CN109425643B - 基于酶电化学阻抗测量法的新型生物传感技术 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基于酶电化学阻抗测量法的新型生物传感技术。本发明提供一种葡萄糖等物质的电化学定量方法，该方法不易受到底物扩散的影响，能够得到稳定的测定结果。一种物质的定量方法，其包括下述步骤：将包含测定对象物质的试样导入到生物传感器中的步骤，该生物传感器具备酶电极和对电极，该酶电极包含电极以及以能够与电极进行直接电子授受的状态配置在该电极上的氧化还原酶；对所述酶电极施加交流电压、进行阻抗测量的步骤；以及基于由所述阻抗测量得到的指标计算出物质浓度的步骤。

Description

基于酶电化学阻抗测量法的新型生物传感技术
技术领域
本发明涉及用于对葡萄糖等生物体物质进行定量的酶电化学传感技术。
背景技术
生物传感器中使用的酶电极具有将通过酶反应产生的电子从电极中取出的结构，通常包含电极和试剂层，该试剂层是使用交联剂或粘结剂将酶和导电性颗粒固定在电极表面而成的。以往，以通过利用电子传递介质的氧化还原反应产生的酶催化反应电流作为指标、对酶反应的底物的浓度进行测定的方法为主流，但最近开发出了使用“直接电子转移型的酶电极”的生物传感器，该“直接电子转移型的酶电极”在没有电子传递介质之类的氧化还原物质参与的情况下将由酶反应生成的电子直接传递至电极，由此进行酶与电极间的电子授受。例如，在专利文献1中公开了一种酶传感器，其包含具有检测层的酶电极，该检测层包含氧化还原酶、水溶性导电性聚合物以及导电性颗粒，在该检测层中通过直接电子转移而在上述酶与上述电极间进行电子授受。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2014/002999
非专利文献
非专利文献1：“Direct Electron Transfer Type Disposable Sensor Stripfor Glucose Sensing Employing an Engineered FAD Glucose Dehydrogenase”,YukiYamashita,Stefano Ferri,Mai Linh Huynh,Hitomi Shimizu,Hideaki Yamaoka,andKoji SODE,Enzyme and Microbial Technology,52(2),123-128(2013)(Epub 2012Nov16)
非专利文献2：“The Application of Engineered Glucose Dehydrogenase forDirect Electron Transfer Type Continuous Glucose Monitoring System andCompartment-less Biofuel Cell”Junko Okuda,Mieko Fukasawa,Noriko Kakehi,Tomohiko Yamazaki and Koji SODE,Anal.Lett.,40(3),431-440(2007)
非专利文献3：“Construction and Characterization of Direct ElectronTransfer-Type Continuous Glucose Monitoring System Employing ThermostableGlucose Dehydrogenase Complex”,Tomohiko Yamazaki,Junko Okuda-Shimazaki,Chikako Sakata,Taiki Tsuya,and Koji SODE,Analytical Letters,41(13),2363-2373(2008)
发明内容
在非专利文献1、2、3中提出了在固定有具有电子传递亚基或电子传递结构域的氧化还原酶的电极中，通过在直流电路中施加电位来测量电流值的直接电子转移型生物传感器的原理。另外，在专利文献1记载的方法中，使用了利用导电性聚合物将酶配置在电极附近而成的电极，但由于测定为安培测定，因而存在测定精度受到底物扩散的影响而不足的问题。
因此，本发明的课题在于提供一种葡萄糖等物质的电化学定量方法，该方法不易受到底物扩散的影响、能够得到稳定的测定结果。
