CN103370623B - 水凝胶在具有提高的灵敏度的生物传感器中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于测定葡萄糖及用于诊断基于受损的葡萄糖代谢的疾病的测量。具体而言，本发明涉及包含至少一种水溶性聚合物的聚合物基水凝胶在传感器中的用途，用于浓缩溶解的葡萄糖结合蛋白，其中该至少一种水溶性聚合物能够与该葡萄糖结合蛋白相互作用，且其中该葡萄糖结合蛋白存在于与配体的复合体中。

Description

水凝胶在具有提高的灵敏度的生物传感器中的用途
本发明涉及包含至少一种水溶性聚合物的聚合物基水凝胶在传感器中的用途，用于浓缩(enrich)溶解的葡萄糖结合蛋白，其中该至少一种水溶性聚合物能够与该葡萄糖结合蛋白相互作用，且其中该葡萄糖结合蛋白存在于与配体的复合体中。
通过有效和可靠的测量技术来测定葡萄糖的浓度在许多技术领域中具有重要意义。不仅在纯实验室分析中，还在食品产业中，例如在酒学领域中及在医学领域中，例如在由受损的葡萄糖代谢引起的疾病(例如糖尿病或代谢综合症)的诊断中，给定溶液中葡萄糖浓度的快速和可靠的测定具有重要意义。在基于受损的葡萄糖代谢的疾病的诊断领域中，葡萄糖传感器用于可植入身体且可以测量体内采集的样品中的葡萄糖含量的装置中，以及用于从测试个体的样品离体测量葡萄糖含量的传感器中。
为了测定溶液中的葡萄糖含量，已描述了由传感分子和配体制成的系统，其中该传感器是葡萄糖结合蛋白，该配体是葡萄糖的竞争剂，其最初与葡萄糖传感分子结合存在于传感器中。通过在测量过程中与葡萄糖竞争，从葡萄糖结合蛋白取代竞争剂。此过程中的葡萄糖从葡萄糖结合蛋白取代竞争剂可以利用分子的物理性质或化学性质的变化，例如利用荧光共振能量转移(FRET)来检测。前述系统当然必须存在于该传感器的在空间上划分的区域。
为了将系统成分(即葡萄糖结合蛋白和配体)封装在水性介质中，使用半透膜。这类膜可以例如由再生纤维素、聚乙二醇、聚氨基甲酸酯、逐层(LBL)层(layer-by-layer(LBL)layers)、聚醚砜、聚对亚苯基二甲基层或多孔硅石(例如US2007/0122829)。备选地，还可以使用水凝胶，但通常也通过附加的膜来封装它(见例如US6,485,703；US2007/0105176)。
但是，现有技术中描述的葡萄糖传感器显示相对低的葡萄糖活性。葡萄糖活性及因此还有传感器性能主要由葡萄糖结合蛋白和竞争剂及葡萄糖结合蛋白和葡萄糖的复合体的结合常数决定。此外，传感器成分的移动性也发挥作用。在水凝胶基质中，这非常受限(Rounds2007，J.Fluoresc.17：57-63)。
对于用于测量葡萄糖的体内传感器，传感器必须不断地对分析物浓度的变化可逆地作出反应。因此，结合常数必须不太高，因为否者传感器将在低分析物浓度下就已经饱和，将不再能够显示浓度变化。此外，体内传感器的另一问题在于，分析物浓度范围是固定的，且不能通过稀释或浓缩来优化。基本上，在现有技术中，描述了包含配体和葡萄糖结合蛋白的系统，其具有中等结合常数。通过改变葡萄糖结合蛋白或配体或二者的浓度(例如通过浓缩)来改变测量灵敏度通常受限于各分子的低溶解度。因此，在前述现有技术中描述的传感器中，传感器的测量灵敏度以及测量精确度都受限。
本发明的目的是提供使得可能改善用于测量葡萄糖水平的生物传感器的测量灵敏度和精确度的测量。本发明通过权利要求描述的实施方案及下文公开的实施方案来解决。
因此，本发明还涉及包含至少一种水溶性聚合物的聚合物基水凝胶在传感器中的用途，用于浓缩溶解的葡萄糖结合蛋白，其中该至少一种水溶性聚合物能够与该葡萄糖结合蛋白相互作用，且其中该葡萄糖结合蛋白存在于与配体的复合体中。
