CN106349392A - 一种融合多肽 - Google Patents
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Abstract
一种融合多肽具有催化葡萄糖氧化还原能力，其中该融合多肽包含一氨基酸序列，该氨基酸序列中包含γ‑亚单元，具有SEQ ID No.1、α‑亚单元，具有SEQ ID No.2、β‑亚单元，具有SEQ ID No.3以及两个由5‑15个氨基酸所组成的键结片段，分别连接γ‑亚单元、α‑亚单元以及β‑亚单元，或1至5个氨基酸残基被取代、删除、附加、插入或/和加成的该氨基酸序列。三个亚单元藉由键结片段，融合形成单一蛋白质，可增加酶对葡萄糖的专一性，且在不同温度下仍具有高度稳定性，单一蛋白质的纯化工艺更为简易，使得酶可快速大量制备，可作为血糖浓度测量仪主要检测组件。
Description
技术领域
本发明涉及一种融合多肽。尤其是一种葡萄糖脱氢酶融合多肽。
背景技术
葡萄糖脱氢酶〈glucose dehydrogenase,GDH〉为一常见生物酶，其可应用于血糖检测器，当作主要检测组件之一，因为葡萄糖与NAD经GDH反应生成NADH，藉由测量NADH可以回推换算得到血糖浓度。通常血糖检测器中的葡萄糖脱氢酶来自真菌及细菌。
就酶的蛋白质基本结构来说，大多数酶是藉由共价键结的方式连接两个单体而以双体表达其蛋白质的特性。在葡萄糖脱氢酶对血糖的催化反应，过程中需联用不同辅酶当作电子转移的媒介，辅酶包含吡咯喹啉醌葡萄糖脱氢酶〈PQQ-GDH〉、黄素腺嘌呤二核苷酸葡萄糖脱氢酶〈FAD-GDH〉及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸葡萄糖脱氢酶〈NAD-GDH〉。血糖透过联用辅酶以及葡萄糖脱氢酶催化脱氢，但是此机制还需要NAD+的参与，反应才能进行。如果使用quinoprotein glucose dehydrogenase〈quinoprotein GDH〉，则不需要氧气也不需要NAD+的参与即可测量血糖浓度。Quinoprotein GDH是一类特别的酶，它在邻醌类〈orthoquinone〉的参与下，可以广泛地氧化多种醇类与胺类。对quinoprotein GDH而言，可使用pyrroloquinoline quinine〈PQQ〉参与血糖催化反应。反应式为:葡萄糖+PQQ(氧化)－quinoprotein–GDH→葡萄糖酸内脂〈gluconolactone〉+PQQ(还原)。
从催化反应机制来看，催化位置在C1的羟基。催化反应主要可分为两种机制：一是加成離去反应，而另一种反应为氢转移〈hydrogen transfer〉，不过两种反应机制皆需藉葡萄糖脱氢酶本身所拥有的辅酶或外加的辅酶负责电子转移。已知可用来测量血糖浓度的酶各有其优劣，例如，葡萄糖氧化酶〈glucose oxidase,GOD〉对葡萄糖特异性高，不受其他糖类物质干扰，但是葡萄糖氧化酶易受氧气干扰。利用葡萄糖脱氢酶为检测组件的血糖仪无需氧的参与，不受氧气干扰。细菌的PQQ-GDH不能区分麦芽糖、半乳糖等糖类物质与葡萄糖，但是PQQ-GDH的活性相对较高。真菌的FAD-GDH不能区分木糖与葡萄糖，且活性较低。而细菌的FAD-GDH不能区分麦芽糖与葡萄糖但活性较高，且细菌的FAD-GDH可直接放出电子，不需经过电子传导媒介。目前市售葡萄糖催化酶是以葡萄糖氧化酶、PQQ-GDH和真菌的FAD-GDH为主，因此会有对葡萄糖专一性不足或易受其他物质干扰测量结果的问题。
