CN107422009A - 一种方便检测葡萄糖的非酶电化学生物传感方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种方便检测葡萄糖的非酶电化学生物传感方法，通过在丝网印刷碳电极上进行石墨烯修饰后，在其表面π‑π堆积组装苯基‑葡聚糖制备成传感器，再将制备的刀豆素A(Con A)功能化金纳米(Au NP)探针与葡萄糖溶液直接混合后用于传感器表面的竞争识别，来捕获Au NP标记物，并通过电化学溶出分析来检测特异性识别在电极表面的Au NP标记物以进行传感器的信号转导，从而检测出葡萄糖溶液中葡萄糖的含量；本发明操作简便，具有灵敏度高、线性范围宽、成本低等优点，克服了传统酶生物电化学传感器制备方法复杂，分析成本较高，而且溶液受到实际样品中电活性物质的信号干扰等缺陷。

Description

一种方便检测葡萄糖的非酶电化学生物传感方法
技术领域
本发明涉及生物电化学传感技术领域，具体是一种方便检测葡萄糖的非酶电化学生物传感方法。
背景技术
糖尿病是一种严重危害人类健康的世界性多发病，其主要症状表现为血糖偏高和胰岛素缺乏引起的代谢紊乱。因此，发展性能优良的葡萄糖检测方法，对于糖尿病人临床诊断和疾病监控具有十分重要的意义。目前，应用最广泛的是基于酶促反应的葡萄糖生物传感器，其最基本的原理是：利用固定化葡萄糖氧化酶膜作为生物识别器件，将检测到的葡萄糖量转化成可用输出信号。与传统的光度、色谱和化学发光等分析方法相比，基于纳米修饰电极和电化学信号转导方式发展起来的电化学葡萄糖生物传感器由于具有操作方便、快速，成本低廉，灵敏度高和选择性好等独特优点，近年来受到人们极大关注。其中，最有代表性的成果即为在此基础上成功开发的商品化血糖仪。然而，由于这类传感器一般都基于葡萄糖氧化酶的酶催化反应引起的电化学信号而建立，因而其在实际应用中通常会受到来自抗坏血酸、尿酸、多巴胺、溶解氧等电活性共存物的电化学电信号干扰。此外，电极表面的复杂修饰过程和葡萄糖氧化酶的生物活性保持也会在一定程度上制约其分析性能。
作为植物凝集素家族中的重要成员之一，刀豆素A(Concanavalin A，简称为ConA) 为一种分子量约为102KDa的四聚体球糖基识别蛋白，其每个亚基由237个氨基酸残基组成，分子量为25.5KDa。在中性条件下，每个亚基除含有一个疏水识别位点，一个Ca2+和一个Mn2+识别位点（以激活其糖识别位点）以外，还含有一个能够与α-甘露糖、α-葡萄糖进行特异性识别作用的糖结合位点。葡聚糖作为一种葡萄糖的聚合物，其与Con A的亲和力与葡萄糖单糖相比要小得多，因而可以在此基础上构建一种葡萄糖-Con A-葡聚糖竞争识别分析系统。
发明内容
本发明的目的就是针对目前的血糖仪在实际应用中通常会受到来自抗坏血酸、尿酸、多巴胺、溶解氧等电活性共存物的电化学电信号干扰等问题，提供一种方便检测葡萄糖的非酶电化学生物传感方法，该方法操作简便，具有灵敏度高、线性范围宽、成本低等优点，很好克服了传统酶生物电化学传感器制备方法复杂，分析成本较高，而且溶液受到实际样品中电活性物质的信号干扰等缺陷。
本发明的一种方便检测葡萄糖的非酶电化学生物传感方法，包括以下步骤：
（1）电化学传感器的制备
向丝网印刷碳电极的工作电极表面滴加1.8μL 1mg/mL的氧化石墨烯分散液，室温晾干后转入浓度为50mM pH=6.5的Tris-HCl中，采用恒电位电化学还原法，即电位为-1.2V，扫描速率为100mV/s，时间为600s，将氧化石墨烯转化为还原石墨烯，水洗后室温晾干，即可得到还原石墨烯修饰电极；再向制备好的还原石墨烯修饰电极表面滴加2.0μL浓度为3.0μM苯基-葡聚糖的10mM pH=7.4 Tris-HCl溶液，37℃反应2h后水洗晾干，置于4℃干燥环境中保存待用；
（2）Au NP-Con A纳米探针的制备