本发明人为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现，在电极上固定有具有电子传递亚基的酶或经人工电子受体修饰的氧化还原酶的直接电子转移型生物传感器中，以高于电子传递亚基或人工电子受体的氧化还原电位的过电压(直流(DC)偏压)为中心一边改变频率一边施加正弦波时的阻抗值(电荷转移电阻)与样本中的物质浓度相关。即，发现在直接电子转移型酶传感器中，通过进行阻抗测量，能够进行目标物质的定量，从而完成了本发明。
即，本发明提供以下发明。
[1]一种物质的定量方法，其包括下述步骤：
将包含测定对象物质的试样导入到生物传感器中的步骤，该生物传感器具备酶电极和对电极，该酶电极包含电极以及以能够与电极进行直接电子授受的状态配置在该电极上的氧化还原酶；
对上述酶电极施加交流电压、进行阻抗测量的步骤；以及
基于由上述阻抗测量得到的指标计算出物质浓度的步骤。
[2]如[1]所述的方法，其中，上述阻抗测量通过以一定的直流偏置电压为中心对上述酶电极施加交流电压来进行。
[3]如[1]所述的方法，其中，上述交流电压以具有1种以上的频率的正弦波的形式施加。
[4]如[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，上述交流电压通过使频率在0.1mHz～100mHz的第一频率与10kHz～1MHz的第二频率之间变化来施加。
[5]如[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，由上述阻抗测量得到的指标为电荷转移电阻值(Rct)。
[6]如[5]所述的方法，其中，基于表示Rct的倒数与物质浓度的关系的计算式或校准曲线计算出物质浓度。
[7]如[1]～[6]中任一项所述的方法，其中，上述氧化还原酶为具有电子传递亚基或电子传递结构域的氧化还原酶。
[7]如[7]所述的方法，其中，上述电子传递亚基或电子传递结构域为细胞色素。
[9]如[1]～[6]中任一项所述的方法，其中，上述氧化还原酶为经人工电子受体修饰的氧化还原酶。
[10]如[1]～[9]中任一项所述的方法，其中，在上述酶电极中，氧化还原酶由形成单分子膜的分子固定在电极上。
[11]如[10]所述的方法，其中，形成单分子膜的分子为具有巯基或二巯基的分子或者具有芘的分子。
[12]如[1]～[11]中任一项所述的方法，其中，上述测定对象物质为葡萄糖，上述氧化还原酶为葡萄糖氧化还原酶。
[13]一种物质的定量装置，其由下述部分构成：
生物传感器，具备酶电极和对电极，该酶电极包含电极以及以能够与电极进行直接电子授受的状态配置在该电极上的氧化还原酶；
控制部，控制对上述生物传感器的交流电压施加；
测定部，测量通过上述交流电压施加而得到的阻抗；
运算部，由上述阻抗值计算出测定对象物质的浓度；以及
输出部，将上述计算出的测定对象物质的浓度输出。
本发明在电化学生物传感器中首次实现了基于阻抗测量的物质定量，在分析、诊断、医疗等领域中做出了很大贡献。由于电荷转移电阻值是与可见到物质传输限制的低频区区分开而求出的，因此，根据本发明，能够在不会受到测定对象物质的扩散系数、测定溶液的粘度、颗粒的存在等阻碍物质传输的因素的影响的情况下精度良好地对测定对象物质进行定量。
附图说明
图1是示意性示出本发明的一个实施方式中能够使用的酶电极的结构的图。
图2是示出制造本发明的一个实施方式中能够使用的生物传感器的一系列步骤的图。
图3是示出本发明的测定装置的一个方式的示意图。
图4是示出使用了本发明的测定装置的测定程序的一个方式的流程图。
图5示出实施例1中的基于频率响应分析结果的奈奎斯特(Nyquist)曲线图。
图6示出用于分析电极间的阻抗的等效电路的一例。
图7示出实施例1中的葡萄糖浓度与电荷转移电阻的关系。
图8示出实施例2中的基于频率响应分析结果的奈奎斯特曲线图。
具体实施方式
以下参照附图等对作为本发明的一个实施方式的物质的定量方法和物质的测定装置进行说明。以下举出的实施方式分别为示例，本发明并不限于以下的实施方式的构成。
本发明的物质的定量方法包括下述步骤：
将包含测定对象物质的试样导入到生物传感器中的步骤，该生物传感器具备酶电极和对电极，该酶电极包含电极以及以能够与电极进行直接电子授受的状态配置在该电极上的氧化还原酶；
对上述酶电极施加交流电压、进行阻抗测量的步骤；以及
基于由上述阻抗测量得到的指标计算出物质浓度的步骤。
利用本发明的方法，能够基于阻抗测量对试样中所含有的测定对象物质(葡萄糖等)的浓度进行测定。试样只要是包含测定对象物质的试样就没有特别限制，优选生物体试样，可以举出血液、尿等。
(生物传感器)