利用葡萄糖脱氢酶为检测组件的血糖仪可不受氧气干扰，但是脱氢酶包含至少三个单体，公知的脱氢酶合成方法先将单体各自由载体表达，再利用各单体间的范德华力(Van der waals force)相互吸引，然而单体在不同载体中的表达难以控制，且单体间的范德华力在经过后续步骤，如纯化步骤，单体间的结合状况亦不清楚，这些不确定因素皆会影响酶的葡萄糖氧化还原能力。
发明内容
鉴于上述课题，本发明旨在提供一种融合多肽具有催化葡萄糖氧化还原能力，其中该融合多肽包含一氨基酸序列，该氨基酸序列中包含γ-亚单元，具有SEQ ID No.1、α-亚单元，具有SEQ ID No.2、β-亚单元，具有SEQ ID No.3以及两个由5-15个氨基酸所组成的键结片段，分别连接γ-亚单元、α-亚单元以及β-亚单元，或1至5个氨基酸残基被取代、删除、附加、插入或/和加成的该氨基酸序列。
根据本发明部分实施例，α-亚单元位置326处被谷氨酰胺所取代，位置365处被酪鞍酸所取代。
根据本发明部分实施例，键结片段由8个甘氨酸所组成。
根据本发明部分实施例，键结片段由甘氨酸以及丝氨酸所组成。
根据本发明部分实施例，两键结片段的氨基酸序列不相同。
根据本发明部分实施例，融合多肽的平均分子量介于121至126kDa之间。
根据本发明部分实施例，氨基酸序列依序为SEQ ID No.1、该键结片段、SEQ IDNo.2、该键结片段、SEQ ID No.3。
本发明还提供一种血糖检测试片，具有一基板以及如前所述的融合多肽。
本发明还提供一种多核苷酸，其编码出前述的融合多肽。
根据本发明部分实施例，多核苷酸，依序包含：SEQ ID No.4，编码出该γ-亚单元；SEQ ID No.5，编码出该α-亚单元；以及SEQ ID No.6，编码出该β-亚单元。
根据本发明部分实施例，由具有以下核苷酸序列编码出各该键结片段：GGXGGXGGXGGXGGXGGXGGXGGX，其中X为T、A、C或G。
根据本发明部分实施例，多核苷酸包含SEQ ID No.7，编码出各所述的键结片段。
本发明还提供一种载体，其包含如上述的多核苷酸。
本发明还提供一种宿主细胞，其包含如上述的载体。
根据本发明部分实施例，三个亚单元藉由键结片段，融合形成单一蛋白质，可增加酶对葡萄糖的专一性，且在不同温度下仍具有高度稳定性，单一蛋白质的纯化工艺更为简易，使得酶可快速大量制备，可作为血糖浓度测量仪主要检测组件。
附图说明
本发明上述和其他方面以及特征将参照说明书内容并配合附图得到更清楚的了解，其中：
图1绘示依照本发明实施方式的一种融合多肽示意图。
图2根据本发明实施例的一种融合多肽蛋白质印迹法图示。
图3A绘示一市售酶在不同温度下的稳定性。
图3B绘示根据本发明实施例的一种融合多肽在不同温度下的稳定性。
具体实施方式
为了使本揭示内容的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施态样与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。以下所揭露的各实施例，在有益的情形下可相互组合或取代，也可在一实施例中附加其他的实施例，而无须进一步的记载或说明。在以下描述中，将详细叙述许多特定细节以使读者能够充分理解以下的实施例。然而，可在无此等特定细节的情况下实践本发明的实施例。
葡萄糖脱氢酶〈glucose dehydrogenase,GDH〉可用于生物传感器〈biosensors〉，属于催化型〈catalysis〉生物辨识组件。利用葡萄糖脱氢酶的催化能力与目标物选择性，可检测血糖代谢所产生的变化或代谢产物，再将信号转换成电子信号后以数据方式呈现。根据本发明部分实施例，提供一种具有催化葡萄糖氧化还原反应的融合多肽，其原始序列来源物种为Burkholderia cepacia。以下所提及的蛋白质、修饰蛋白质、变异体等皆以原始序列为基础。
