CN103328980A - 具有提高的敏感性的竞争性生物传感器 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于测定葡萄糖和诊断基于受损的葡萄糖代谢的疾病的方法。特别地，本发明涉及包含水凝胶的装置，所述水凝胶具有掺入其中的葡萄糖结合蛋白及葡萄糖结合蛋白的配体，其中所述水凝胶包含由藻酸盐制成的第一水凝胶基质和在所述第一水凝胶基质内形成互穿网络的第二水凝胶基质。本发明进一步涉及此类装置的用途，所述装置用于测定样品中葡萄糖的含量和诊断测试的受试者中的受损的葡萄糖代谢。

Description

具有提高的敏感性的竞争性生物传感器
本发明涉及用于测定葡萄糖和诊断基于受损的葡萄糖代谢的疾病的方法。特别地，本发明涉及包含水凝胶的装置，所述水凝胶具有掺入其中的葡萄糖结合蛋白及葡萄糖结合蛋白的配体，其中所述水凝胶包含由藻酸盐制成的第一水凝胶基质和在所述第一水凝胶基质内形成互穿网络的第二水凝胶基质。本发明进一步涉及此类装置的用途，所述装置用于测定样品中葡萄糖的含量和诊断测试的受试者中受损的葡萄糖代谢。
在许多技术领域中，通过有效而可靠的测量技术测定葡萄糖的浓度是非常重要的。不仅在纯实验室分析，而且在食品工业，例如，在酒学领域、医学领域中，例如在由受损的葡萄糖代谢引起的疾病，例如糖尿病或代谢综合征的诊断中，快速而可靠地测定给定溶液中葡萄糖的浓度至关重要。在诊断基于受损的葡萄糖代谢的疾病的领域中，将葡萄糖传感器用于可植入到机体内并可测量从机体内取出的样品中的葡萄糖含量的装置中，并且也用于测量来自测试的受试者样品的离体的葡萄糖的含量的传感器中。
为了测定溶液中葡萄糖的含量，已经描述了由传感器分子和配体制成的系统，其中，所述传感器是葡萄糖结合蛋白，所述配体是葡萄糖的竞争剂，该配体起初存在于传感器中，并与葡萄糖传感器分子结合。在测量过程中通过与葡萄糖的竞争，将该竞争剂从葡萄糖结合蛋白替换。在此期间，葡萄糖将竞争剂从葡萄糖结合蛋白替换，此替换可以通过分子的物理或化学性质的改变来检测，例如通过荧光共振能量转移（FRET）来检测。当然，上述系统必须存在于传感器的空间划定区域中。
对于包围（enclosure）该系统的组分，即葡萄糖结合分子和用作竞争剂的配体，已经证明了水凝胶的价值。用于此的合适的水凝胶可以是聚乙二醇，也可以是藻酸盐（例如US2007/0105176;US6,485,703;Russell1999,Anal Chem71:3126-3132）。此外，已经描述了传感器，其中，由半透膜包围在水性介质中的上述系统。此类膜可以例如包括再生纤维素、聚乙二醇、聚氨酯、叠层（LBL）的层、聚醚砜、对苯二乙酸层或多孔二氧化硅（例如US2007/0122829）。
然而，现有技术中所述的葡萄糖传感器显示出相对低的葡萄糖活性。葡萄糖的活性和由此导致的传感器的性能主要由葡萄糖结合蛋白和竞争剂形成的复合体以及葡萄糖结合蛋白和葡萄糖形成的复合体的结合常数决定。
在离体传感器的情况下，因为分析物没有被再次释放，为了获得尽可能高的传感器灵敏度，可以选择具有几乎任意量值的结合常数的分析物受体，所以主要通过非常高的结合常数可以获得非常高的特异性以及由此导致的良好的传感器性能。
然而，对于体内的传感器而言，情况有所不同，这是因为传感器必须持续并可逆地反应分析物浓度的变化。因此，结合常数不能太高，否则传感器在低的分析物浓度时就已经饱和，不再能指示浓度的变化。此外，体内传感器的另一个问题在于：分析物的浓度范围是固定的，且不能够通过稀释或浓缩而优化。因此基本上在现有技术中，在所描述的由配体和葡萄糖结合蛋白组成的系统中应用介质结合常数。通常通过改变葡萄糖结合蛋白或配体或两者的浓度来适应测量的灵敏度受限于各个分子的低溶解度。因此，在上述的现有技术中所述的传感器中，传感器的测量灵敏度和测量精确性都受到限制（参见Rounds2007,J.Fluorec.17:57-63）。
本发明的目的是提供一种设备，其能够更有效地测定甚至体内葡萄糖的水平，使用所述设备基本上消除了上述的缺陷。通过权利要求描述的实施方案和下文公开的实施方案解决了本发明。
因此，本发明涉及包含水凝胶的装置，所述水凝胶具有掺入其中的葡萄糖结合蛋白和葡萄糖结合蛋白的配体，其中所述水凝胶包含由藻酸盐制成的第一水凝胶基质和在所述第一水凝胶基质内形成互穿网络的第二水凝胶基质。
根据本发明的装置还涉及由上述组分组成的组合物。
术语“水凝胶”描述了含水聚合物，其分子以化学方式或物理方式连接成三维网络。聚合物分子可以通过共价键或离子键，或者通过缠绕或编织，连接成三维网络。形成水凝胶的聚合物优选地含有能够吸收水性溶液的亲水性聚合物组分和能与葡萄糖结合蛋白相互作用的基团。
根据本发明的水凝胶包含由藻酸盐制成的第一水凝胶基质和能够在由藻酸盐形成的水凝胶基质中形成互穿网络的第二水凝胶基质。第二水凝胶基质优选由水溶性聚合物组成，所述水溶性聚合物的每一个分子具有至少一个可交联基团，且所述水溶性聚合物具有最多500,000的分子量。特别优选的是最多为250,000、200,000、150,000、100,000或50,000的分子量。在此，第二水凝胶基质优选地选自：聚乙烯醇（PVA）、聚乙二醇（PEG）、聚（2-