本发明的方法中使用的生物传感器具备酶电极(工作电极)和对电极，该酶电极包含电极以及以能够与电极进行直接电子授受的状态配置在该电极上的氧化还原酶。也可以为具备酶电极、对电极以及参比电极的三电极系统。作为对电极，只要是通常能够作为生物传感器的对电极使用的电极即可，例如可以使用通过丝网印刷进行成膜的碳电极、通过物理蒸镀(PVD，例如溅射)或化学蒸镀(CVD)进行成膜的金属电极、通过丝网印刷进行成膜的银/氯化银电极。另外，对于参比电极，也同样可以使用银/氯化银电极、碳电极或金属电极等。
(酶电极)
酶电极包含以能够与电极进行直接电子授受的状态配置在该电极上的氧化还原酶。
电极例如使用金(Au)、铂(Pt)、银(Ag)和钯(Pd)之类的金属材料或以石墨、碳纳米管、石墨烯、介孔碳等碳为代表的碳材料来形成。电极可以设置在由聚醚酰亚胺(PEI)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚乙烯(PE)之类的热塑性树脂、聚酰亚胺树脂、环氧树脂之类的各种树脂(塑料)、玻璃、陶瓷、纸等绝缘性材料形成的绝缘性基板上。
(氧化还原酶)
氧化还原酶只要是能够与电极之间进行直接电子授受的氧化还原酶、或者能够通过将人工电子受体或纳米材料修饰在酶上或用于电极材料而进行电子授受的氧化还原酶，就能够适用于本发明。
作为能够适用于本发明的氧化还原酶，例如可以举出葡萄糖氧化酶(GOD)、半乳糖氧化酶、胆红素氧化酶、丙酮酸氧化酶、D-或L-氨基酸氧化酶、胺氧化酶、胆固醇氧化酶、胆碱氧化酶、黄嘌呤氧化酶、肌氨酸氧化酶、L-乳酸氧化酶、抗坏血酸氧化酶、醇脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、胆固醇脱氢酶、醛脱氢酶、葡萄糖脱氢酶(GDH)、果糖脱氢酶、山梨糖醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、甘油脱氢酶、17B羟基类固醇脱氢酶、雌二醇17B脱氢酶、氨基酸脱氢酶、甘油醛3-磷酸脱氢酶、3-羟基类固醇脱氢酶、心肌黄酶、细胞色素氧化还原酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶等。其中优选为糖类的氧化还原酶，作为糖类的氧化还原酶的示例，例如可以举出葡萄糖氧化酶(GOD)、半乳糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶(GDH)、果糖脱氢酶、山梨糖醇脱氢酶。因此，本发明的生物传感器可以根据酶的种类作为葡萄糖传感器、胆固醇传感器、乙醇传感器、山梨糖醇传感器、果糖传感器、纤维素二糖传感器、乳酸传感器、尿酸传感器等来使用。
作为能够与电极之间进行直接电子授受的氧化还原酶，可以举出生理性地包含参与与电极的电子授受的氧化还原分子的氧化还原酶，例如可以使用包含电子传递亚基或电子传递结构域作为该氧化还原分子的氧化还原酶。作为电子传递亚基，可以举出具有血红素的亚基，作为包含具有血红素的亚基的氧化还原酶，可以举出包含细胞色素c或细胞色素b等细胞色素的氧化还原酶。
作为包含含有细胞色素的亚基作为电子传递亚基的酶，例如可以举出葡萄糖脱氢酶(GDH)、山梨糖醇脱氢酶(Sorbitol DH)、D-果糖脱氢酶(Fructose DH)、乳酸脱氢酶、尿酸氧化酶等。
例如，作为包含细胞色素的葡萄糖脱氢酶，可以举出具有含有FAD的α亚基的细胞色素葡萄糖脱氢酶(CyGDH)。作为CyGDH，可以举出洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderiacepacia)来源的FAD依赖性葡萄糖脱氢酶或其突变体。作为洋葱伯克霍尔德菌来源的FAD依赖性葡萄糖脱氢酶的突变体，可以举出472位和475位的氨基酸残基被置换的突变体(WO2005/103248)；326位、365位和472位的氨基酸残基被置换的突变体(日本特开2012-090563)；365位和326、472、475及529位等被置换的突变体(WO 2006/137283)等。
另外，作为包含电子传递结构域的酶，可以例示包含血红素结构域或细胞色素结构域的酶，具体地说，例如可以举出醌血红素乙醇脱氢酶(QHEDH(PQQ Ethanol dh)。此外，作为包含含有细胞色素的结构域作为电子传递结构域的酶，例如可以举出“QHGDH”(融合酶；带有QHGDH血红素结构域的GDH))、纤维素二糖脱氢酶。另外，还可以使用国际公开WO2005/030807号公报中公开的PQQ葡萄糖脱氢酶(PQQGDH)与细胞色素的融合蛋白。