参照图1。图1是根据本发明部分实施例的一融合多肽示意图。一融合多肽10包含三个亚单元11、13及15，融合多肽10还包含两键结片段17、19，各自将三个亚单元11、13及15结合形成单一蛋白质，可具有催化葡萄糖脱氢反应的活性。融合多肽10因键结片段组合不同，其平均总分子量介于121,000至126,000道尔顿的间〈121kDa–126kDa〉。本发明的融合多肽包含一氨基酸序列，将亚单元融合于单一氨基酸序列，使得脱氢酶各单体可透过一次性的表达即形成蛋白质结构，免去各个单体在载体上分开表达的不稳定性，可确保脱氢酶的功能性且增加脱氢酶于表达载体上的产量。根据本发明部分实施例，融合多肽10其中一亚单元为γ-亚单元11，γ-亚单元11由约169个氨基酸组成，平均分子量约为18,000道尔顿〈18kDa〉。γ-亚单元11具有氨基酸序列SEQ ID No.1。γ-亚单元11的较佳核苷酸序列可参考SEQ ID No.4，但不限于此。限制酶切点未示于氨基酸序列SEQ ID No.1，仅以转录起始位置表示。γ-亚单元11主要功能为帮助融合多肽10的另一亚单元，也就是α-亚单元13蛋白质折叠。
融合多肽10包含另一亚单元为α-亚单元13，α-亚单元13为催化葡萄糖氧氧化还原的主要反应中心，也可具有催化胆碱脱氢反应的活性。α-亚单元13由约539个氨基酸组成，平均分子量约为60,000道尔顿〈60kDa〉。根据本发明部分实施例，α-亚单元13的氨基酸序列可为SEQ ID No.2，较佳核苷酸序列可见SEQ ID No.5，但不限于此。根据本发明部分实施例，α-亚单元13可以为胆碱脱氢酶变异体，为了增加融合多肽10对于葡萄糖的选择性，进一步对习知的胆碱脱氢酶修饰，可增加融合多肽10对于葡萄糖的专一性。对于α-亚单元13的修饰分别发生在SEQ ID No.2位置326的丝氨酸转换为谷氨酰胺〈Gln〉，以及SEQ ID No.2位置365的丝氨酸转换为酪氨酸〈Tyr〉。透过进一步修饰α-亚单元13可有效提升融合多肽10对葡萄糖的选择性，而不受其他糖类干扰，产生接近实际血糖浓度的电子信号。
融合多肽10还包含另一亚单元，β-亚单元15。β-亚单元15由约415个氨基酸组成，平均分子量约为43,000道尔顿〈43kDa〉。根据本发明部分实施例，β-亚单元15的氨基酸序列表可见SEQ ID No.3，较佳核苷酸序列表可见SEQ ID No.6，但不限于此。β-亚单元15主要功能为催化反应中的电子传递中心。β-亚单元15于表达载体中具有6个组氨酸标记，因此由SEQ ID No.3换算出的核苷酸序列数目会多于SEQ ID No.6数目。
融合多肽10为γ-、α-及β-亚单元11、13、15共同组成，藉由两个键结片段〈linker〉17、19相连接。根据本发明部分实施例，融合多肽10的三个亚单元顺序为γ-亚单元11、α-亚单元13及β-亚单元15，换言之，其氨基酸序列可由SEQ ID No.1、键结片段17、SEQ ID No.2、键结片段19与SEQ ID No.3依序连接。
根据本发明部分实施例，两个键结片段17、19可由5至15个氨基酸组成，α-亚单元13外露的两端链长可决定所使用的键结片段17、19的氨基酸长度或种类。透过键结片段17，γ-亚单元11与α-亚单元13结合，中间透过键结片段17可与数个，如5个，来自α-亚单元13的氨基酸产生键结。α-亚单元另一端的4个氨基酸与键结片段19结合，β-亚单元再连接至键结片段19的自由端，形成融合多肽10同时包含三个单体的结构。由三个蛋白质单体融合成单一蛋白质形态的融合多肽10的平均分子量介于121,000至126,000道尔顿〈121-126kDa〉。