术语“水凝胶”描述含水聚合物，其分子在化学上或物理上连接入三维网络。聚合物分子可以通过共价键或离子键或通过缠结或交织一起连接入三维网络。形成水凝胶的聚合物优选包含使得能够吸收水溶液的亲水性聚合物成分和能够与葡萄糖结合蛋白相互作用的基团。尤其是对于凝集素，如伴刀豆球蛋白A，除单糖(例如葡萄糖)的结合部位外，还已描述了末端糖分子的其他结合部位(Moothoo1999，Glycobiology9(6)：539-545；Bryce2001，BiophysicalJournal81：1373-1388；Moothoo1998，Glycobiology8(2)：173-181；Delatorre2007，BMCStructuralBiology7：52)。糖或结构上类似的分子或水凝胶的聚合物分子中的残基优选能够与该其他结合部位相互作用。取决于葡萄糖结合蛋白的性质，根据本发明，选择具有能够与葡糖糖结合蛋白相互作用的残基而不因此封闭葡萄糖的结合部位的聚合物。适合于此的残基还可以是抗体或抗体片段，如FabF(ab)2、scFV等，其与聚合物偶联，且其特异性识别葡萄糖结合蛋白。还可以以类似的方式用适体替代抗体，该适体特异性识别葡萄糖结合蛋白。
优选地，该至少一种聚合物选自：藻酸盐、琼脂糖、透明质酸、脱乙酰壳多糖、鹿角菜胶(caragenan)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙二醇(PEG)、聚(2-噁唑啉)、聚丙烯酰胺(例如二甲基丙烯酰胺)、聚羟基丙烯酸酯(例如聚羟基甲基丙烯酸酯、聚羟基丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮)、(2-甲基-3-乙基[2-羟乙基])聚合物、聚羟基链烷酸酯(PHA)、聚(2-甲基-2噁唑啉)、聚(2-乙基-2噁唑啉)、聚(2-羟乙基-2噁唑啉)、聚(2-(1-(羟甲基)-乙基)-2噁唑啉)、聚-(甲基丙烯酸羟乙酯)(PHEMA)、聚-(丙烯酸羟乙酯)(PHEA)、聚-乙烯吡咯烷酮、聚-(二甲基)丙烯酰胺、聚-(羟乙基)丙烯酰胺、聚乙烯醇(包括与乙烯基乙酸酯和/或乙烯的共聚物)、聚(乙烯-共-乙烯醇)、聚(乙烯基乙酸酯-共-乙烯醇)、聚(乙烯-共-乙烯基乙酸酯-共-乙烯醇)、聚乙二醇及聚(乙二醇-共-丙二醇)。
尤其优选地，该至少一种聚合物选自藻酸盐、琼脂糖、透明质酸、脱乙酰壳多糖和鹿角菜胶。极其优选地，该至少一种聚合物是藻酸盐。
不言而喻，传感器中的水凝胶还可以包含其他聚合物。具体而言，聚合物基水凝胶可以包含由藻酸盐制成的第一水凝胶基质及能够在第一水凝胶基质内形成互穿网络的第二水凝胶基质。此第二水凝胶基质优选包含每分子具有至少一个可交联基团且分子量至多为500,000的水溶性聚合物。尤其优选的是至多250,000、200,000、150,000、100,000或50,000的分子量。在此，该第二水凝胶基质的聚合物优选选自：聚乙烯醇(PVA)、聚乙二醇(PEG)、聚(2-噁唑啉)、聚丙烯酰胺(例如二甲基丙烯酰胺)、聚羟基丙烯酸酯(例如聚羟基甲基丙烯酸酯、聚羟基丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮)、(2-甲基-3-乙基[2-羟乙基])聚合物、聚羟基链烷酸酯(PHA)、聚(2-甲基-2噁唑啉)、聚(2-乙基-2噁唑啉)、聚(2-羟乙基-2噁唑啉)、聚(2-(1-(羟甲基)-乙基)-2噁唑啉)、聚-(甲基丙烯酸羟乙酯)(PHEMA)、聚-(丙烯酸羟乙酯)(PHEA)、聚乙烯吡咯烷酮、聚-(二甲基)丙烯酰胺、聚-(羟乙基)丙烯酰胺、聚乙烯醇(包括与乙烯基乙酸酯和/或乙烯的共聚物)、聚(乙烯-共-乙烯醇)、聚(乙烯基乙酸酯-共-乙烯醇)、聚(乙烯-共-乙烯基乙酸酯-共-乙烯醇)、聚乙二醇和聚(乙二醇-共-丙二醇)。
尤其优选地，该第二水凝胶基质由聚乙烯醇形成。尤其优选的是具有10,000至100,000、更优选10,000至50,000、更优选10,000至20,000、极其优选15,000的分子量的聚乙烯醇。尤其优选地，该聚乙烯醇具有至多0.5mmol/g、0.4mmol/g、0.35mmol/g或0.3mmol/g、极其优选0.35mmol/g的交联剂含量。此外，该聚乙烯醇尤其优选具有小于40wt％的预聚物固体含量。
