2 (ja) 2003-03-24 2008-01-09 東洋紡績株式会社 基質特異性または安定性に優れたピロロキノリンキノン(pqq)依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体
JP4332794B2 (ja) 2003-03-24 2009-09-16 東洋紡績株式会社 基質特異性または安定性に優れたピロロキノリンキノン(pqq)依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体
EP1600503A1 (en) 2004-05-14 2005-11-30 Amano Enzyme Inc. Modified pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004089052A (ja) * 2002-08-30 2004-03-25 Koji Hayade グルコース脱水素酵素の製造方法
JP4639302B2 (ja) * 2004-04-23 2011-02-23 アークレイ株式会社 変異グルコース脱水素酵素

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6012000938; SODE,K. and KOJIMA, K.: Biotechnol. Lett. Vol.19, No.11, 1997, pp.1073-1077 *
JPN6012062870; KIESS, M. et al.: Eur. J. Biochem. Vol.252, 1998, pp.90-99 *

Also Published As

Publication number Publication date
US7776575B2 (en) 2010-08-17
TWI403584B (zh) 2013-08-01
US7604969B2 (en) 2009-10-20
ATE455848T1 (de) 2010-02-15
JPWO2006137283A1 (ja) 2009-01-15
TWI485249B (zh) 2015-05-21
US20080206833A1 (en) 2008-08-28
EP2077321B1 (en) 2011-08-17
EP2077321A3 (en) 2009-10-07
CN101107353B (zh) 2015-07-29
KR101399727B1 (ko) 2014-05-29
CN101107353A (zh) 2008-01-16
WO2006137283A1 (ja) 2006-12-28
EP1860183B1 (en) 2010-01-20
DE602006011858D1 (de) 2010-03-11
KR20080028834A (ko) 2008-04-01
TW200726842A (en) 2007-07-16
EP2077321A2 (en) 2009-07-08
KR101387240B1 (ko) 2014-04-21
ATE520771T1 (de) 2011-09-15
KR20130018336A (ko) 2013-02-20
EP1860183A4 (en) 2008-10-15
EP1860183A1 (en) 2007-11-28
TW201307562A (zh) 2013-02-16
US20100086989A1 (en) 2010-04-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5341312B2 (ja) 変異グルコース脱水素酵素
JP4639302B2 (ja) 変異グルコース脱水素酵素
JP5824205B2 (ja) 変異グルコース脱水素酵素
JP6079038B2 (ja) 新規なグルコース脱水素酵素
JP6084981B2 (ja) フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
JP2017079721A (ja) 変異グルコース脱水素酵素およびその利用
CN108350438B (zh) 新型葡萄糖脱氢酶
WO2004005499A1 (ja) グルコース脱水素酵素
WO2021125332A1 (ja) 新規グルコースデヒドロゲナーゼ
JP2005270082A (ja) グルコース脱水素酵素
JP2017221147A (ja) 新規グルコースデヒドロゲナーゼ
JP2014180223A (ja) アルドヘキソースデヒドロゲナーゼ及びその製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20090525

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20090525

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A132

Effective date: 20120117

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20120319

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20121204

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20130228

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20130307

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20130528

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20130701

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20130723

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20130808

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 5341312

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250