Figure BDA00003523287800033
唑啉）、聚丙烯酰胺（例如二甲基丙烯酰胺）、多羟基丙烯酸酯（例如多羟基丙烯酸甲酯、多羟基丙烯酰胺、聚乙烯吡咯啉酮）、（2-甲基-3-乙基[2-羟乙基]）的聚合物、聚羟基链烷酸酯（PHA）、聚（2-甲基-2
Figure BDA00003523287800034
唑啉）、聚（2-乙基-2
Figure BDA00003523287800035
唑啉）、聚（2-羟乙基-2-
Figure BDA00003523287800031
唑啉）、聚（2-（1-（羟甲基）-乙基）-2唑啉）、聚甲基丙烯酸羟乙酯（PHEMA）、聚丙烯酸羟乙酯（PHEA）、聚乙烯吡咯烷酮、聚（二甲基）丙烯酰胺、聚(羟乙基）丙烯酰胺、聚乙烯醇（包括与乙酸乙烯酯和/或乙烯的共聚物）、聚(乙烯-共聚-乙烯醇)、聚（乙酸乙烯酯-共聚-乙烯醇）、聚（乙烯-共聚-乙酸乙烯酯-共聚-乙烯醇）、聚乙二醇以及聚（乙二醇-共聚-丙二醇）。
根据本发明的互穿网络优选地通过以下方式得到，即在已经存在的第一聚合物的存在下聚合第二聚合物的单体。特别优选地，这可以通过实施例中更加详细地描述的方法进行。因此实现了：在已经存在的第一聚合物的网络中可以形成第二聚合物的互穿网络。因此，聚合物网络彼此相互编织和/或缠绕。与此相反，多种聚合物作为彼此不相互编织和/或缠绕的单独的网络并排存在于混合物中。
特别优选地，第一聚合物和第二聚合物的交联机制是不同的，以便不会产生混合交联。产生第一水凝胶基质的上述藻酸盐通过离子相互作用交联。产生互穿网络的上述第二聚合物全部通过自由基或离子聚合交联。
特别优选地，由聚乙烯醇形成了第二水凝胶基质。特别优选地聚乙烯醇的分子量为10,000—100,000，更优选地为10,000—50,000，再优选地为10,000—20,000，最优选地为15,000。特别优选地，聚乙烯醇具有的交联剂含量为至多0.5mmol/g、0.4mmol/g、0.35mmol/g或0.3mmol/g，且相当优选地为0.35mmol/g。此外，特别优选地，聚乙烯醇具有少于40的重量百分数的预聚物固体含量。
第一水凝胶基质和第二水凝胶基质以及根据本发明的水凝胶可以包含添加剂，例如稳定剂、乳化剂、抗氧化剂、紫外线稳定剂、洗涤剂和/或紫外线引发剂。
此外，可以通过进一步优选的半渗透性覆盖材料包围根据本发明使用的水凝胶。通过这种包围，防止了传感器组分从水凝胶“浸出”。可能的覆盖材料为半透膜或其他的水凝胶基质。优选地，半透膜可以包含再生纤维素、聚乙二醇、聚氨酯、叠层（LBL）的层、聚醚砜、对苯二乙酸层或多孔二氧化硅。优选地，还可以由选自以下的聚合物形成水凝胶基质：藻酸盐、琼脂糖、透明质酸、壳聚糖、聚乙烯醇（PVA）、聚乙二醇（PEG）、角叉菜胶和聚羟基链烷酸酯（PHA）、聚（2-甲基-2
Figure BDA00003523287800041
唑啉）、聚（2-乙基-2
Figure BDA00003523287800042
唑啉）、聚（2-羟乙基-2唑啉）、聚（2-（1-（羟甲基）-乙基）-2
Figure BDA00003523287800044
唑啉）、聚甲基丙烯酸羟乙酯（PHEMA）、聚丙烯酸羟乙酯（PHEA）、聚乙烯吡咯烷酮、聚（二甲基）丙烯酰胺、聚(羟乙基）丙烯酰胺、聚乙烯醇（包括与乙酸乙烯酯和/或乙烯的共聚物）、聚（乙烯-共聚-乙烯醇）、聚（乙酸乙烯酯-共聚-乙烯醇）、聚（乙烯-共聚-乙酸乙烯酯-共聚-乙烯醇）、聚乙二醇以及聚（乙二醇-共聚-丙二醇）。
在本发明的上下文中术语“葡萄糖结合蛋白”是指能与葡萄糖特异地相互作用的蛋白质。本领域技术人员通过现有技术中已知的结合测试可以容易地确定蛋白质是否能够与葡萄糖特异地相互作用。特别优选地，葡萄糖结合蛋白选自凝集素、将葡萄糖作为底物而结合的酶、特异地识别葡萄糖的抗体。术语“葡萄糖结合蛋白”还包括能特异地识别葡萄糖的替代分子，优选地为特异地识别葡萄糖的适配体。特别优选地，葡萄糖结合蛋白为伴刀豆球蛋白A。
现有技术中已知编码上述葡萄糖结合蛋白的核酸序列和氨基酸序列(Yamauchi1990,FEBS Letters260(1):127-130)。因此，本领域技术人员可以容易地制备上述蛋白。例如，所述蛋白可以通过重组制备或者从生物源纯化。此外，也可以以化学方法合成所述蛋白质。此外，大多数上述蛋白质是商业上可得到的。本领域技术人员通过现有技术中已知的获得抗体或适配体的方法可以容易地制备特异地识别葡萄糖的抗体或适配体。
上述的葡萄糖结合蛋白，尤其伴刀豆球蛋白A，优选地也可以具有化学修饰，与未经化学修饰的葡萄糖结合蛋白形式相比，所述化学修饰介导了增加的水溶性。此类修饰优选地包含用水溶性聚合物进行的官能化，并且在特别优选的实施方案中所述官能化可以选自：聚乙二醇化、乙酰化、聚
Figure BDA00003523287800051
唑啉化和琥珀酰化。