除第一水凝胶基质和第二水凝胶基质外，本发明的水凝胶可以包含添加剂，例如稳定剂、乳化剂、抗氧化剂、UV稳定剂、去垢剂和/或UV引发剂。
此外，还可以通过其他(优选半透性)表面盖覆剂来封装按照本发明使用的水凝胶。利用此封装，防止了传感器成分从水凝胶“浸出”。可能的表面盖覆剂是半透膜或其他水凝胶基质。半透膜可以优选包含再生纤维素、聚乙二醇、聚氨基甲酸酯、逐层(LBL)层、聚醚砜、聚对亚苯基二甲基层或多孔硅石。但是，其他水凝胶基质也可能作为表面盖覆剂。优选地，这可以形成自选自以下的聚合物：藻酸盐、琼脂糖、透明质酸、脱乙酰壳多糖、鹿角菜胶、聚乙烯醇(PVA)、聚乙二醇(PEG)、聚(2-噁唑啉)、聚丙烯酰胺(例如二甲基丙烯酰胺)、聚羟基丙烯酸酯(例如聚羟基甲基丙烯酸酯、聚羟基丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮)、(2-甲基-3-乙基[2-羟乙基])聚合物、聚羟基链烷酸酯(PHA)、聚(2-甲基-2噁唑啉)、聚(2-乙基-2噁唑啉)、聚(2-羟乙基-2噁唑啉)、聚(2-(1-(羟甲基)-乙基)-2噁唑啉)、聚-(甲基丙烯酸羟乙酯)(PHEMA)、聚-(丙烯酸羟乙酯)(PHEA)、聚-乙烯吡咯烷酮、聚-(二甲基)丙烯酰胺、聚-(羟乙基)丙烯酰胺、聚乙烯醇(包括与乙烯基乙酸酯和/或乙烯的共聚物)、聚(乙烯-共-乙烯醇)、聚(乙烯基乙酸酯-共-乙烯醇)、聚(乙烯-共-乙烯基乙酸酯-共-乙烯醇)、聚乙二醇和聚(乙二醇-共-丙二醇)。
在本发明的背景中，术语“葡萄糖结合蛋白”涉及能够与葡萄糖特异性相互作用的蛋白质。本领域技术人员可以通过现有技术中已知的结合测试来容易地测定蛋白质是否能够与葡萄糖特异性相互作用。优选地，葡萄糖结合蛋白还能够与水凝胶的聚合物相互作用。优选地，此相互作用不是由葡萄糖结合蛋白的葡萄糖结合部位介导。尤其优选地，葡萄糖结合蛋白选自凝集素、结合葡萄糖作为底物的酶及特异性识别葡萄糖的抗体。该术语还包括可以特异性识别葡萄糖的替代分子，优选特异性识别葡萄糖的适体。极其优选地，该葡萄糖结合蛋白是伴刀豆球蛋白A。
编码前述葡萄糖结合蛋白的核酸序列和氨基酸序列为现有技术中已知(Yamauchi1990，FEBSLetters260(1)：127-130)。因此，本领域技术人员可以容易地制备前述蛋白质。该蛋白质可以例如重组制备或从生物来源纯化。此外，该蛋白质还可以化学合成。此外，大多数前述蛋白质可商购。本领域技术人员可以通过现有技术中已知的用于抗体或适体获得的方法来容易地制备特异性识别葡萄糖的抗体或适体。
前述葡萄糖结合蛋白，尤其是伴刀豆球蛋白A还可以优选具有化学修饰，与葡萄糖结合蛋白的未修饰形式相比，该化学修饰介导提高的水溶性。这类修饰优选包括用水溶性聚合物功能化，且在尤其优选的实施方案中可以选自聚乙二醇化、乙酰化、聚噁唑啉化和琥珀酰化。
通过包含在样品中的葡萄糖取代结合于葡萄糖结合蛋白的配体(配体和葡萄糖之间的竞争)来在本发明的装置中实现用于分析的样品中的葡萄糖的检测。因此，该配体优选具有比葡萄糖低的对葡萄糖结合蛋白的亲和力。可以优选通过用染料或另一可检测的标记分子标记配体来检测该取代。已证明，靠近结合于它们的分子的染料或其他标记分子引起至少一种可测量的物理或化学性质的变化尤其适合用于检测取代。适宜的系统包括利用染料分子之间的能量转移来抑制或产生可测量的信号的那些。这类基于能量转移的系统例如更详细地描述于WO2001/13783中。这些可以优选是这样的系统，其中通过染料或标记分子(因此通过葡萄糖结合蛋白及其配体)在空间上接近时的猝灭效应来抑制荧光信号。分析物取代配体后，猝灭效应解除。可通过荧光的变化来检测此效应。对于检测，可以使用例如WO2002/087429中所述的荧光光度计。其他适宜的系统是基于所谓的荧光共振能量转移(FRET)的检测系统。在这些系统中，用荧光染料标记两个相互作用成分，如葡萄糖结合蛋白及其配体。一个成分与受体染料偶联，另一个成分与供体染料偶联。通过成分的相互作用，染料在空间上接近，由此产生FRET效应。