JP4566064B2 - 竹型カーボンナノチューブを用いたバイオセンサ - Google Patents
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Description
本発明は、カーボンナノチューブを用いたバイオセンサに関する。更に詳しくは、触媒活性が高く、測定妨害物質に対する選択性にすぐれたバイオセンサなどとして好適に用いられるカーボンナノチューブを用いたバイオセンサに関する。
電気化学的検出手段によるバイオセンサを使用して血液や尿等の液体生体試料を測定するに際して、試料中に共存するアスコルビン酸、尿酸、アセトアミノフェン等の還元性の妨害物質が電気化学的あるいは化学的に与える妨害作用が常に問題となっている。かかる問題に対する回避策としては、(1)妨害物質透過制限膜法、(2)電解酸化法、(3)差分測定法などが挙げられる。
妨害物質透過制限膜法(1)は、例えば過酸化水素のような低分子量の検出目的物質のみを透過し、妨害物質の透過を制限するためのフッ素系のイオン交換性高分子膜やセルロース誘導体の高分子膜などで電極表面を被覆する方法である。しかしながら、この方法においては、妨害物質透過制限膜の膜厚等を電極上に再現性良く作製するために熟練した技術が必要とされるだけでなく、制限膜の検出電極上への被覆による検出感度の低下が避けられないといった問題がある。
特開平９−３０４３３０号公報
特開平１０−２６６０１号公報
特開昭５７−２１１５４２号公報
特開昭５８−５６４３号公報
また、電解酸化法(2)は、目的物質を測定するための電極(検出電極)の他に、試料中に共存する妨害物質を酸化するための電極(電解電極)を使用し、試料が供給されると、妨害物質が酵素などの生理活性物質の反応系や検出電極に達する前にそれを電解電極により酸化する方法である。しかしながら、この方法においては、検出電極の他に電解電極を備える必要があり、センサ全体の構造が複雑かつ大きくなってしまう。さらに、妨害物質の濃度が高い場合には、電解電極で全て酸化される前に生理活性物質の反応系や検出電極に達してしまうため検出結果に影響を与え、その結果測定誤差が生じるという問題がある。
特開昭５７−１１８１５２号公報
特開昭５８−５６４２号公報
特開昭５８−１４６８４７号公報
さらに、差分測定法(3)は、目的物質と特異的に反応する酵素などの生理活性物質の反応系で得られた電流値および妨害物質の酸化反応で得られた電流値の両者の和と、妨害物質の酸化反応でのみ得られた電流値とをそれぞれ測定し、前者の電流値から後者の電流値を差し引くことで、目的物質に関連する電流値のみを算出する方法である。しかしながら、この方法においては、同一電極あるいは異なる電極上に、生理活性物質を固定化あるいは塗布した部位と固定化あるいは塗布していない部位を形成させる必要がある。また、生理活性物質の有無により妨害物質の酸化反応に基づく電流値は異なるため、両者の測定感度を等しくすることは非常に困難であり、精度の高い測定は期待できない。電極から離れた位置に生理活性物質を配置させることで改善を試みた例もあるが、生理活性物質を電極から離してしまうことで、検出速度が低下するという新たな問題が生じる。
特開平４−３４０４５３号公報
特開平５−１６４７２４号公報
特開平５−１９６５９６号公報
上述のように、バイオセンサを設計する上で、還元性の妨害物質の影響を除去する対策を講じることは極めて重要な課題である。一方、近年の新たな対策法として、バイオセンサを構築する際の検出電極へのカーボンナノチューブ(CNT)の利用が注目されている。
Journal of American Chemical Society, 125 2408-2409 (2003) Nano Letters, 4 191-195 (2004) Analytical Biochemistry, 331 89-97 (2004) Analytical Chemistry, 75 2076-2079 (2003) Electrochemistry Communications 5 689-694 (2003)