由于在根据本发明的装置中通过在样品中含有的葡萄糖替换与葡萄糖结合蛋白结合的配体(在配体和葡萄糖之间竞争)，所以实现了样品中用于分析的葡萄糖的检测。因此优选地配体对葡萄糖结合蛋白具有的亲和力低于葡萄糖。优选地通过用染料或其它可检测的标记分子标记配体可以检测该替换。已经证明接近分子并与其结合从而引起至少一个可测量的物理或者化学性质的变化的染料或其它标记分子特别适合检测替换。合适的系统包括其中通过染料分子之间的能量转移抑制或产生了可测量的信号的那些系统。例如在WO2001/13783中详细描述了此类基于能量转移的系统。优选地是这样的系统，其中，当染料或标记分子—以及葡萄糖结合蛋白及其配体—在空间接近时，通过猝灭效应抑制了荧光信号。通过分析物替换配体后，猝灭效应消失了。通过荧光的变化来检测这种效应。对于检测，例如可以使用在WO2002/087429中描述的荧光光度计。其他合适的系统称作基于荧光共振能量转移（FRET）的检测系统。在这些系统中，用荧光染料标记两个相互作用的组分，如葡萄糖结合蛋白及其配体。将一个组分与受体染料偶联，将另外一个与供体染料偶联。通过组分的相互作用，染料取得了空间接近，从而产生了FRET效应，其中激发能从供体染料转移到受体染料，因此，供体染料强度可测量地减少。当中断组分间的相互作用，供体的荧光强度会再次增加。因此，在根据本发明的装置的情况下，通过分析物分离葡萄糖结合蛋白和配体的复合体之后，通过染料或者标记分子产生的信号强度的增加可以检测葡萄糖。将染料或者标记分子偶联到葡萄糖结合蛋白或配体。例如，可以将供体染料偶联到葡萄糖结合蛋白或配体上，而将未与供体染料偶联的组分偶联至合适的受体染料上。在根据本发明配置的装置中，在暴露于含葡萄糖的样品之前，可以观察FRET效应，该效应是由配体与葡萄糖结合蛋白结合产生的。暴露后，葡萄糖替换配体，以致供体染料的可测量的荧光强度增加，事实上所述荧光强度与葡萄糖的数量成比例。
Birch等人(Birch2001,Spectrochimica Acta Part A57:2245-2254)已经计算了在伴刀豆球蛋白A作为葡萄糖结合蛋白、葡聚糖作为配体的情况下的化学平衡的数学解答。用改变浓度的伴刀豆球蛋白A和葡聚糖进行的模拟已经显示：（葡聚糖）/（Con A-葡聚糖的复合体）的比例仅轻度地取决于起始浓度，并且常数KDex和KGluc是传感器性能的主要因素。
然而，令人惊奇的是，染料的结构也影响葡萄糖的活性。因此，根据本发明，罗丹明和
Figure BDA00003523287800064
嗪染料的组合明显优于常规使用的氧杂蒽和罗丹明染料的组合(FITC-TMR)。
优选地，将在本发明的上下文中使用的葡萄糖结合蛋白与
Figure BDA00003523287800065
嗪染料连接。本领域技术人员已知并且在现有技术中充分地描述了这样的连接是如何实现的。特别优选地，
Figure BDA00003523287800061
嗪染料是
Figure BDA00003523287800062
嗪受体，其选自：ATTO655、ATTO680、EVOblue10、EVOblue30、EVOblue90和EVOblue100。特别优选地，使用ATTO680。所述
Figure BDA00003523287800063
嗪染料是商业上可得到的。
用于葡萄糖结合蛋白（例如伴刀豆球蛋白A）的优选的标记程度(DOL)为0.1—4，更优选地为1—4，特别优选地为1—3。对于伴刀豆球蛋白A而言，此处1DOL对应于每摩尔伴刀豆球蛋白A四聚体（分子量为104,000）用1摩尔染料染色。在高DOL及使用相对非极性的染料（通常为长波长荧光染料）的情况下，优选地用PEG官能化葡萄糖结合蛋白。优选的聚乙二醇化程度为0.1—5，优选的分子量为200—10,000，特别优选地为800—8000，更优选地为800—5000。
在本发明所基于的实验的背景下，确定了可以有利地使用经化学修饰的葡萄糖结合蛋白（与未经修饰的形式相比，经化学修饰的葡萄糖结合蛋白介导了增加的水溶性），以实现在葡萄糖结合蛋白上更好的标记程度。与未经修饰的形式相比，根据本发明的经修饰的葡萄糖结合蛋白实现了用染料更高程度地标记。对于此类经修饰的伴刀豆球蛋白A，可实现优选地大于0.5mg/(g基质)，并且特别优选地2—60mg/(g基质)的浓度。令人惊奇地，本文经修饰的伴刀豆球蛋白A的可测量的葡萄糖活性也与水凝胶中天然的伴刀豆球蛋白A的可测量的葡萄糖活性相当。
当用染料标记葡萄糖结合蛋白时，改进的溶解度是显著相关的，例如，用上述嗪染料之一修饰的伴刀豆球蛋白A，在水性溶液中仍具有进一步降低的溶解度。本文，标记程度越高，在水性溶液中的溶解度就越低。然而，在根据本发明的装置中，将葡萄糖结合蛋白用作传感器组分需要较高的标记程度。
术语“葡萄糖结合蛋白配体”是指能与葡萄糖结合蛋白特异地结合的分子。在此过程中，所述分子相互作用的结合位点与葡萄糖的结合位点基本相同，以便葡萄糖可以从葡萄糖结合蛋白上的结合位点替换结合分子。因此，合适的分子与葡萄糖在结构上相关。葡萄糖结合蛋白的配体优选地为低聚糖、糖基化大分子例如糖基化的蛋白质或肽、或者糖基化的纳米颗粒。现有技术中已知并且本领域技术人员可以容易地制备用作葡萄糖结合蛋白配体的上述分子。特别优选地，将葡聚糖用作葡萄糖结合蛋白的配体。