在此，激发能量从供体染料转移至受体染料，因此供体染料的强度可测量地降低。成分的相互作用一被破坏，供体的荧光强度就再次提高。在本发明的装置的情况下，从而可以通过信号强度的提高来检测葡萄糖，该信号在分析物分开葡萄糖结合蛋白和配体的复合物后由染料或标记分子产生。染料或标记分子与葡萄糖结合蛋白或配体偶联。例如，供体染料可以与葡萄糖结合蛋白或配体偶联，而未与供体染料偶联的成分与适宜的受体染料偶联。在这样配置的本发明的装置中，可以在暴露于包含葡萄糖的样品之前观察到由配体与葡萄糖结合蛋白的结合产生的FRET效应。暴露后，葡萄糖取代配体，使得供体染料的可测量的荧光强度事实上与葡萄糖的量成比例地提高。
Birch等(Birch2001，SpectrochimicaActaPartA57：2245-2254)已针对伴刀豆球蛋白A作为葡萄糖结合蛋白和葡聚糖作为配体的情况计算了化学平衡的数学解决方案。不同伴刀豆球蛋白A和葡聚糖浓度的模拟已显示，(葡聚糖)/(伴刀豆球蛋白A-葡聚糖复合体)比值仅轻微依赖于起始浓度，结合常数KDex和KGluc是传感器性能的主要因素。
但是，令人惊奇地，染料的结构也影响葡萄糖活性。因此，根据本发明，罗丹明和噁嗪染料的组合显著优于常规使用的呫吨和罗丹明染料的组合(FITC-TMR)。
优选地，在本发明的用途的背景中使用的葡萄糖结合蛋白与噁嗪染料连接。可以如何实现这种连接为本领域技术人员公知，并充分描述于现有技术中。尤其优选地，该噁嗪染料是选自ATTO655、ATTO680、EVOblue10、EVOblue30、EVOblue90和EVOblue100的噁嗪受体。极其优选地，使用ATTO680。该噁嗪染料可商购。
葡萄糖结合蛋白(例如伴刀豆球蛋白A)的优选的标记程度(DOL)是0.1至4，更优选1至4，尤其优选1至3。对于伴刀豆球蛋白A，1的DOL在此对应于每摩尔伴刀豆球蛋白A四聚体(MW＝104,000)1摩尔染料。对于高DOL及相对非极性的染料(通常为长波长荧光染料)的使用，优选用PEG功能化葡萄糖结合蛋白。优选的聚乙二醇化程度是0.1至5，优选的分子量是200至10,000，更优选800至8000，还更优选800至5000。
在本发明所基于的实验的背景中，已确定，为了在葡萄糖结合蛋白上达到更好的标记程度，可以有利地使用与未修饰形式相比介导提高的水溶性的葡萄糖结合蛋白的化学修饰。对于本发明的修饰的葡萄糖结合蛋白，还可以达到比其未修饰形式高的染料标记程度。对于这类修饰的伴刀豆球蛋白A蛋白质，可以达到优选高于0.5mg/(g基质)，且极其优选2和60mg/(g基质)之间的浓度。令人惊奇地，此处测量的修饰的伴刀豆球蛋白A蛋白质的葡萄糖活性与水凝胶中的天然伴刀豆球蛋白A的葡萄糖活性也相当。
在此，溶解的葡萄糖结合蛋白可以按与水溶液相比提高了至少5倍、至少10倍、至少15倍或至少20倍的浓度存在于水凝胶中。
在要用染料标记葡萄糖结合蛋白时，提高的溶解度尤其相关，因为用染料标记的葡萄糖结合蛋白(例如用前述噁嗪染料之一修饰的伴刀豆球蛋白A)在水溶液中具有进一步降低的溶解度。在此，标记程度越高，在水溶液中的溶解度越低。但是，作为本发明的装置中的传感成分的葡萄糖结合蛋白所需要的恰恰是更高的标记程度。
术语“葡萄糖结合蛋白的配体”意指这样的分子，其能够与葡萄糖结合蛋白进入特异性结合，其间该分子基本上与葡萄糖相同的结合部位相互作用，使得葡萄糖可以从葡萄糖结合蛋白上的结合部位取代结合的分子。因此，适合作为配体的分子在结构上与葡萄糖相关。葡萄糖结合蛋白的配体优选是寡糖、糖基化大分子(例如糖基化蛋白质或肽)、或糖基化纳米颗粒。前述可以用作葡萄糖结合蛋白的配体的分子为现有技术中已知，且本领域技术人员可以容易地制备。尤其优选地，用葡聚糖作为葡萄糖结合蛋白的配体。
传感器中的葡萄糖结合蛋白的配体优选与罗丹明染料偶联。尤其优选地，ATTO590、ATTO610、ROX、TMR、罗丹明G6、AlexaFluor罗丹明染料或Dy590可以用于此，且极其优选使用ATTO590。