Journal of American Chemical Society, 125 2408-2409 (2003) Nano Letters, 4 191-195 (2004) Analytical Biochemistry, 331 89-97 (2004) Analytical Chemistry, 75 2076-2079 (2003) Electrochemistry Communications 5 689-694 (2003)
カーボンナノチューブ(CNT)は、1991年に発見された新しいナノ材料であり、機械的強度、熱伝導性、柔軟性、熱安定性、化学的安定性などに優れており、比表面積およびアスペクト比が大きく、単層のものや多層のものなど多様な構造を有し、その構造によって様々な電気的特性を示すなどのユニークな特徴を有していることが知られている。このことから、エレクトロニクスからエネルギーまでの広範な分野への応用が期待されており、CNTのバイオセンサの検出電極への応用もその中の一つであるといえる。
現在までのところ、CNTをバイオセンサの検出電極として利用することで、還元性の妨害物質の影響を受けない低い電位での目的物質の検出が可能であるという報告が多くなされてはいるものの、使用されているCNTは単層と多層の違いあるいはCNTへの官能基の導入の有無の差はあっても、全て完全中空型(hollow-type)CNTだけであり、他の構造的特徴を有するCNTについては報告されていない。
本発明の目的は、試料中に含まれる特定物質を還元性の妨害物質を始めとする電気化学活性物質の影響を受けることなく検出し得るとともに、構成の簡素化されたバイオセンサを提供することにある。
かかる本発明の目的は、検出電極材料として、竹型(bamboo-shaped)カーボンナノチューブが用いられたバイオセンサによって達成される。このようなバイオセンサは、竹型カーボンナノチューブを、ミネラルオイル、イオン性液体または高分子バインダー樹脂と混合してペースト状としたものを筒状容器に充填するなどして検出電極を形成することにより作製される。
竹型CNTをバイオセンサの検出電極材料として用いることにより、試料中に含まれる特定物質を還元性の妨害物質を始めとする電気化学活性物質の影響を受けることなく検出し得るバイオセンサを、極めて簡便に構築することが可能となる。このようなバイオセンサは、医療診断用あるいは健康診断用バイオセンサ、特に糖尿病の指標となる血糖値および糖化タンパク質を測定するためのバイオセンサに効果的に用いることができる。
竹型CNTの形状は特に限定されないが、直径が0.1〜1000nm、好ましくは10〜50nm、長さが1〜1000μm、好ましくは1〜50μm、層数が1〜100層、好ましくは5〜20層のグラフェンシートが重なっているものが好ましい。
竹型CNTの状態は特に限定されないが、粉末状の竹型CNTを用いる場合であれば、電極に成型するためにミネラルオイル、イオン性液体あるいはテトラフルオロエチレン、ナフィオンなどの高分子のバインダー樹脂と適宜混合させてペースト状とするか、水やアルコールなどの溶媒中に酸処理あるいは超音波処理などにより適宜分散させて使用することが好ましい。
竹型CNTを用いた検出電極の作製法は特に限定されないが、例えば上記ペーストをプラスチックなどの非導電性物質あるいは導電性の金属などの筒状の容器に詰める方法、シリコンやPETなどの絶縁性基板上に必要な大きさおよび形状にペーストあるいは分散溶液を配置させる方法、カーボン、白金、金などの市販の電極表面にペーストあるいは分散溶液を配置させる方法またはペーストを用いてPETなどの絶縁性基板上にスクリーン印刷により必要な大きさおよび形状の電極を形成させる方法などが用いられる。
検出電極中に含まれる竹型CNTの量は特に限定されないが、電極として使用するために必要な導電性が確保され、かつCNTの効果が発揮される含有量とするのが好ましく、例えばH2O2を検出する場合にあっては、電極材料中0.1〜100%程度用いられる。