优选地，在本发明的装置中，将葡萄糖结合蛋白的配体与罗丹明染料偶联。特别优选地，在本发明中可以使用ATTO590、ATTO610、ROX、TMR、罗丹明G6、Alexa Fluor罗丹明染料或Dy590，相当优选地可以使用ATTO590。
用于葡萄糖结合蛋白的配体，例如葡聚糖的优选的标记程度(DOL)为0.00003至0.016（mol染料）/（mol亚基），特别优选地为0.00032至0.0065（mol染料）/（mol亚基），相当优选地为0.0008至0.0035（mol染料）/（mol亚基）。配体的标记程度也影响葡萄糖的活性。过低的标记程度导致弱的葡萄糖活性，过高的标记程度也是如此。
从前述已知在根据本发明的装置的优选的实施方案中，葡萄糖结合蛋白为伴刀豆球蛋白A。本文伴刀豆球蛋白A浓度特别优选地大于0.5mg/(g基质)，且相当优选地在2至60mg/(g基质)之间。同样，与未经修饰的伴刀豆球蛋白A相比，通过化学修饰，优选地聚乙二醇化、乙酰化、聚
Figure BDA00003523287800085
唑啉化或琥珀酰化，伴刀豆球蛋白A显示出增加的水溶性。在优选的实施方案中，将葡萄糖结合蛋白连接至
Figure BDA00003523287800081
嗪染料，并且将葡萄糖结合蛋白的配体连接至罗丹明染料。相当优选地，在装置中使用伴刀豆球蛋白A/葡聚糖系统，其中将葡聚糖连接至罗丹明供体染料，并且将伴刀豆球蛋白A连接至嗪受体染料。在优选的伴刀豆球蛋白A/葡聚糖系统中，组分优选地以1:1—1:40的质量比（葡聚糖/Con A）存在，接近1:10的质量比是特别优选的。
在本发明的背景下，确定嗪和罗丹明染料的组合引起了染料残基之间的异源二聚体的相互作用，其增强了葡萄糖的活性。因此通过使用嗪受体染料和罗丹明供体染料，在水性溶液中优选地可以实现2.1倍的葡萄糖活性。在本发明的背景下使用的水凝胶中甚至可以使葡萄糖活性增加2.6倍。
在本发明的背景下，有利地确定使用由第一水凝胶基质和第二水凝胶基质组成的水凝胶能够为传感器组分（即葡萄糖结合蛋白和葡萄糖结合蛋白的竞争性配体）产生允许有效地测定葡萄糖活性的环境，所述第一水凝胶基质由藻酸盐制成，所述第二水凝胶基质在所述第一水凝胶基质内形成互穿网络。通过荧光测量溶液中的葡萄糖的许多方法是成功的，但当传感器组分嵌入到水凝胶基质时，由于限制了传感器组分的流动性，所以葡萄糖失去了活性(Rounds2007,J.Fluoresc.17:57-63;US2007/0105176A1)。然而，令人惊奇地，特别是基于Birch等人(Birch2001,loc cit.)的计算，与水性溶液相比，在本发明的情况下可以检测到的活性增加了多达2.6倍。通过选择合适的水凝胶基质，可以实现远高于在水性溶液中的葡萄糖结合蛋白的极限溶解度的葡萄糖结合蛋白的富集。在本发明的背景下，在根据本发明使用的水凝胶基质中发现的提高的溶解度归功于水凝胶基质在与传感器组分，尤其是葡萄糖结合蛋白，如伴刀豆球蛋白A相互作用中的特殊性质。在伴刀豆球蛋白A的情况下，与在自由溶液中可实现的浓度相比，可以实现多于10倍的浓度的增加。通常，由于受体/竞争剂的复合体的大小并且通常也由于多价，受体/竞争剂的复合体显示出较低的溶解度，所以加入配体进一步不利地影响了自由溶液中受体组分的溶解度。例如，当溶液中的伴刀豆球蛋白A/葡聚糖复合体的质量比为1:10时，伴刀豆球蛋白A的浓度超过了0.5mg/（g溶液），因此所述伴刀豆球蛋白A/葡聚糖复合体已经开始沉淀；在具有相同质量比的合适的水凝胶中，可以制备超过50mg/（g基质）的浓度的伴刀豆球蛋白A。因此，可用的浓度范围可以扩大100倍。这对于其中分析物的浓度是固定的并且不能通过稀释或浓缩进行调整的应用是特别重要的。准确来说，这样的困难出现在体内应用，如测定体液中葡萄糖的水平中。在体内的情况下，分析物葡萄糖的浓度不能被调整到特定测定条件，而必须视为是给定的。
特别是在生物传感器的体内应用中，出现了其他的溶解度问题。由于较长的波长，组织的内荧光下降，以致在体内应用中使用长波长荧光染料。然而，由于荧光染料的分子结构和大小（共轭系统），这些荧光染料通常是无极性的。如果用此类染料标记葡萄糖结合蛋白，溶解度会进一步降低，以致不可能有高的标记程度。因此，如上文已经描述的，必须用例如聚乙二醇官能化葡萄糖结合蛋白，以便能够获得增加的溶解度和与之相关的较高的标记程度。然而，通常用聚乙二醇进行的官能化（即聚乙二醇化）导致例如天然伴刀豆球蛋白A的显著降低的葡萄糖活性（相对的葡萄糖活性为0.4或更低）。令人惊奇地，在本发明的背景下确定：在根据本发明装置的水凝胶中不发生这种活性降低的情况。相反，用聚乙二醇官能化的伴刀豆球蛋白A可以实现的葡萄糖活性与天然的伴刀豆球蛋白A可以实现的葡萄糖活性（相对的葡萄糖活性为2.2或2.6）相当。此外，发现通过增加在本发明的装置中使用的水凝胶中的伴刀豆球蛋白A的标记程度，仍然可以进一步提高葡萄糖活性。因此，令人惊奇地，在富集的水凝胶中，通过提高用聚乙二醇官能化的伴刀豆球蛋白A的标记程度，甚至可以实现两倍的葡萄糖活性。与在溶液中的测量结果相比，在根据本发明的装置的水凝胶中的葡萄糖活性甚至提高了4.3倍。因此，使用根据本发明装置中的水凝胶有可能制备用于葡萄糖结合蛋白及其配体的浓度比，与在水性溶液中制备的浓度相比，具有等同的标记程度的所述葡萄糖结合蛋白允许葡萄糖的活性增加4倍。有利地，这也使得能够在这样的条件下使用根据本发明的装置，在所述条件下分析物的浓度不能适应测定条件，所述条件例如体内应用。