取1.0mL直径为13nm的金纳米粒子，离心弃去上清液后，将金纳米粒子分散于装有1.0mL 5mM pH=7.0 Tris-HCl和0.5% 吐温-20的混合溶液的容器中，向其中加入500μL浓度为1mM的3-巯基丙酸溶液，旋转混匀反应2h，再将所得的溶液离心，使用10mM pH=7.0的Tris-HCl溶液洗涤两次，再加入100μL浓度为3mg/mL的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐、60μL浓度为1mg/mL的刀豆素A和100μL浓度为3mg/mL牛血清白蛋白的三者混合液，于旋转混匀仪中室温反应1h，然后将所得产物经冷冻离心、使用10mM pH=7.0的Tris-HCl溶液洗涤两次后分散于500μL 浓度为10mM的Tris-HCl含有2mM Ca2+和2mM Mn2+的溶液中，于4℃保存待用；
（3）标准溶液中葡萄糖含量的检测
向制备好的传感器表面滴加20μL Au NP-Con A纳米探针和10μL葡萄糖标准溶液，37℃下动态温育30min后采用50mM pH=7.0 Tris-HCl/Tween-20溶液和Tris-HCl溶液分别清洗、晾干后，滴加30μL 0.1mol/L HCl溶液，在1.3V恒电位预氧化40s后立即通过示差脉冲伏安法在0.5-0V范围内记录其电流响应值，从而检测标准溶液中葡萄糖的含量；
（4）样品中葡萄糖含量的检测
取临床血清样品，每个样品分别进行5个平行试验，向制备好的传感器表面滴加20μLAu NP-Con A纳米探针和10μL样品溶液，处理方法同上述标准溶液，检测血清样品中葡萄糖的含量。
本发明的工作原理是：通过在石墨烯修饰电极表面自组装固定苯基葡聚糖制备成生物传感器，然后利用待测溶液中的葡萄糖与电极表面固定的葡聚糖对制备的Au NP-ConA纳米探针的竞争识别作用来定量捕获Au NP标记物于电极表面，进而利用Au NPs在电极表面的电化学溶出分析来实现传感器的灵敏电化学信号转导及其定量关系构建。
本发明构建的生物传感方法可以方便、简洁地对糖尿病人的血糖含量进行检测，具有灵敏度高、线性范围宽，检测时间短，可在0.05~100mM浓度范围内实现对葡萄糖的定量响应和准确测定，检测成本低等优良性能，很好克服了传统酶生物电化学传感器制备方法复杂，分析成本较高，而且溶液受到实际样品中电活性物质的信号干扰等缺陷。
附图说明
图1是电化学传感器的制备示意图；
图2是Au NP-Con A纳米探针的制备示意图；
图3是葡萄糖电化学检测原理示意图。
具体实施方式
实施例1 一种方便检测葡萄糖的非酶电化学生物传感方法，包括以下步骤：
（1）电化学传感器的制备
向丝网印刷碳电极的工作电极表面滴加1.8μL 1mg/mL的氧化石墨烯分散液，室温晾干后转入浓度为50mM pH=6.5的Tris-HCl中，采用恒电位电化学还原法，即电位为-1.2V，扫描速率为100mV/s，时间为600s，将氧化石墨烯转化为还原石墨烯，水洗后室温晾干，即可得到还原石墨烯修饰电极；再向制备好的还原石墨烯修饰电极表面滴加2.0μL浓度为3.0μM苯基-葡聚糖的10mM pH=7.4 Tris-HCl溶液，37℃反应2h后水洗晾干，置于4℃干燥环境中保存待用。
（2）Au NP-Con A纳米探针的制备
取1.0mL直径为13nm的金纳米粒子，离心弃去上清液后，将金纳米粒子分散于装有1.0mL 5mM pH=7.0 Tris-HCl和0.5% 吐温-20的混合溶液的容器中，向其中加入500μL浓度为1mM的3-巯基丙酸溶液，旋转混匀反应2h，再将所得的溶液离心，使用10mM pH=7.0的Tris-HCl溶液洗涤两次，再加入100μL浓度为3mg/mL的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐、60μL浓度为1mg/mL的刀豆素A和100μL浓度为3mg/mL牛血清白蛋白的三者混合液，于旋转混匀仪中室温反应1h，然后将所得产物经冷冻离心、使用10mM pH=7.0的Tris-HCl溶液洗涤两次后分散于500μL 浓度为10mM的Tris-HCl含有2mM Ca2+和2mM Mn2+的溶液中，于4℃保存待用。
实施例2 标准溶液中葡萄糖含量的检测
向制备好的传感器表面滴加含有20μL Au NP-Con A纳米探针和10μL葡萄糖标准溶液的混合溶液，所述葡萄糖标准溶液的浓度梯度分别为0.05mM、0.1mM、1mM、10mM、100mM，在37℃下动态温育30min后采用50mM pH=7.0 Tris-HCl/Tween-20溶液和Tris-HCl溶液分别清洗、晾干后，滴加30μL 0.1mol/L HCl溶液，在1.3V恒电位预氧化40s后立即通过示差脉冲伏安法（DPV）在0.5-0V范围内记录其电流响应值，从而检测标准溶液中葡萄糖的含量，得到的葡萄糖标准溶液的工作曲线，见下表1。