測定に際しては、電極間電圧を特定の電圧に設定することにより、測定妨害物質の影響を避け、目的物質を選択的に測定することができる。例えば、血液中、尿中の糖(グルコース)を測定する場合には、電極に電圧をかけて測定するが、電圧により過酸化水素だけでなく、アスコルビン酸、尿酸、アセトアミノフェンなども電極反応してしまうが、カーボンナノチューブを配合した電極は電圧を選択することにより(ここでは特定電圧という)、過酸化水素にのみ電極反応し、これらの夾雑物質にそれほど電極反応しない状態を設定でき、選択性にすぐれた(バイオ)センサを形成できる。このような特定電圧は、測定物質によって異なるが、一般には銀／塩化銀電極を基準とした場合に約-0.5〜+0.1V程度である。
また、測定物質によっては、それに対応した酵素類が用いられる。具体例を以下に示す。
グルコースを検出する場合にあっては、例えばグルコースオキシダーゼを作用させることにより生成した過酸化水素を電極上で還元あるいは酸化することにより、グルコース濃度を定量することができる。
糖化ヘモグロビンや糖化アルブミンなどの糖化タンパク質を検出する場合にあっては、例えばプロテアーゼにより糖化タンパク質より糖化ペプチドを遊離させた後、さらに糖化ペプチドオキシダーゼを作用させることにより生成した過酸化水素を電極上で還元あるいは酸化することにより、糖化タンパク質濃度を定量することができる。
乳酸を検出する場合にあっては、例えば乳酸オキシダーゼを作用させることにより生成した過酸化水素を電極上で還元あるいは酸化することにより、乳酸濃度を定量することができる。
尿酸を検出する場合にあっては、例えばウリカーゼを作用させることにより生成した過酸化水素を電極上で還元あるいは酸化することにより、尿酸濃度を定量することができる。
尿素を検出する場合にあっては、例えばウレアーゼを作用させることにより生じたアンモニアに、β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)およびフェリシアン化カリウム存在下でさらにグルタミン酸脱水素酵素を作用させることにより生成したフェロシアン化カリウムを電極上で酸化することにより、尿素濃度を定量することができる。
クレアチニンを検出する場合にあっては、例えばクレアチニナーゼ、クレアチナーゼおよびザルコシンオキシダーゼを順次作用させることにより生成した過酸化水素を電極上で還元あるいは酸化することにより、クレアチニン濃度を定量することができる。
胆汁酸を検出する場合にあっては、例えば胆汁酸硫酸スルファターゼ、β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを還元型NADHおよびフェリシアン化カリウム存在下で順次作用させることにより生成したフェロシアン化カリウムを電極上で酸化することにより、胆汁酸濃度を定量することができる。
グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼを検出する場合にあっては、例えばアスパラギン酸存在下で生成したグルタミン酸にさらにグルタミン酸オキシダーゼを作用させることにより生成した過酸化水素を電極上で還元あるいは酸化することにより、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ濃度を定量することができる。
グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼを検出する場合にあっては、例えばアラニン存在下で生成したグルタミン酸に、さらにグルタミン酸オキシダーゼを作用させることにより生成した過酸化水素を電極上で還元あるいは酸化することにより、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ濃度を定量することができる。
コレステロールを検出する場合にあっては、例えばコレステロールオキシダーゼを作用させることにより生成した過酸化水素を電極上で還元あるいは酸化することにより、コレステロール濃度を定量することができる。
中性脂肪を検出する場合にあっては、例えばグリセロフォスフェートオキシダーゼを作用させることにより生成した過酸化水素を電極上で還元あるいは酸化することにより、中性脂肪濃度を定量することができる。