另外有报告指出，在上述例示的氧化还原酶为自身无法与电极之间进行电子授受的酶的情况下、即不包含电子传递亚基或电子传递结构域的情况下，通过将氧化还原酶用人工电子受体或纳米材料进行修饰、或者将电极用人工电子受体或纳米材料进行修饰，能够进行氧化还原酶与电极的直接电子授受，从而可构建出能够进行直接电子授受的酶电极，这样的方式也可以适用于本发明的方法中。
此处，人工电子受体只要是从氧化还原酶接受电子而被还原、在电极处再次被氧化、且不具有催化作用的化合物即可，可以举出例如醌化合物(例如1,4-萘醌、VK3、9,10-菲醌、1,2-萘醌、2,5-二甲基对苯醌、甲基苯醌、2,6-二甲基苯醌、1,2-萘醌-4-磺酸钠、1,4-蒽醌、四甲基苯醌、百里醌)、苯二胺化合物(例如N,N-二甲基-1,4-苯二胺、N,N,N’,N’-四甲基-1,4-苯二胺二盐酸盐)、1-甲氧基-PMS(1-甲氧基-5-甲基吩嗪甲基硫酸盐)、PES(吩嗪乙基硫酸盐)、辅酶Q0、AZURE A氯化物、酚藏花红、6-氨基喹喔啉、四硫富瓦烯等。
为了用人工电子受体修饰氧化还原酶，可以举出使人工电子受体与酶化学结合的方法。例如可以例示在人工电子受体中导入琥珀酰亚胺等官能团并使其与酶的氨基反应而导入的方法。
另外，在纳米材料中，可以例示能够配置到可与酶的活性中心进行直接电子授受的距离的导电性材料，例如碳纳米管(Analytical Biochemistry,Volume 332,Issue 1,1September 2004,Pages 75-83)或金属纳米颗粒(Analytical BiochemistryVolume 331,Issue 1,1August 2004,Pages 89-97)等，但只要是可观测到直接电子传递的材料，则并不限定于此。
“直接电子转移型的酶电极”是指在试剂层中通过酶反应生成的电子不通过电子传递介质之类的氧化还原物质的扩散作用等而通过直接传递至电极来进行酶与电极间的电子授受的类型的酶电极。
为了制成直接电子转移型的酶电极，在电极的附近配置上述氧化还原酶是很重要的，在生理学反应体系中发生直接电子转移的临界距离据称为
Figure BDA0001775134420000071
因而为了无损于从酶向电极的电子转移，将酶配置在比该临界距离更靠近电极的距离是很重要的。作为用于此的方法没有特别限制，例如可以举出将氧化还原酶化学固定在电极上的方法、使用导电性聚合物或交联剂等将氧化还原酶间接固定在电极上的方法(例如上述专利文献1或日本特开2016-121989等)、藉由单分子膜形成分子将酶固定在电极上的方法等。
优选可以举出藉由以下记载的单分子膜形成分子将酶固定在电极上的方法。
(单分子膜形成分子)
单分子膜形成分子是结合在电极表面且能够结合酶分子的化合物，是通过以一定方向多个结合在电极表面而能够形成单分子膜的化合物。优选具有与电极具有亲和性的第一官能团、间隔物部位、以及可与酶分子所具有的官能团发生反应的第二官能团。更优选具有下述结构：在间隔物部位的第一端结合有与电极具有亲和性的第一官能团，在间隔物部位的第二端结合有可与酶分子所具有的官能团发生反应的第二官能团。
与电极具有亲和性的第一官能团根据电极的种类适当地选择。
单分子膜形成分子在电极表面的结合方式可以举出共价键、配位键、离子键等化学性结合或者基于范德华力等的物理性结合，优选共价键或配位键。作为能够与电极结合的第一官能团，在金属电极的情况下，可以举出巯基或二巯基。另一方面，在碳电极的情况下，可以举出芘、卟啉。
作为可与酶分子所具有的官能团发生反应的第二官能团，根据酶分子所具有的官能团的种类适当地选择。例如，在与酶分子所具有的氨基(包括末端氨基和侧链氨基)发生反应的情况下，可以举出琥珀酰亚胺基，这种情况下，单分子膜形成分子的第二端为琥珀酰亚胺基与氨基的反应残基。另一方面，在与酶分子所具有的羧基(包括末端羧基和侧链羧基)发生反应的情况下，可以举出噁唑啉基，这种情况下，单分子膜形成分子的第二端为噁唑啉基与羧基的反应残基。由此，通过酶与第二官能团的反应，能够利用共价键将酶固定于单分子膜形成分子。
关于间隔物的长度，为了使酶电极成为“直接电子转移型的酶电极”，优选为能够将酶分子与电极(集电体)表面的距离保持在一定距离以内的长度。如上所述，在生理学反应体系中发生直接电子转移的临界距离据称为
Figure BDA0001775134420000081
对于由电极和酶构成的电化学反应体系中的电子授受而言，在距离长于该临界距离的情况下，只要不伴有介质的转移(例如因扩散所致的转移)，也难以检测到电极上的电子授受。由此，优选能够将酶保持在距离电极
Figure BDA0001775134420000083
以内的长度，更优选能够将酶保持在距离电极
Figure BDA0001775134420000082