为了在体内条件下，例如在糖尿病患者中测定葡萄糖的浓度，必须解决使分析物的浓度达到50至500mg/dl的问题。使用根据本发明的装置可以容易地解决这样的问题。在这方面，可将所述装置用作离体和体内传感器。在体内应用下，例如可以将传感器装置放置于皮下、眼中，例如结膜下、或机体中能够评估所测量的葡萄糖的活性的其他位点。
因此，本发明也涉及根据本发明的装置的用途，如上所述该装置用于测定样品中葡萄糖的含量。
在本发明的上下文中，应将术语“样品”理解为指的是推测或实际含有葡萄糖的组合物，优选地含水组合物。样品优选地是生物样品。相当优选地，样品是体液，特别是组织液、血液、血浆、血清、淋巴液、唾液、泪液、汗液或尿。特别优选地，样品为组织液、血液、血清或血浆。
假如样品是生物材料，如体液，它可以优选地从实际或推测具有受损的葡萄糖代谢的测试受试者获得。因此，根据本发明的装置能够用于疾病或者葡萄糖代谢的损伤的离体诊断，尤其用于糖尿病或代谢综合征的离体诊断。此外，根据本发明的装置不仅可用于诊断，而且可用于监测葡萄糖水平。因此，该装置还能够支持治疗决策，例如确定胰岛素的剂量，其施用必须反应改变的葡萄糖水平。
对于离体应用，例如，可将根据本发明的装置引入到微量滴定板并锚定在其上。然后将用于测定的样品应用到微量滴定板的孔中，并用读数装置测定。这样的方法能够同时测定大量的样品，因此特别在临床诊断实践中，也是经济的。
在体外应用的背景下，本发明也涉及用于测定实际或推测含有葡萄糖的样品中的葡萄糖的量的方法，其包括步骤：
（a）在能够使样品中含有的葡萄糖结合来自装置的葡萄糖结合蛋白的条件下，将根据本发明的装置与样品接触一段时间，和
（b）测定由装置中的葡萄糖替换的配体的量，借此确定葡萄糖的量。
上文描述的根据本发明的方法仍可以包括其他的步骤。例如，其他的步骤可以涉及样品的处理，例如从全血获得血清。可进行其他的步骤，以将测定的葡萄糖含量与葡萄糖代谢中的病理变化相关。为此，可将测定的含量与指示某些病理状态，例如糖尿病或代谢综合征的参照量比较。然后也可以将此类方法用于糖尿病或代谢综合征的体外诊断。例如通过计算机实施和/或机器人系统可以自动地进行根据本发明的方法或其各个步骤。
在说明书的其他部分详细地描述了可用上述方法分析的合适的样品。
术语“量”涉及绝对量和相对量的测定。优选地可以通过校准曲线实现绝对量的测定，所述校准曲线由使用根据本发明的方法对已知的葡萄糖含量测量获得的值产生。在本发明的意义上的相对量是指与标准化参数相关的值。不言而喻，在根据本发明的方法的背景下，也可以确定参数，其可以通过数学运算从确定的量值得出。
在根据本发明的方法的背景下，接触应当能够使样品和包含在样品中的葡萄糖渗透到装置中。另外，接触应当能够使葡萄糖与嵌入到装置中的葡萄糖结合蛋白上的配体竞争。
在根据本发明的方法中，优选地通过测定荧光强度的增加实现配体替换的测定，所述荧光由本文其他地方描述的供体染料发射。因为在与葡萄糖结合蛋白形成的复合体中供体染料的荧光强度降低，所以荧光强度的增加是在从葡萄糖结合蛋白替换配体之前导致的。然而，不言而喻，也可以使用用于测定配体释放的其他技术。
然而，除了上述的根据本发明的装置的离体应用和离体方法外，本发明还涉及根据本发明上述装置的用途，所述装置用于诊断测试受试者中的受损的葡萄糖代谢。本文优选地，受损的葡萄糖代谢是由糖尿病或代谢综合征引起的。
在根据本发明的装置的体内应用中，将所述装置引入到机体中。应当注意到，葡萄糖水平（当然也作为诊断基础）的测量要求装置接触含葡萄糖的体液，其中液体中葡萄糖的浓度代表待测定的葡萄糖水平。在本说明书的其他部分列举了合适的体液。特别优选地，体液是组织液。然后引入到机体内的装置产生了可以评估以用于诊断的信号。
将根据本发明的装置优选地引入到机体中的允许光学测量由该装置产生的信号的位置。这样的位置是合适的，所述位置在装置和体表之间具有低的组织厚度或者具有所产生的信号可以有效地渗透的透明组织。特别优选地，该装置位于皮肤（皮下）下或眼中，如结膜下。现有技术中已知用于植入该装置的合适的方法。
备选地，通过合适的转移介质，可以将根据本发明的装置产生的信号转移到体外。为此，信号传导材料优选地可以使用软电缆，例如玻璃纤维电缆。然而，以无线的方式，例如以红外线、无线电或无线信号也可以实现信号的转移。不言而喻，在这种情况下，根据本发明装置产生的信号必须首先由监测器读出并且被转化成电磁信号，例如无线信号，所述检测器必须安置于所述装置中或者至少在空间接近所述装置。然后，通过位于机体外的接收器可以接收这种电磁信号并且对其评估。
此外，如上所述，本发明涉及根据本发明的装置的用途，所述装置用于在具有受损的葡萄糖代谢的测试受试者中确定治疗措施的需要。