脂肪酸を検出する場合にあっては、例えばアシルCoAオキシダーゼを作用させることにより生成した過酸化水素を電極上で還元あるいは酸化することにより、脂肪酸濃度を定量することができる。
アンモニアを検出する場合にあっては、NADHおよびフェリシアン化カリウム存在下でグルタミン酸脱水素酵素を作用させることにより生成したフェロシアン化カリウムを電極上で酸化することにより、アンモニア濃度を定量することができる。
尿素窒素を検出する場合にあっては、例えばウレアーゼを作用させることにより生じたアンモニアにNADHおよびフェリシアン化カリウム存在下でさらにグルタミン酸脱水素酵素を作用させることにより生成したフェロシアン化カリウムを電極上で酸化することにより、尿素窒素濃度を定量することができる。
ビリルビンを検出する場合にあっては、例えばフェリシアン化カリウム存在下でビリルビンオキシダーゼを作用させることにより生成したフェロシアン化カリウムを電極上で酸化することにより、尿素窒素濃度を定量することができる。
以上の酵素類は、竹型CNT電極中に混合されるか、検出電極上に固定化される。酵素類の検出電極上への固定化方法は特に限定されないが、例えば酵素類を溶解させた水溶液や緩衝液中に検出電極を浸漬あるいは電極上に酵素類を溶解させた水溶液や緩衝液を滴下することにより酵素などを物理的あるいは化学的に固定化する方法、酸処理などにより竹型CNTに例えばカルボキシル基やアミノ基などの官能基を導入した後に酵素などを反応させて固定化する方法、グルタルアルデヒドのような架橋試薬あるいはさらに牛血清アルブミンを用いて酵素などを検出電極上に固定化する方法、親水性高分子などのゲル膜を検出電極上に形成させた後に膜中に酵素などを固定化する方法またはポリチオフェンなどの導電性高分子膜を検出電極上に形成させた後に膜中に酵素などを固定化する方法などが挙げられる。
目的物質の検出においては必要に応じて、例えば反応が溶存酵素濃度に律速され、高濃度の試料しか測定できない場合、検出範囲の拡大を目的としてメディエーター分子を利用することが有効である。メディエーター分子を利用する場合においては、検出電極上に形成させた酵素類の生理活性物質の固定化膜中あるいはこれとは分けて、メディエーター分子を検出電極上に配置することが好ましい。メディエーター分子の種類は特に限定されないが、例えばフェリシアン化カリウム、フェロシアン化カリウム、フェロセンおよびその誘導体、ビオローゲン類およびメチレンブルーなどの少くとも一種が用いられる。
液体試料としては、疾病や健康状態を示す特定物質を含んでいれば特に限定されず、例えば血液、尿、唾液、汗、涙などが挙げられる。また検出に用いる液体試料の濃度は特に限定されず、採取したものをそのまま測定に用いても必要に応じて水や緩衝溶液などで希釈して測定に用いても良い。
本発明のセンサを用いた測定法としては、酸化電流もしくは還元電流を測定するポテンシャルステップクロノアンペロメトリーまたはクーロメトリー、サイクリックボルタンメトリー法などが用いられる。測定方式としては、デスポーザブル(使い捨て)方式が望ましいが、他にFIA(Flow Injection Analysis)方式やバッチ方式でもよい。
次に実施例について本発明を説明する。
実施例
竹型CNT(NanoLab社製品 直径20〜40nm、長さ1〜5μm、10層)60mg、グルコースオキシダーゼ(天野エンザイム製品)10mgおよびミネラルオイル(Aldrich社製品)30mgを乳鉢中で15分間混錬した後、カーボンペースト電極(BAS社製品、直径3mm)中に詰め込んだものを検出電極として使用した。対極に白金線(BAS社製品)、参照極に銀／塩化銀電極(BAS社製品)を用いた。グルコースを0mM、1mM、5mM、10mMの濃度となるように溶解させた50mMのリン酸緩衝液(pH 7.4)を測定サンプルとして用いた。各測定サンプル中に検出電極、対極および参照極を浸した状態で-0.2Vを作用電極に対して印加して、90秒後に得られた電流値をグルコース濃度に対してプロットし検量線を作成した。