以内的长度。作为间隔物的种类，可以举出例如碳原子数为1～20(优选为1～10、更优选为1～5)的亚烷基、碳原子数为1～20(优选为1～10、更优选为1～5)的亚烯基、碳原子数为1～20(优选为1～10、更优选为1～5)的亚炔基、聚合度为2～50(优选为2～10、更优选为2～5)的聚乙二醇、氨基酸残基为1～20(优选为1～10、更优选为1～5)的寡肽等。需要说明的是，在上述亚烷基、亚烯基和亚炔基中，一部分-CH2-可以被置换成-S-，不连续的一部分-CH2-可以被置换成-O-。
例如，作为具有巯基或二巯基的单分子膜形成分子，可以例示具有以下结构的化合物。它们是形成单分子膜的化合物。
需要说明的是，L为间隔物、X为可与酶分子所具有的官能团发生反应的官能团。
SH-L-X···(1)
X-L-S-S-L-X···(2)
作为这样的化合物，可以例示以下的DSH等。
[化1]
Figure BDA0001775134420000091
二硫代双(琥珀酰亚胺己酸酯)：DSH
在这样的具有二硫醇的单分子膜形成分子的情况下，每1分子能够结合2分子的酶分子。
例如，作为具有芘或卟啉的单分子膜形成分子，可以例示具有下述结构的化合物。
需要说明的是，Py为芘、Po为卟啉、L为间隔物、X为可与酶分子所具有的官能团发生反应的官能团。
Py-L-X···(3)
Po-L-X···(3’)
例如，作为具有芘的单分子层形成分子，可以例示具有下述结构的化合物。
[化2]
Figure BDA0001775134420000092
1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯：PySE
J.Am.Chem.Soc.2001,123,3838-3839,Noncovalent SidewallFunctionalization of Single-Walled Carbon Nanotubes for Protein
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另外，作为具有芘的形成单分子膜的分子，可以例示以下的化合物。
所例示的PHT的末端为SH，例如可以利用N-(6-马来酰亚胺己酰氧基)琥珀酰亚胺等在SH基处加成琥珀酰亚胺基并与酶的氨基反应；或者使用导入有马来酰亚胺基的酶，藉由马来酰亚胺基将酶固定于PHT。
[化3]
Figure BDA0001775134420000101
17-(1-芘基)-13-氧代-十七烷硫醇：PHT
Chemical Physics Letters 367(2003)747-752,Self-assembly of goldnanoparticles to carbon nanotubes using a thiol-terminatedpyrene asinterlinker
(酶电极的制作方法)
酶电极A例如如下制作。即，如图1所示，在绝缘性基板4的单面上形成作为电极1发挥功能的金属层。例如，在规定厚度(例如100μm左右)的膜状的绝缘性基板4的单面上，通过物理蒸镀(PVD，例如溅射)或化学蒸镀(CVD)将金属材料成膜，由此形成具有所期望的厚度(例如30nm左右)的金属层。也可以形成由碳材料形成的电极层来代替金属层。
使酶结合在这样得到的电极层的表面。
例如，在使用单分子膜形成分子的情况下，首先在电极1上结合单分子膜形成分子2。之后，使单分子膜形成分子的反应性官能团与氧化还原酶3的氨基或羧基反应，从而能够藉由单分子膜形成分子将氧化还原酶3固定在电极1上。
需要说明的是，在利用导电性聚合物或交联剂将酶固定在电极上的情况下，可以通过在电极1上添加酶以及导电性聚合物或交联剂等试剂来制作酶电极。
＜生物传感器＞
以下，基于图2对可在本发明中使用的生物传感器的一例进行说明。但是，生物传感器并不限于以下的方式。
如(e)所示，该生物传感器B具备：基板11、由具有引线部12a的工作电极12和具有引线部13a的对电极13构成的电极系统、绝缘层14、包含氧化还原酶的试剂层12b、具有开口部的间隔物17、以及具有贯通孔19的盖体18。如(b)所示，在基板11上设有检测部15，在检测部15，与基板11的宽度方向平行地配置有工作电极12和对电极13。上述两电极的一端分别为引线部12a、13a，它们与检测部15的另一端以垂直的方式配置(a)。另外，工作电极12与对电极13之间为绝缘部。在具备这样的电极系统的基板11上，如(b)所示，除了引线部12a、13a和检测部15以外，层积有绝缘层14，在未层积绝缘层14的上述检测部15的工作电极12上层积有试剂层12b。并且，如(d)所示，在绝缘层14上配置有间隔物17，该间隔物17的与检测部15对应的位置成为开口部。进一步在间隔物17上配置有盖体18，该盖体18在与上述开口部对应的一部分具有贯通孔19(e)。在该生物传感器B中，作为上述开口部的空间部分且夹在上述试剂层12b和绝缘层14与盖体18间的空间部分形成毛细管结构的试样供给部16。并且，上述贯通孔19形成用于通过毛细管现象吸入试样的空气孔。