根据本发明部分实施例，键结片段17、19可皆为8个甘氨酸〈Gly〉所构成的链状肽，核苷酸序列可为SEQ ID No.7。键结片段17、19亦可具有不同长度，例如，键结片段17、19可为6个甘氨酸所组成。另外，键结片段亦可由不同氨基酸组成，例如，由甘氨酸与丝氨酸组成的(Gly)4-Ser结构，此片段需重复至少两次以上。也就是说，键结片段17、19可具有一氨基酸序列[(Gly)4-Ser]2，或一氨基酸序列[(Gly)4-Ser]3。键结片段17、19可具有不同长度及组合的氨基酸序列，例如，键结片段17可以由(Gly)6所组成，而键结片段19可以由[(Gly)4-Ser]2所组成。产生键结片段17、19中的甘氨酸的核苷酸序列为GGX，X可为T、A、C或G。产生键结片段17、19中的丝氨酸的核苷酸序列可为TCT。
融合多肽10可透过公知的蛋白质表达方式大量生产制造。首先，合成γ-、α-、β-亚单元以及两键结片段的基因，将重组基因植入蛋白质表达载体，将载体植入可表达的宿主细胞，例如BL21大肠杆菌，即可大量生产融合多肽10。此蛋白质表达方式为本领域技术人员熟知，故不多作赘述。
为促使融合多肽10在宿主细胞中大量表达，γ-、α-、β-亚单元的核苷酸序列可依宿主细胞特性修饰。例如，若使用大肠杆菌为宿主细胞，亚单元重组基因编码须考虑大肠杆菌密码子出现频率、模式等因素，以提供融合多肽10产能的最大效益。
参照图2。图2是根据本发明实施例的一种融合多肽蛋白质印迹法图示。融合多肽10的合成蛋白质结构经过载体表达，形成具有6个组氨酸标签的融合酶，将细胞溶解的后，经过组氨酸标签键结，经过两次清洗，第一次清洗为组氨酸键结反应后六小时，收集第一溶出液。再进行第二次清洗，收集第二溶出液，最后进行蛋白质印迹〈western blotting〉分析。蛋白质印迹法图示20上第一栏为蛋白质尺标21、第二栏为第一清洗液23、第三栏为第二清洗液25、第四栏为第一溶出液27、第五栏为第二溶出液29。由蛋白质印迹法图示20可以发现，第一或第二清洗液23、25中，并不包含可被检测的融合酶。第一、第二溶出液25、27则明显包含分子量约为123,000道尔顿〈123kDa〉的析出物，此析出物即为组氨酸标签的融合酶。
温度为影响葡萄糖脱氢酶表达的重要因素，不同温度会影响葡萄糖脱氢酶稳定性，尤其在较高环温下，甚至会出现伪阳性结果。请参照图3A与图3B。根据本发明部分实施例，融合多肽10与市售葡萄糖脱氢酶在不同温度环境下比较其稳定性，图3A为经过市售酶催化反应的血糖，在不同温度，经过2分钟及4分钟反应后，对二氯酚靛酚〈DCPIP〉的相对吸光值(实验组吸光值扣除对照组吸光值)实验结果直方图。从图3A可见，在环温37℃下，相对吸光值最高，代表市售酶对葡萄糖的催化反应效果最剧烈，当温度降至25℃，相对吸光值大量减少。例如，在反应2分钟后，37℃的相对吸光值约为0.24，然而在25℃的环境下，反应2分钟后，相对吸光值降至0.15，其中差距将近四成。在其他条件不变的前提，环温为15℃时，相对吸光值大幅降至约0.01，显见市售葡萄糖脱氢酶对于温度相当敏感，严重影响血糖浓度判读。
继续参照图3B。图3B为经过融合多肽10催化反应的血糖，在不同温度，经过2分钟及4分钟反应后，对二氯酚靛酚〈DCPIP〉的相对吸光值实验结果直方图。从图3B可见，在环温37℃下，相对吸光值仍为最高，但是在25℃、20℃以及15℃的环温下，相对吸光值相较于37℃变化差异不大，仅在0.04的范围内游移。由此可见，融合多肽10不易受环温影响其酶功能，可准确提供血糖浓度数值。