竹型CNT(NanoLab社製品 直径20〜40nm、長さ1〜5μm、10層)60mg、グルコースオキシダーゼ(天野エンザイム製品)10mgおよびミネラルオイル(Aldrich社製品)30mgを乳鉢中で15分間混錬した後、カーボンペースト電極(BAS社製品、直径3mm)中に詰め込んだものを検出電極として使用した。対極に白金線(BAS社製品)、参照極に銀／塩化銀電極(BAS社製品)を用いた。グルコースを0mM、1mM、5mM、10mMの濃度となるように溶解させた50mMのリン酸緩衝液(pH 7.4)を測定サンプルとして用いた。各測定サンプル中に検出電極、対極および参照極を浸した状態で-0.2Vを作用電極に対して印加して、90秒後に得られた電流値をグルコース濃度に対してプロットし検量線を作成した。
比較例
実施例において、竹型CNTの代わりに同量の完全中空型CNT(NanoLab社製品 直径15〜45nm、長さ1〜5μm、10層)が用いられた。
実施例において、竹型CNTの代わりに同量の完全中空型CNT(NanoLab社製品 直径15〜45nm、長さ1〜5μm、10層)が用いられた。
実施例および比較例で得られた結果は、図１に示される。実施例(―●―)では、アスコルビン酸、尿酸、アセトアミノフェンの酸化反応が起こる電位より低い電位で、相関係数が0.992の直線性の高い検量線を作成できることが示された。一方、比較例(―○―)では竹型CNTを使用した検出電極で得られた検量線の傾きの1/30程度の電流値しか得られず、バイオセンサを構築するための検出電極の材料として竹型CNTを使用することが極めて有効であることが示された。
Claims (17)
- 竹型(bamboo-shaped)カーボンナノチューブを用いて形成される検出電極を具備するバイオセンサ。
- 検出電極が、ミネラルオイル、イオン性液体または高分子バインダー樹脂と混合されたペースト状竹型カーボンナノチューブで形成される請求項１記載のバイオセンサ。
- 検出電極が、筒状容器に充填されたペースト状竹型カーボンナノチューブで形成される請求項２記載のバイオセンサ。
- 検出電極が、水またはアルコールに分散された竹型カーボンナノチューブで形成される請求項１記載のバイオセンサ。
- 検出電極が、絶縁性基板上に配置された、ペースト状竹型カーボンナノチューブで形成される請求項２記載のバイオセンサ。
- 検出電極が、絶縁性基板上に配置された、水あるいはアルコールに分散された竹型カーボンナノチューブで形成される請求項４記載のバイオセンサ。
- 検出電極が、カーボン電極、白金電極または金電極上に配置された、ペースト状竹型カーボンナノチューブで形成される請求項２記載のバイオセンサ。
- 検出電極が、カーボン電極、白金電極または金電極上に配置された、水またはアルコールに分散された竹型カーボンナノチューブで形成される請求項４記載のバイオセンサ。
- 検出電極が、ペースト状竹型カーボンナノチューブを用いて、絶縁性基板上にスクリーン印刷法により形成される請求項２記載のバイオセンサ。
- 検出電極が、酵素類が混合された検出電極である請求項２〜９のいずれかに記載のバイオセンサ。
- 検出電極が、さらにメディエーター分子が混合された検出電極である請求項１０記載のバイオセンサ。
- 検出電極が、酵素類が固定化された検出電極である請求項５〜９のいずれかに記載のバイオセンサ。
- 検出電極が、さらにメディエーター分子が固定化された検出電極である請求項１２記載のバイオセンサ。
- 検出電極が、さらにメディエーター分子が分子層を形成している検出電極である請求項１２記載のバイオセンサ。
- 電極間電圧を特定電圧に設定することにより、測定妨害物質の影響を避け、目的物質を選択的に測定できる請求項１〜１４のいずれかに記載のバイオセンサ。
- 特定電圧が、銀／塩化銀電極を基準とした場合に-0.5〜+0.1Vである請求項１５記載のバイオセンサ。
- 請求項１〜１６のいずれかに記載のバイオセンサを用いる、液体試料中の測定物質の検出または定量方法。
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