(物质的定量方法)
本发明的定量方法包括对上述酶电极施加交流电压进行阻抗测量的步骤、以及基于由上述阻抗测量得到的指标计算出物质浓度的步骤。
阻抗测量可以基于公知的方法进行，具体地说，例如优选以一定的DC偏置电压为中心以1种以上的频率、即改变频率对酶电极施加正弦波的方法。
作为DC偏压，优选为高于与电极进行直接电子授受的氧化还原分子(电子传递亚基、电子传递结构域或人工电子受体)的氧化还原电位的电压。上限没有特别限制，例如为+1000mV。
例如，在使用包含含有作为氧化还原分子的血红素(细胞色素)的电子传递亚基或电子传递结构域的氧化还原酶时，可以为+300mV或其以上。
另外，在使用PES作为氧化还原分子时，例如可以为+100mV或其以上。
具体地说，例如，首先在工作电极与对电极之间施加上述DC偏压的电压。接着，对工作电极施加在该DC偏压的电压上叠加交流电压而得到的电压。该施加的交流电压优选能够测定工作电极与对电极之间的阻抗且为尽可能低值的交流电压。施加至工作电极的交流电压的值若过大，则在电极的表面发生电化学反应，产生电极的表面状态发生变化等问题。另外，该交流电压的值若过低，则SN比降低，阻抗的测定不准确。因此，施加至工作电极与对电极之间的电压具体地说优选振幅为5～20mV。
之后，使用频率响应分析装置，改变所施加的交流电压的频率来测定工作电极与对电极之间的阻抗。该频率的可变范围为能够进行阻抗测定的范围即可，例如可以使频率在0.1mHz～100mHz的第一频率(下限)与10kHz～1MHz的第二频率(上限)之间变化，更具体地说，0.1mHz至100kHz的范围是适当的。但是，越是低频率的区域，阻抗的测定越需要时间、测定间隔越延长，因而频率的下限优选为1mHz左右、更优选为10mHz左右。
作为由阻抗测量得到的指标，可以举出电荷转移电阻值(Rct)。电荷转移电阻值(Rct)例如可以如下求出：基于利用频率响应分析装置得到的数据，绘出图5的奈奎斯特曲线图，将其与图6的等效电路进行拟合，由此能够求出电阻。
图6示出用于分析电极间的阻抗的等效电路。在图6中，Rsol为工作电极与对电极间的导电电阻、Q(CPE)为电极表面的电容量、Rct为酶电极反应的电阻。
接着，基于电荷转移电阻值(Rct)等的值，计算出物质浓度。电荷转移电阻值依赖于样本中的物质浓度，若物质浓度增加，则电阻降低。如图7所示，可以预先制作显示出电阻Rct的倒数与物质浓度的相关性的特性图，使用该特性图基于所求得的Rct求出物质浓度。
(装置)
接着，使用附图对本发明的测定装置进行说明。此处例示了葡萄糖测定装置的一个方式，但本发明的测定装置并不限于以下的方式。
图3示出容纳在测定装置C内的主要电子部件的构成例。控制计算机28、恒电位仪24、频率响应分析器29、电力供给装置21被设置在容纳于壳体内的基板30上。
控制计算机28在硬件上包含CPU(中央运算处理装置)之类的处理器、存储器(RAM(随机存取存储器，Random Access Memory)、ROM(只读存储器，Read Only Memory))之类的记录介质、以及通信单元，处理器将存储在记录介质(例如ROM)中的程序加载至RAM并执行，由此作为具备输出部20、控制部22、运算部23、测定部(恒电位仪24和频率响应分析器29)的装置发挥功能。需要说明的是，控制计算机28也可以包含半导体存储器(EEPROM，闪存)或硬盘之类的辅助存储装置。
控制部22对电压施加的时机、施加电压值等进行控制。
电力供给装置21具有电池26，向控制部计算机28、恒电位仪24、频率响应分析器29供给工作用的电力。需要说明的是，电力供给装置21也可以设置在壳体的外部。
恒电位仪24是使工作电极的电位相对于参比电极恒定的装置，由控制部22进行控制，使用端子CR、W在葡萄糖传感器27的对电极和工作电极之间施加规定的电压(DC偏压)。
频率响应分析器29改变施加至工作电极的交流电压的频率来测定工作电极与对电极之间的阻抗。即，其由正弦波振荡器以及测定响应信号的大小和相位的分析器构成，由振荡器对电池施加正弦波，将来自电池的响应信号再次返回，转换成数字数据，从而能够检测出测定频率的振幅和相位。