适当的治疗措施，包括用于治疗糖尿病或代谢综合征的那些措施。与药物，例如胰岛素的施用一样，这还包括其他相关治疗措施的实施，所述治疗措施可以是基于测定的受损的葡萄糖代谢而做出的决策，如治疗性干预（例如胃旁路手术）或生活方式的改变（如实施特殊饮食）。
在所述装置的前述应用的背景下，还可以将所述装置偶联其他的装置，如控制药物递送的装置。本文，可以将本发明的装置优选地与用于递送胰岛素的装置偶联。然后，可以基于根据本发明的装置确定的需要控制胰岛素的递送。其中，例如通过递送装置中的数据处理单元，将用根据本发明的装置测定的样品中葡萄糖水平的变化，转变为指定需要递送的胰岛素的指令。然后，只要需要或以需要的量，该指令介导将胰岛素递送到血液中的过程。
因此，根据本发明的上述的装置的根据本发明的应用，允许有效地进行血糖水平的离体和体内诊断，因此允许较早识别与受损的葡萄糖代谢相关的疾病，并且也允许在临床监测的背景下通过所述装置的应用来管理这些疾病。就此而言，该装置也适合基于测定的诊断结果，来进行治疗决策。
通过以下实施例来阐述本发明，然而，所述实施例并不限制保护范围。
实施例
实施例1：用于测定葡萄糖的传感器的制备
水凝胶颗粒（富集基质）的制备
在搅拌的情况下，将1g海藻酸钠溶解于100g水中。在5L烧杯中，将66.2g的CaCl2×2H2O溶解于4931.3g水中。
通过泵将藻酸盐溶液送入双喷嘴中。同时，将压缩空气连接到喷嘴的第二入口，以便将藻酸盐溶液雾化成细滴。将液滴通过空气流运送到含有氯化钙溶液的槽中，在此液滴形成凝胶并沉到底部。然后收集凝胶珠。
在富集基质中制备传感器：
为了装载，将藻酸盐珠连续地培养于用染料标记的伴刀豆球蛋白A溶液中和用染料标记的葡聚糖溶液中。然后，将装载的小珠离心，去除上清液。然后，任选地将装载的小珠过夜培养于第二聚合物的溶液（例如PVA或基于PEG的溶液）并且任选地通过离心分离。然后，将装载的小珠混合到光化学交联聚合物的水性溶液中。然后，用紫外光交联这种混合物，以防止传感器组分从藻酸盐珠浸出。
用于此的数量取决于待测量的分析物的浓度，而选择的标记程度取决于所希望的荧光信号强度。可以将用丙烯酰胺基团修饰的聚乙烯醇用作光化学交联聚合物，例如Nelfilcon聚合物。对于光化学交联，还添加了0.1%的Irgacure2959。将成品溶液分配到合适的模具中并用紫外光固化。
在非富集基质中制备传感器：
将用染料标记的伴刀豆球蛋白A溶液和用染料标记的葡聚糖溶液连续地进料至基于水的预聚混合物中，并搅拌3小时。用于此的数量取决于待测量的分析物的浓度，而选择的标记程度取决于所希望的荧光信号强度。可以将用丙烯酰胺基团修饰的聚乙烯醇用作光化学交联聚合物，例如Nelfilcon聚合物。对于光化学交联，还添加了0.1%的Irgacure2959。将成品溶液分配到合适的模具中并用紫外光固化。
实施例2：用于传感器的葡萄糖活性的测定
传感器中葡萄糖活性的测定：
在不同的葡萄糖浓度的情况下，测定了传感器的荧光光谱。将供体的荧光强度随增加的葡萄糖含量的改变用作葡萄糖传感器的性质的测量方法。因为使用体内葡萄糖传感器必须测量50至500mg/dL之间的葡萄糖浓度，所以葡萄糖活性(GA)的计算如下：
GA=(强度500mg/dL-强度50mg/dL)/强度50mg/dL。
为了更好地比较，将全部反应值对溶液中的相同系统的反应归一化。为了测定相对的葡萄糖活性，将传感器（在基质中）的葡萄糖活性除以溶液中的葡萄糖活性：
Rel GA=GA(基质)/GA(溶液)。
溶液中葡萄糖活性的测定：
在缓冲溶液中稀释ConA溶液和葡聚糖溶液，并搅拌数小时。在不同的葡萄糖浓度的情况下，测定溶液的荧光光谱。将供体的荧光强度随增加的葡萄糖含量的改变用作该系统性质的测量方法。因为使用体内葡萄糖传感器必须测量50至500mg/dL之间的葡萄糖浓度，所以葡萄糖活性(GA)的计算如下：
GA=(强度500mg/dL-强度50mg/dL)/强度50mg/dL。
实施例3：基质影响的测定
根据本发明，将葡萄糖结合蛋白和配体掺入到水凝胶基质中，所述水凝胶基质显示出与葡萄糖结合蛋白确定的相互作用。为此，选择水凝胶基质以便首先葡萄糖结合蛋白和水凝胶基质之间的相互作用大于葡萄糖结合蛋白和水性溶液之间的相互作用（富集传感器组分）。然而，另一方面，葡萄糖结合蛋白和水凝胶基质之间的相互作用必须不会影响或者不会明显地影响葡萄糖结合蛋白和分析物（葡萄糖）之间的相互作用。
在选择合适的水凝胶基质的情况下，通过葡萄糖结合蛋白和水凝胶基质之间相互作用，实现了葡萄糖结合蛋白在基质中的富集远高于葡萄糖结合蛋白在水性溶液中的极限溶解度。在Con A的情况下，例如在基质中可以获得的浓度比在自由溶液中高多达10陪。加入配体（例如葡聚糖）后，由于葡萄糖结合蛋白-配体的复合体的大小并且通常也由于多价，所述复合体显示出较低的溶解度，所以溶解度问题变得更差。
当溶液中Con A-葡聚糖复合体的质量比为1:10时，Con A的浓度超过了0.5mg/g，所述复合体开始沉淀；而在合适的水凝胶基质中，以相同的质量比，可以制备超过50mg/g的Con A的浓度。通过水凝胶基质，葡萄糖结合蛋白（例如Con A）的可用浓度范围可以扩大100倍。