葡萄糖结合蛋白的配体(例如葡聚糖)的优选的标记程度(DOL)是0.00003至0.017(摩尔染料)/(摩尔亚基)，尤其优选0.0005至0.007(摩尔染料)/(摩尔亚基)，且极其优选0.001至0.0016(摩尔染料)/(摩尔亚基)。配体的标记程度也对葡萄糖活性具有影响。正如过高的标记程度，过低的标记程度导致差的葡萄糖活性。
在本发明的用途的优选实施方案中，该葡萄糖结合蛋白是伴刀豆球蛋白A。同样，通过化学修饰(优选聚乙二醇化、乙酰化、聚噁唑啉化或琥珀酰化)，伴刀豆球蛋白A与未修饰的伴刀豆球蛋白A相比显示提高的水溶性。在优选实施方案中，葡萄糖结合蛋白与噁嗪染料连接，而葡萄糖结合蛋白的配体与罗丹明染料连接。极其优选地，将伴刀豆球蛋白A/葡聚糖系统用于传感装置，其中葡聚糖与罗丹明供体染料连接，而伴刀豆球蛋白A与噁嗪受体染料连接。在优选的伴刀豆球蛋白A/葡聚糖系统中，成分优选以从1∶1至1∶40的质量比(葡聚糖/伴刀豆球蛋白A)存在，尤其优选以接近1∶10的质量比存在。
在本发明的背景中，已确定噁嗪和罗丹明染料的组合导致染料残基之间的异二聚体相互作用，其增强葡萄糖活性。因此，通过使用噁嗪受体染料和罗丹明供体染料，优选可以在水溶液中就已达到2.1倍的葡萄糖活性。在本发明的背景中使用的水凝胶中，甚至可以产生提高2.6倍的葡萄糖活性。
通过使用能够与葡萄糖结合蛋白相互作用的聚合物，可以在水凝胶中达到更高的葡萄糖结合蛋白和配体的浓度。尤其是对于具有给定的葡萄糖浓度的体内应用，这提高了传感器的测量灵敏度以及测量精确度。
在本发明的背景中，已有利地确定，包含第一水凝胶基质(由藻酸盐制成)和第二水凝胶基质(其在第一水凝胶基质中形成互穿网络)的水凝胶的使用能够为传感成分(即葡萄糖结合蛋白和葡萄糖结合蛋白的竞争性配体)创造允许有效测定葡萄糖活性的环境。许多利用荧光的葡萄糖测量方法在溶液中是成功的，但在将传感成分包埋入水凝胶基质中时丧失其活性，因为传感成分的移动性受限制(Rounds2007，J.Fluoresc.17：57-63；US2007/0105176A1)。但是，令人惊奇地，尤其是还考虑到Birch等(Birch2001，前引文)的计算，在这种情况下可以检测到与水溶液相比提高了至多2.6倍的活性。通过选择适宜的水凝胶基质，可以达到远高于其在水溶液中的溶解度极限的葡萄糖结合蛋白的浓缩。在伴刀豆球蛋白A的情况下，可以达到与在自由溶液中可达到的浓度相比例如提高了超过10倍的浓度。通常，受体成分在自由溶液中的溶解度进一步受配体的加入的不利影响，因为受体/竞争剂复合体由于其大小且通常还由于多价性而显示更低的溶解度。虽然例如溶液中质量比为1∶10的伴刀豆球蛋白A/葡聚糖复合体在超过0.5mg/(g溶液)的伴刀豆球蛋白浓度下已经开始沉淀，但在具有相同质量比的适宜的水凝胶中，可以制备超过50mg/(g基质)的伴刀豆球蛋白A浓度。因此，可用的浓度范围可以扩展100倍。这对分析物浓度固定且不能通过稀释或浓缩来调节的应用尤其重要。诸如测定体液中的葡萄糖水平的体内应用恰恰出现这类困难。在体内环境中，不能将分析物葡萄糖的浓度调节至具体的测定条件，而必须按既定条件测定。
尤其是在生物传感器的体内应用中出现另一溶解度问题。由于更高的波长，组织的固有荧光下降，使得将长波长荧光染料用于体内应用。但是，这些荧光染料由于其分子结构和大小(共轭系统)而通常为非极性。如果仅用这种染料标记葡萄糖结合蛋白，则溶解度进一步降低，使得高标记程度也不可能。如上文已述，因此有必要用例如聚乙二醇功能化葡萄糖结合蛋白，以使得能够提高溶解度及与之相关的更高的标记程度。但是，用聚乙二醇功能化(聚乙二醇化)通常导致例如天然伴刀豆球蛋白A的葡萄糖活性的显著降低(0.4或更低的相对葡萄糖活性)。令人惊奇地，在本发明的背景中，已确定传感装置的水凝胶中不出现这种恶化。相反，用聚乙二醇功能化的伴刀豆球蛋白A可以达到与天然伴刀豆球蛋白A的葡萄糖活性相当的葡萄糖活性(相对葡萄糖活性＝2.2或2.6)。