运算部23由检测出的阻抗计算出电荷转移电阻值，由电荷转移电阻值进行测定对象物质的浓度的运算并进行存储。输出部20与显示部单元25之间进行数据通信，将由运算部23得到的测定对象物质的浓度的运算结果发送到显示部单元25。显示部单元25例如可以将由测定装置C接收的葡萄糖浓度的运算结果以规定的格式显示在显示画面中。
图4是示出利用控制计算机28进行的葡萄糖浓度测定处理的示例的流程图。控制计算机28的CPU(控制部22)接收到葡萄糖浓度测定的开始指示时，控制部22控制恒电位仪24，对工作电极施加规定的DC偏置电压，在此基础上叠加交流电压，由此开始测定(步骤S01)。
之后，利用频率响应分析器29改变施加至工作电极的交流电压的频率，对工作电极与对电极之间的阻抗进行测定。之后，频率响应分析器29将阻抗的测定结果送到运算部24(步骤S02)。
运算部23基于阻抗进行运算处理，计算出葡萄糖浓度(步骤S03)。
运算装置23例如基于所输入的阻抗制作奈奎斯特曲线图，基于图6所示的等效电路对电荷转移电阻值进行分析。例如，控制计算机28的运算部23预先保持有与配置在等效电路或电极上的葡萄糖脱氢酶相对应的电荷转移电阻值的倒数与葡萄糖浓度的计算式或校准曲线数据，使用这些计算式或校准曲线计算出葡萄糖浓度。
输出部20将葡萄糖浓度的计算结果通过其与显示部单元25之间形成的通信链路发送到显示部单元25(步骤S04)。之后，控制部22对有无测定错误进行检测(步骤S05)，若没有错误则结束测定，将葡萄糖浓度显示在显示部。若有错误，则在进行错误显示后，结束基于图4的流程的处理。另外，也可以将计算结果保存在运算部23，之后调出计算结果，显示于显示部并进行确认。需要说明的是，此处，在将计算结果发送到显示部单元25(步骤S04)之后，利用控制部22进行了测定错误检测(步骤S05)，但也可以更换这些步骤的顺序。
[实施例]
以下对阻抗测量的实施例进行说明。但是，本发明并不限于下述实施例的方式。
实施例1
(酶电极的制作)
制作出藉由单分子膜形成分子将包含细胞色素C亚基的GDH固定在金表面而成的酶电极。作为单分子膜形成分子，使用以下的DSH。
[化4]
Figure BDA0001775134420000141
二硫代双(琥珀酰亚胺己酸酯)：DSH
具体地说，将金线(直径0.5mm、长度6～7cm)于室温下在食人鱼洗液中浸渍一晚，之后用丙酮清洗，浸渍在DSH的丙酮溶液(浓度20μM)中，于25℃温育24小时，使DSH的巯基结合于金表面。接着用丙酮清洗，浸渍在包含酶(洋葱伯克霍尔德菌来源的FADGDH(γα(QYY)β；日本特开2012-090563)(浓度0.03mg/ml))的PPB(pH7.0)中，在4℃温育一晩，藉由DSH的官能团使酶结合，得到酶电极。
(阻抗测量)
将上述的酶电极作为工作电极，利用使用了对电极(Pt线)和参比电极(银/氯化银)的三电极系统进行阻抗测量。测定在25℃进行。
在上述酶电极中导入0(背景)、25mg/dL、300mg/dL或600mg/dL的葡萄糖溶液作为试样，在使向工作电极施加的电压为+300mV、+100mV、-100mV或-300mV(vs.银/氯化银)的状态下，改变频率(100kHz～50mHz)向工作电极施加正弦波(振幅10mV)，进行阻抗测量。
(测定结果的分析和评价)
将向工作电极施加的电压为+300mV时的测定结果绘制在奈奎斯特曲线图中(图5)。利用图6的等效电路对其进行拟合，由此求出各葡萄糖浓度下的电荷转移电阻(Rct)。同样地，对于向工作电极施加的电压为+100mV和-100mV时，也求出各葡萄糖浓度下的电荷转移电阻(Rct)。
将各个施加电压下的葡萄糖浓度与1/Rct的关系示于图7。
其结果，在+300mV和+100mV时，1/Rct与葡萄糖浓度显示出相关性。其中，在+100mV时斜率小，在-100mV时未观察到浓度依赖性。因此可知，在施加了足以将电子传递亚基的血红素氧化的偏置电压时，1/Rct与葡萄糖浓度显示出充分的相关性。
实施例2
(酶电极的制作)
制作出藉由单分子形成分子将结合有吩嗪乙基硫酸盐(PES)的GDH固定在碳表面而成的酶电极。作为单分子形成分子，使用NTA-SAM形成试剂(同仁化学)。
具体地说，将金线(直径0.5mm、长度6～7cm)于室温下在食人鱼洗液中浸渍一晩，之后用丙酮清洗，浸渍在NTA-SAM的乙醇溶液(浓度0.2mM)中，于25℃温育24小时，使NTA-SAM结合在金表面。接着，在室温下于40mM的NiSO4水溶液中浸渍1小时，在NTA上螯合Ni离子。清洗后，在修饰有NTA-SAM的金电极上滴加附加有His标签的霉菌来源的葡萄糖脱氢酶(BfuGDH)(浓度2.4mg/ml)2μL，于25℃干燥2小时后，添加具有NHS基的PES(5mM)0.5μL，藉由GDH的氨基使PES结合，由此得到藉由单分子膜形成分子(SAM)将用人工电子受体修饰的GDH固定在电极上而成的酶电极。