因为在体内应用中，分析物的浓度范围是固定的并且不能例如通过稀释或者浓缩来调整，所以葡萄糖结合蛋白和配体的浓度必须适应分析物的体内浓度范围。然而，通常困难在于，由此所需要的葡萄糖结合蛋白的浓度和/或配体的浓度超过了极限溶解度。
例如，在Con A-葡聚糖系统的情况下，在溶液中以1:10的质量比（葡聚糖：Con A）仅可以建立0.5mg/g的Con A浓度，因为超过这个浓度，Con A-葡聚糖复合体开始沉淀。本文，为了测定相对的葡萄糖活性(relGA)，设定达到这种浓度的葡萄糖活性(GA)等于1。正如所预期的，在非富集的基质中，由于传感器组分的较低的流动性，葡萄糖活性降低至一半（rel GA=0.52）。而在富集基质中，使用相同的浓度，在溶液中获得了几乎相同的反应（rel GA=0.83）。然而，也可以在富集基质中制备明显更高的Con A浓度。在富集的水凝胶基质中，获得了10mg/g的Con A浓度，葡萄糖活性增加了2.6倍（参见表1）。
表一：基质的影响
Figure BDA00003523287800161
天然Con A的DOL=1，每mol葡聚糖亚单位（SU）用0.001mol染料(D)染色，葡聚糖和Con A的质量比=1:10。
实施例4：受体浓度影响的测定
在富集基质中，明确地可见葡萄糖活性对葡萄糖结合蛋白和配体的起始浓度的依赖性。随着浓度的增加，也获得了葡萄糖活性的提高。当受体浓度非常高时，葡萄糖活性也会下降。用于体内测定的最佳的Con A浓度位于8-20mgCon A/g基质之间（见表2）。
表2：受体浓度的影响
Figure BDA00003523287800162
天然Con A的DOL=1，每mol葡聚糖亚单位（SU）用0.001mol染料（D）染色；葡聚糖和Con A的质量比=1:10。
实施例5：受体标记程度影响的测定
由于在较长的波长下，组织的内荧光降低，因此，在体内应用中必须使用长波长荧光染料。由于较大的共轭体系，这些荧光染料通常完全是非极性的。如果用此类染料标记葡萄糖结合蛋白，那么它的溶解度降低，以致由于沉淀，高的标记程度通常是不可能的。为了增加葡萄糖结合蛋白的溶解度，有利的是例如用聚乙二醇官能化所述葡萄糖结合蛋白。由于在合成中较高的标记程度是有可能的，所以增加了葡萄糖结合蛋白的溶解度。
然而，在溶液中，聚乙二醇化的Con A导致的葡萄糖活性少于天然Con A的葡萄糖活性的一半（rel GA=0.4）。令人惊奇地，在水凝胶基质中不发生这种活性降低的情况。使用PEG-Con A，获得了与天然的Con A的葡萄糖活性相当的葡萄糖活性（rel GA=2.2比2.6）（见表3）。
表3：标记程度（DOL）的影响
Figure BDA00003523287800171
通过聚乙二醇化，首次可能实现以长波长的荧光染料高程度地标记Con A，所述荧光染料在溶液中是长期稳定的且不沉淀。令人惊奇地，与在溶液中相比，在富集基质中未观察到由于聚乙二醇化而导致的葡萄糖活性的降低。因此，仅通过基质的积极作用，在测定中有可能使用高浓度的具有高标记程度的PEG-Con A。
令人惊奇地，通过增加Con A的标记程度，可以进一步增强葡萄糖的活性。在具有的Con A（DOL=2.5）的富集的水凝胶基质中，实现了几乎两倍的葡萄糖活性(rel GA=4.3对2.6)。与溶液中的测量结果直接比较，通过浓度和DOL的组合效应，在基质中的葡萄糖活性甚至增加了4.3倍（见表4）。
表4：标记程度（DOL）的影响
*DOL＞1.5的天然ATTO680-Con A在溶液中不稳定并沉淀。
实施例6：荧光染料影响的测定
与葡萄糖结合蛋白和配体分别结合的荧光染料的结构也影响葡萄糖的活性。已经证实了罗丹明和嗪染料的组合是特别适合的。对于Con A-葡聚糖系统，罗丹明供体（例如ATTO590-葡聚糖或ATTO610-葡聚糖或ROX-葡聚糖）和
Figure BDA00003523287800184
嗪受体（ATTO655-Con A 或ATTO680-Con A或Evoblue30-Con A）是特别优选的。因此，与常规使用的TMR-Con A/FITC-葡聚糖系统(氧杂蒽-罗丹明组合)相比，在溶液中获得了2.1倍的葡萄糖活性，在富集基质中获得了甚至2.6倍的葡萄糖活性。使用罗丹明-
Figure BDA00003523287800185
嗪染料对，在染料之间可以发生异源二聚体相互作用，该作用增强了葡萄糖的活性（见表5和6）。
表5：染料的影响
Figure BDA00003523287800182
Figure BDA00003523287800191
基于用PEG-Con A得到的试验值而推算的相应值：FITC-葡聚糖为0.01mol D/mol UE，葡聚糖和Con A的质量比=1:10。
表6：染料的影响
Figure BDA00003523287800192
天然Con A的DOL=1；每mol葡聚糖亚单位(SU)用0.001mol染料（D）染色；葡聚糖和Con A的质量比=1:10。
实施例7：水凝胶基质性质的影响的测定