此外，发现可以通过提高水凝胶(如用于本发明的装置中的水凝胶)中的伴刀豆球蛋白A上的标记程度来进一步提高葡萄糖活性。因此，令人惊奇地，在浓缩水凝胶中，通过提高用聚乙二醇功能化的伴刀豆球蛋白A上的标记程度，甚至可以达到葡萄糖活性的倍增。与溶液中的测量相比，传感装置中的按照本发明使用的水凝胶中的葡萄糖活性甚至提高4.3倍。因此，在本发明的装置中使用水凝胶使得可能制备具有等同标记程度的葡萄糖结合蛋白及其配体的浓度比，使得葡萄糖活性与在水溶液中可制备的浓度相比提高4倍。这还有利地使得能够在不能将分析物浓度调节至测定条件(如对于体内应用)的条件下使用本发明的装置。
在本发明的用途的背景中，传感器可以优选用于测定葡萄糖含量。
因此，可以测试样品。在本发明的背景中，术语“样品”应理解为意指组合物，优选水性组合物，其可能或实际上含有葡萄糖。该样品优选是生物样品。极其优选地，该样品是体液，尤其是组织液(间质液(interstitialfluid))、血液、血浆、血清、淋巴、唾液、泪液、汗液或尿液。尤其优选地，该样品是组织液、血液、血清或血浆。
如果样品是生物材料(例如体液)，则它可以优选获自实际上或可能患有受损的葡萄糖代谢的测试个体。此处优选地，该受损的葡萄糖代谢由糖尿病或代谢综合症引起。
因此，该传感器还可以在本发明的用途的背景中用于离体诊断疾病或葡萄糖代谢的受损。具体而言，该传感器可以用于诊断受损的葡萄糖代谢及与之相联系的疾病，如糖尿病或代谢综合症，或用于在患有受损的葡萄糖代谢的患者中测定对治疗措施的需要。
前述治疗措施包括用于治疗糖尿病或代谢综合症的那些。除施用药物(例如胰岛素)外，这还包括实施其他治疗措施，可以根据所测定的受损的葡萄糖代谢来就该其他治疗措施作出决定。这些包括治疗干预，例如胃旁路手术，或生活方式的改变，例如实施特殊饮食。该传感器可以与其他装置偶联，例如控制药物递送的装置。在此，优选控制胰岛素递送的装置。然后可以根据传感器测定的需要来控制胰岛素的递送。
对于离体用途，可以将来自本发明的用途的传感器例如引入微量滴定板，并锚定在其中。然后将用于测定的样品加入微量滴定板的孔中，然后可以用读板设备测定。这种方法使得能够同时测定大量样品，因此也经济，尤其是在临床诊断实践中。
备选地，可以将用于体内用途的传感器引入体内。此处应指出，葡萄糖水平的测量(其当然也是诊断的基础)需要装置与包含葡萄糖的体液接触，其中该体液中的葡萄糖浓度代表待测定的葡萄糖水平。适宜的体液在本说明书中的另一处列举。尤其优选地，该体液是组织液。
优选将传感器引入体内的允许光学测量装置所产生的信号的地方。在装置和体表之间具有小的组织厚度或具有所产生的信号可以有效穿透的透明组织的地方是适宜的。尤其优选地，将装置放置在皮肤下(皮下)或眼内，例如结膜下。用于植入装置的适当的方法为现有技术中已知。
备选地，还可以利用适宜的传递介质来将本发明的装置所产生的信号传出体外。为此，可以优选用信号传导材料作为柔性电缆，例如玻璃纤维电缆。但是，还可以实现信号的无线传递，例如作为红外信号、无线电信号或无线信号。不言而喻，在这种情况下，首先必须通过必须同样安装在装置中或至少在空间上接近的检测器来读取本发明的装置产生的信号，并转化为电磁信号，例如无线信号。然后可以通过位于体外的接收器来接收此电磁信号并评价。
通过按照本发明在传感器中使用水凝胶，使得能够进行血糖水平的有效的离体和体内诊断，因此能够进行与受损的葡萄糖代谢相关的疾病的早期识别及其管理，并能够选择治疗措施。
通过以下实施例来说明本发明。但是，实施例不限制保护范围。
实施例
实施例1：用于测定葡萄糖的传感器的制备
水凝胶颗粒(浓缩基质)的制备
将1g藻酸钠搅拌溶解在100g水中。在5L烧杯中将66.2gCaCl2x2H2O溶解在4931.3g水中。
通过泵使藻酸盐溶液进入双喷嘴。同时，将压缩空气连接至喷嘴的第二入口，使得藻酸盐溶液雾化为细液滴。气流将液滴带入含氯化钙溶液的浴中，它们在其中胶化并下沉至底部。然后收集胶化的小球。
浓缩基质中的传感器的制备：