表1 葡萄糖标准溶液工作曲线
检测物 线性范围（mM） 线性相关系数 检测限（mM）
葡萄糖 0.05-100 0.998 0.02
实施例3 人血清中葡萄糖含量的检测
取三个临床血清样品，每个样品分别进行5个平行试验，样品的处理方法同上述标准溶液，经检测样品中葡萄糖的浓度见下表2，将上述三个临床血清样品使用医院商品化分析仪器（雅培C8000全自动生化分析仪）的测定结果进行比较，结果下表2。
表2 本实施例与医院商品化分析仪器的测定结果比较
样品编号 1号 2号 3号
雅培C8000全自动生化分析仪检测结果（mM） 23.51 7.09 0.858
本实施例检测结果（mM） 24.77 6.81 0.913
本实施例相对标准偏差（RSD%） 5.2 6.7 4.9
本实施例相对误差（%） 5.4 -3.9 6.4
从上表2可以看出，本实施例测试结果的相对标准偏差（RSD）为4.9-6.7%，相对误差为-3.9-6.4%，说明本实施例的分析方法具有较高的重复性和稳定性。将本实施例的测试结果与医院使用的雅培C8000全自动生化分析仪检测结果相比较，1号样品的相对误差为5.4%，2号样品的相对误差为-3.9%，3号样品的相对误差为6.4%，由此可见，本实施例的检测葡萄糖的电化学分析方法具有较高的准确度。

Claims (1)

1.一种方便检测葡萄糖的非酶电化学生物传感方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）电化学传感器的制备
向丝网印刷碳电极的工作电极表面滴加1.8μL 1mg/mL的氧化石墨烯分散液，室温晾干后转入浓度为50mM pH=6.5的Tris-HCl中，采用恒电位电化学还原法，即电位为-1.2V，扫描速率为100mV/s，时间为600s，将氧化石墨烯转化为还原石墨烯，水洗后室温晾干，即可得到还原石墨烯修饰电极；再向制备好的还原石墨烯修饰电极表面滴加2.0μL浓度为3.0μM苯基-葡聚糖的10mM pH=7.4 Tris-HCl溶液，37℃反应2h后水洗晾干，置于4℃干燥环境中保存待用；
（2）Au NP-Con A纳米探针的制备
取1.0mL直径为13nm的金纳米粒子，离心弃去上清液后，将金纳米粒子分散于装有1.0mL 5mM pH=7.0 Tris-HCl和0.5% 吐温-20的混合溶液的容器中，向其中加入500μL浓度为1mM的3-巯基丙酸溶液，旋转混匀反应2h，再将所得的溶液离心，使用10mM pH=7.0的Tris-HCl溶液洗涤两次，再加入100μL浓度为3mg/mL的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐、60μL浓度为1mg/mL的刀豆素A和100μL浓度为3mg/mL牛血清白蛋白的三者混合液，于旋转混匀仪中室温反应1h，然后将所得产物经冷冻离心、使用10mM pH=7.0的Tris-HCl溶液洗涤两次后分散于500μL 浓度为10mM的Tris-HCl含有2mM Ca2+和2mM Mn2+的溶液中，于4℃保存待用；
（3）标准溶液中葡萄糖含量的检测
向制备好的传感器表面滴加20μL Au NP-Con A纳米探针和10μL葡萄糖标准溶液，37℃下动态温育30min后采用50mM pH=7.0 Tris-HCl/Tween-20溶液和Tris-HCl溶液分别清洗、晾干后，滴加30μL 0.1mol/L HCl溶液，在1.3V恒电位预氧化40s后立即通过示差脉冲伏安法在0.5-0V范围内记录其电流响应值，从而检测标准溶液中葡萄糖的含量；
（4）样品中葡萄糖含量的检测
取临床血清样品，每个样品分别进行5个平行试验，向制备好的传感器表面滴加20μLAu NP-Con A纳米探针和10μL样品溶液，处理方法同上述标准溶液，检测血清样品中葡萄糖的含量。
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