葡萄糖的活性也取决于水凝胶基质的性质。水凝胶基质可以由一个聚合物或几个聚合物的混合物组成。已经证实由藻酸盐，或者由藻酸盐和聚乙烯醇水凝胶的混合物制成的水凝胶基质是有利的。通过藻酸盐水凝胶与Con A以及葡聚糖的相互作用，藻酸盐水凝胶能够高浓度地富集传感器组分。
第二水凝胶的预聚物（例如PVA）可以渗透到藻酸盐珠中，并且在交联后与藻酸盐形成互穿网络。互穿网络的网孔宽度影响葡萄糖结合蛋白分子和配体分子的流动性，因此也影响葡萄糖的活性。聚合物的性质、分子量、固体含量和交联剂基团（决定连接的数目）的含量可以影响互穿网络的网孔宽度。
较低的交联剂基团的含量导致较高的葡萄糖的活性。通过使交联剂基团的含量减半，甚至可以使活性增加1.5倍。因此，与溶液中的系统相比，在没有增加Con A上的标记程度的情况下，也可以实现葡萄糖的活性的4.2倍的提高（见表7）。
表7：交联剂含量的影响
交联剂含量(mmol/g) 0.486 0.33 0.26
Rel GA 2.76 4.04 4.24
天然Con A(13mg/g)的DOL=1；每mol葡聚糖亚单位用0.001mol染料（D）染色；葡聚糖和Con A的质量比=1:10。
网络中的固体含量也影响葡萄糖的活性。固体含量越高，葡萄糖的活性越低（见表8）。
表8：固体含量的影响
SC预聚物含量 25% 30% 35% 40%
Rel GA 2.87 2.76 2.48 1.96
天然Con A(13mg/g)的DOL=1；每mol葡聚糖亚单位用0.001mol染料（D）染色；葡聚糖和Con A的质量比=1:10。

Claims (17)

1.包含水凝胶的装置，所述水凝胶具有掺入其中的葡萄糖结合蛋白和葡萄糖结合蛋白的配体，其中所述水凝胶包含由藻酸盐制成的第一水凝胶基质和在所述第一水凝胶基质内形成互穿网络的第二水凝胶基质。
2.如权利要求1中要求保护的装置，其中所述第二水凝胶基质由水溶性聚合物组成，所述水溶性聚合物的每个分子具有至少一个可交联基团，并且所述水溶性聚合物具有最多500,000的分子量。
3.如权利要求1或2要求保护的装置，其中所述第二水凝胶基质选自：聚乙烯醇（PVA；包括与乙酸乙烯酯和/或乙烯的共聚物）、聚乙二醇（PEG）和聚羟基链烷酸酯（PHA）、聚（2-甲基-2
Figure FDA00003523287700011
唑啉）、聚（2-乙基-2
Figure FDA00003523287700012
唑啉）、聚（2-羟乙基-2
Figure FDA00003523287700013
唑啉）、聚（2-（1-（羟甲基）-乙基）-2
Figure FDA00003523287700014
唑啉）、聚甲基丙烯酸羟乙酯（PHEMA）、聚丙烯酸羟乙酯（PHEA）、聚乙烯吡咯烷酮、聚（二甲基）丙烯酰胺、聚（羟乙基）丙烯酰胺、聚(乙烯-共聚-乙烯醇)、聚（乙酸乙烯酯-共聚-乙烯醇）、聚(乙烯-共聚-乙酸乙烯酯-共聚-乙烯醇)以及聚（乙二醇-共聚－丙二醇）。
4.如权利要求1至3之一中要求保护的装置，其中所述第一水凝胶基质和/或第二水凝胶基质能与葡萄糖结合蛋白相互作用。
5.如权利要求1至4之一中要求保护的装置，其中所述葡萄糖结合蛋白选自凝集素、将葡萄糖作为底物结合的酶、特异地识别葡萄糖的抗体和特异地识别葡萄糖的适配体。
6.如权利要求1至5之一中要求保护的装置，其中所述葡萄糖结合蛋白的配体为低聚糖，糖基化的大分子或者糖基化的纳米颗粒。
7.如权利要求1至6之一中要求保护的装置，其中所述葡萄糖结合蛋白为伴刀豆球蛋白A。
8.如权利要求7中要求保护的装置，其中所述伴刀豆球蛋白A的浓度大于0.5mg/（g基质）。
9.如权利要求8中要求保护的装置，其中所述伴刀豆球蛋白A的浓度位于2至60mg/（g基质）之间。
10.如权利要求7至9之一中要求保护的装置，其中与未经修饰的伴刀豆球蛋白A相比，由于化学修饰，所述伴刀豆球蛋白A显示出增加的水溶性。
11.如权利要求10中要求保护的装置，其中所述修饰选自：聚乙二醇化、乙酰化、琥珀酰化和聚
Figure FDA00003523287700021
唑啉化。
12.如权利要求1至11之一中要求保护的装置，其中所述葡萄糖结合蛋白被连接至
Figure FDA00003523287700022
嗪染料并且所述葡萄糖结合蛋白的配体被连接至罗丹明染料。
13.如权利要求1至12之一中要求保护的装置的用途，所述装置用于测定样品中的葡萄糖的含量。
14.如权利要求13中要求保护的用途，其中所述样品已经从显示出受损的葡萄糖代谢的测试受试者或者推测显示出受损的葡萄糖代谢的受试者获得。
15.如权利要求1至12之一中要求保护的装置，其用于诊断测试受试者中的受损的葡萄糖代谢。
16.如权利要求13或14中要求保护的用途或如权利要求15中要求保护的装置，其中所述受损的葡萄糖代谢由糖尿病或代谢综合征引起。
17.如权利要求1至12之一中要求保护的装置，其用于在具有受损的葡萄糖代谢的受试者中确定治疗措施的需要。
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