根据本发明部分实施例，融合多肽10在木糖与葡萄糖的间的选择性高，且对于麦芽糖的活性相较于市售酶也降低，代表融合多肽10对葡萄糖的专一性提升，运用于生物检测时的准确度提高。
根据本发明部分实施例，融合多肽10可用于血糖测试仪。血糖测试仪主要检测组件包含一基板，将融合多肽10设置于基板的上，并维持其活性，将受测物放置于基板上，经过融合多肽10催化电子传递，葡萄糖氧化，将受测物中葡萄糖变化量转换成电子信号，输出为可读信息，即可得知受测物的血糖浓度。
本发明提供的融合多肽为一蛋白质复合物，三个亚单元经由基因重组，并分别由两个键结片段连结。再透过蛋白质表达载体于宿主细胞内大量表达。且纯化后所收集的融合多肽对葡萄糖展现高度选择性，不受木糖或麦芽糖等其他糖类影响，在不同温度下其葡萄糖脱氢酶功能维持稳定，可广泛应用于生物检测仪，不仅生产方式简易快速，且可提供更精准的数值。
虽然本发明已以实施方式揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可作各种修改与改变，因此本发明的保护范围视后附权利要求所界定者为准。
Claims (14)
1.一种融合多肽，其特征在于，所述的融合多肽具有催化葡萄糖氧化还原能力，所述的融合多肽包含：
一氨基酸序列，所述的氨基酸序列包含：
γ-亚单元，具有SEQ ID No.1；
α-亚单元，具有SEQ ID No.2；
β-亚单元，具有SEQ ID No.3；以及
两个由5-15个氨基酸所组成的键结片段，分别连接γ-亚单元、α-亚单元以及β-亚单元；
或1至5个氨基酸残基被取代、删除、附加、插入或/和加成的所述的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的融合多肽，其特征在于，所述的α-亚单元位置326处被谷氨酰胺所取代，位置365处被酪鞍酸所取代。
3.如权利要求1所述的融合多肽，其特征在于，各所述的键结片段由8个甘氨酸所组成。
4.如权利要求1所述的融合多肽，其特征在于，各所述的键结片段由甘氨酸以及丝氨酸所组成。
5.如权利要求1所述的融合多肽，其特征在于，所述的两键结片段的氨基酸序列不相同。
6.如权利要求1所述的融合多肽，其特征在于，所述的融合多肽的平均分子量介于121至126kDa之间。
7.如权利要求1所述的融合多肽，其特征在于，所述的氨基酸序列依序为SEQ ID No.1、所述的键结片段、SEQ ID No.2、所述的键结片段、SEQ ID No.3。
8.一种血糖检测试片，其特征在于，所述的血糖检测试片具有一基板以及如权利要求1所述的所述的融合多肽。
9.一种多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码出权利要求第1项所述的融合多肽。
10.如权利要求9所述的多核苷酸，其特征在于，依序包含：
SEQ ID No.4，编码出所述的γ-亚单元；
SEQ ID No.5，编码出所述的α-亚单元；以及
SEQ ID No.6，编码出所述的β-亚单元。
11.如权利要求9所述的多核苷酸，其特征在于，由具有以下核苷酸序列编码出各所述的键结片段：
GGXGGXGGXGGXGGXGGXGGXGGX，其中X为T、A、C或G。
12.如权利要求9所述的多核苷酸，其特征在于，包含SEQ ID No.7，编码出各所述的键结片段。
13.一种载体，其特征在于，所述的载体包含如权利要求9所述的多核苷酸。
14.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包含如权利要求13所述的载体。
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