(阻抗测量)
将上述的酶电极作为工作电极，利用使用对电极(碳)和参比电极(银/氯化银)的三电极系统进行阻抗测量。测定在25℃进行。
在上述酶电极中导入0(背景)、25mg/dL、300mg/dL或600mg/dL的葡萄糖溶液作为试样，在使向工作电极施加的电压为+100mV(vs.银/氯化银)的状态下，改变频率(100kHz～50mHz)向工作电极施加正弦波(振幅10mV)，进行阻抗测量。
(测定结果的分析和评价)
将向工作电极施加的电压为+100mV时的测定结果绘制在奈奎斯特曲线图中(图8)。其结果，电荷转移电阻观察到了葡萄糖浓度依赖性。需要说明的是，在未用PES修饰的情况下，未观察到浓度依赖性。
符号的说明
A···酶电极
1···电极
2···单分子膜形成分子
3···氧化还原酶
4···绝缘性基板
B···生物传感器
11···基板
12···工作电极
12a···引线部
12b···试剂层
13···对电极
13a···引线部
14···绝缘层
15···检测部
16···开口部
17···间隔物
18···盖体
19···空气孔
C···测定装置
20···输出部
21···电力供给装置
22···控制部
23···运算部
24···恒电位仪
25···显示部单元
26···电池
27···葡萄糖传感器
28···控制计算机
29···频率响应分析器
30···基板
CR、W···端子

Claims (8)

1.一种物质的定量方法，其是包括下述步骤的物质的定量方法：
将包含测定对象物质的试样导入到生物传感器中的步骤，该生物传感器具备直接电子转移型的酶电极和对电极，所述酶电极包含电极以及以能够与电极进行直接电子授受的状态配置在该电极上的氧化还原酶；
以一定的直流偏置电压为中心对所述直接电子转移型的酶电极施加交流电压、进行阻抗测量的步骤；以及
基于测量出的阻抗绘出奈奎斯特曲线图，与等效电路进行拟合，求出电荷转移电阻值Rct，基于所述电荷转移电阻值计算出物质浓度的步骤，
所述物质的定量方法中，
所述氧化还原酶为具有包含细胞色素的电子传递亚基或包含细胞色素的电子传递结构域的氧化还原酶，或者为用人工电子受体修饰的氧化还原酶，
所述直流偏置电压为高于电子传递亚基、电子传递结构域或人工电子受体的氧化还原电位的电压。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述交流电压以具有1种以上的频率的正弦波的形式施加。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述交流电压通过使频率在0.1mHz～100mHz的第一频率与10kHz～1MHz的第二频率之间变化来施加。
4.如权利要求1所述的方法，其中，基于表示Rct的倒数与物质浓度的关系的计算式或校准曲线计算出物质浓度。
5.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，在所述酶电极中，氧化还原酶由形成单分子膜的分子固定在电极上。
6.如权利要求5所述的方法，其中，形成单分子膜的分子为具有巯基或二巯基的分子或者具有芘的分子。
7.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述物质为葡萄糖，所述氧化还原酶为葡萄糖氧化还原酶。
8.一种物质的定量装置，其是由下述部分构成的物质的定量装置：
生物传感器，具备酶电极和对电极，所述酶电极包含电极以及以能够与电极进行直接电子授受的状态配置在该电极上的氧化还原酶；
控制部，控制与直流偏置电压叠加地施加于所述生物传感器的交流电压；
测定部，测量通过交流电压施加而得到的阻抗；
运算部，基于测量出的阻抗值绘出奈奎斯特曲线图，与等效电路进行拟合，求出电荷转移电阻值Rct，基于所述电荷转移电阻值计算出测定对象物质的浓度；以及
输出部，将所述计算出的测定对象物质的浓度输出，
所述物质的定量装置中，
所述氧化还原酶为具有包含细胞色素的电子传递亚基或包含细胞色素的电子传递结构域的氧化还原酶，或者为用人工电子受体修饰的氧化还原酶，
所述直流偏置电压为高于电子传递亚基、电子传递结构域或人工电子受体的氧化还原电位的电压。
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