对于加载，在染料标记的伴刀豆球蛋白A溶液和染料标记的葡聚糖溶液中连续孵育藻酸盐小球。然后离心沉下加载的小球，倒掉上清溶液。然后可选地在第二聚合物(例如基于PVA或PEG)的溶液中过夜孵育加载的小球，并可选地通过离心来分离。然后将小球混入可光化学交联的聚合物的水溶液中。然后用紫外线交联此混合物，以防止传感成分漏出藻酸盐小球。
此处的量取决于待测量的分析物的浓度，根据希望的荧光信号强度来选择标记程度。作为可光化学交联的聚合物，可以使用Nelfilcon聚合物(用丙烯酰胺基团修饰的聚乙烯醇)。对于光化学交联，还加入0.1％Irgacure2959。将成品溶液分入适宜的模型，并用紫外线固化(cured)。
非浓缩基质中的传感器的制备
将染料标记的伴刀豆球蛋白A溶液和染料标记的葡聚糖溶液连续送入水基预聚物混合物，并搅拌3小时。此处的量取决于待测量的分析物的浓度，根据希望的荧光信号强度来选择标记程度。作为可光化学交联的聚合物，可以使用Nelfilcon聚合物(用丙烯酰胺基团修饰的聚乙烯醇)。对于光化学交联，还加入0.1％Irgacure2959。将成品溶液分入适宜的模型，并用紫外线固化。
实施例2：传感器的葡萄糖活性的测定
传感器中的葡萄糖活性的测定：
在多种葡萄糖浓度下测定传感器的荧光光谱。供体荧光强度随葡萄糖含量的逐渐提高的变化作为葡萄糖传感器质量的测量。由于对于体内葡萄糖传感器，必须测量50和500mg/dL之间的葡萄糖浓度，按以下计算葡萄糖活性：
GA＝(强度500mg/dL-强度50mg/dL)/强度50mg/dL
为了更好地比较，对同一系统在溶液中的反应归一化所有反应值。对于相对葡萄糖活性的测定，将传感器(基质中)的葡萄糖活性除以溶液中的葡萄糖活性：
相对GA＝GA(基质)/GA(溶液)
溶液中的葡萄糖活性的测定
将伴刀豆球蛋白A溶液和葡聚糖溶液稀释在缓冲溶液中，并搅拌几个小时。在多种葡萄糖浓度下测定溶液的荧光光谱。供体荧光强度随葡萄糖含量的逐渐提高的变化作为系统质量的测量。由于对于体内葡萄糖传感器，必须测量50和500mg/dL之间的葡萄糖浓度，按以下计算葡萄糖活性：
GA＝(强度500mg/dL-强度50mg/dL)/强度50mg/dL
实施例3：基质的影响的测定
根据本发明，将葡萄糖结合蛋白和配体掺入水凝胶基质，该水凝胶基质显示与葡萄糖结合蛋白的某种相互作用。为此，这样选择水凝胶基质，使得首先葡萄糖结合蛋白和水凝胶基质的相互作用高于葡萄糖结合蛋白和水溶液之间的相互作用(传感成分的浓缩)。但是，另一方面，葡萄糖结合蛋白和水凝胶基质之间的相互作用必须不影响或不显著影响葡萄糖结合蛋白和分析物(葡萄糖)之间的相互作用。
适宜地选择水凝胶基质，通过葡萄糖结合蛋白和水凝胶基质之间的相互作用，在基质中达到了远高于葡萄糖结合蛋白在水溶液中的溶解度极限的葡萄糖结合蛋白浓缩。在伴刀豆球蛋白A的情况下，可以达到例如比在自由溶液中高至多10倍的浓度。加入配体(例如葡聚糖)后，溶解度问题变得更极端，因为葡萄糖结合蛋白-配体复合体由于其大小且通常还由于多价性而显示更低的溶解度。虽然溶液中质量比为1∶10的伴刀豆球蛋白A-葡聚糖复合体在超过0.5mg/g的伴刀豆球蛋白A浓度下已经开始沉淀，但在相同质量比的适宜的水凝胶基质中，可以制备超过50mg/g的伴刀豆球蛋白A浓度。通过水凝胶基质，葡萄糖结合蛋白(例如伴刀豆球蛋白A)的可用浓度范围可以提高100倍。
由于对于体内应用，分析物浓度的范围是固定的，且不能例如通过稀释或浓缩来调节，葡萄糖结合蛋白和配体的浓度必须适应于分析物的体内浓度范围。但是，通常存在困难，超出溶解度极限的葡萄糖结合蛋白浓度和/或配体浓度将因此而必要。
例如，对于伴刀豆球蛋白A-葡聚糖系统，在溶液中，可以按1∶10的质量比(葡聚糖∶伴刀豆球蛋白A)建立仅0.5mg/g的伴刀豆球蛋白A浓度，因为否则伴刀豆球蛋白A-葡聚糖聚合体将开始沉淀。在此，对于相对葡萄糖活性(相对GA)的测定，将在此浓度下达到的葡萄糖活性(GA)设为等于1。如预期，在非浓缩基质中，葡萄糖活性由于传感成分的更低的移动性而降低一半(相对GA＝0.52)。在浓缩基质中，用相同的浓度获得了几乎与溶液中相同的反应(相对GA＝0.83)。但是，还可以在浓缩基质中制备显著更高的伴刀豆球蛋白A浓度。在10mg/g的伴刀豆球蛋白A浓度下，在浓缩水凝胶基质中获得了提高2.6倍的葡萄糖活性(见表1)。
表1：基质的影响
溶液中 非浓缩基质中 浓缩基质中 浓缩基质中
伴刀豆球蛋白A浓度 0.5mg/g 0.5mg/g 0.5mg/g 10mg/g
相对GA 1 0.52 0.83 2.55
天然伴刀豆球蛋白A具有DOL＝1，葡聚糖具有每摩尔葡聚糖亚基(SU)0.001摩尔染料，葡聚糖∶伴刀豆球蛋白A质量比＝1∶10
实施例4：受体浓度的影响的测定
在浓缩基质中，清楚地观察到了葡萄糖活性对葡萄糖结合蛋白和配体的起始浓度的依赖性。随着浓度的提高，还获得了葡萄糖活性的提高。在非常高的受体浓度下，葡萄糖活性再次下降。用于体内测定的最适伴刀豆球蛋白A浓度在8和20mg伴刀豆球蛋白A/g基质之间(见表2)。
表2：受体浓度的影响
伴刀豆球蛋白A浓度[mg/g] 0.5 10.0 13.3 30 52.2
相对葡萄糖活性(相对GA) 0.83 2.55 2.76 2.14 1.76
天然伴刀豆球蛋白A具有DOL＝1，葡聚糖具有每摩尔葡聚糖亚基(SU)0.001摩尔染料，葡聚糖∶伴刀豆球蛋白A质量比＝1∶10
实施例5：受体标记程度的影响的测定
由于组织在更高波长下降低的固有荧光，在体内应用中必须使用长波长荧光染料。这些荧光染料由于更大的共轭系统而通常为完全非极性。如果用这类染料标记葡萄糖结合蛋白，则它的溶解度降低，使得高标记程度通常由于沉淀而不可能。为了提高葡萄糖结合蛋白的溶解度，有利地用例如聚乙二醇功能化葡萄糖结合蛋白。因此，葡萄糖结合蛋白的溶解度提高，因此可能在合成中达到更高的标记程度。
但是，聚乙二醇化的伴刀豆球蛋白A在溶液中仅产生低于天然伴刀豆球蛋白A的一半的葡萄糖活性(相对GA＝0.4)。令人惊奇地，在水凝胶基质中，未出现这种恶化。用PEG-伴刀豆球蛋白A获得了与天然伴刀豆球蛋白A相当的葡萄糖活性(相对GA＝2.2对2.6)(见表3)。
表3：标记程度(DOL)的影响
通过聚乙二醇化，首先可能用长波长荧光染料装备具有高标记程度的伴刀豆球蛋白A，其在水溶液中长期稳定且不沉淀。令人惊奇地，与在溶液中相比，在浓缩基质中未观察到由聚乙二醇化引起的葡萄糖活性的恶化。因此，只有通过基质的积极作用，才可能在测定中以高浓度使用具有高标记程度的PEG-伴刀豆球蛋白A。
令人惊奇地，可以通过提高伴刀豆球蛋白A上的标记程度来进一步提高葡萄糖活性。在浓缩水凝胶基质中，用具有DOL＝2.5的伴刀豆球蛋白A达到了几乎倍增的葡萄糖活性(相对GA＝4.3对2.6)。在与溶液中的测量的直接比较中，基质中的葡萄糖活性因此通过浓度和DOL的组合作用甚至提高了4.3倍(见表4)。
表4：标记程度的影响(DOL)
*具有＞1.5的DOL的天然ATTO680-伴刀豆球蛋白A在溶液中不稳定，并沉淀。
实施例6：荧光染料的影响的测定
分别结合于葡萄糖结合蛋白和配体的荧光染料的结构对葡萄糖活性也有影响。已证明罗丹明和噁嗪染料的组合尤其适宜。对于伴刀豆球蛋白A-葡聚糖系统，尤其优选罗丹明供体(例如ATTO590-或ATTO610-葡聚糖或ROX-葡聚糖)和噁嗪受体(例如ATTO655-或ATTO680-伴刀豆球蛋白A或Evoblue30-伴刀豆球蛋白A)。因此，与常规使用的TMR-伴刀豆球蛋白A/FITC-葡聚糖系统(呫吨-罗丹明组合)相比，在溶液中获得了2.1倍的葡萄糖活性，在浓缩基质中获得了甚至2.6倍的葡萄糖活性。对于罗丹明-噁嗪染料对，染料之间可以产生异二聚体相互作用，其增强了葡萄糖活性(见表5和6)。
表5：染料的影响
根据PEG-伴刀豆球蛋白A的实验值预测的对应值：
具有0.01摩尔D/摩尔SU的FITC-葡聚糖，质量比葡聚糖∶伴刀豆球蛋白A＝1∶10
表6：染料的影响
天然伴刀豆球蛋白A具有DOL＝1，葡聚糖具有每摩尔葡聚糖亚基(SU)0.001摩尔染料(D)，葡聚糖∶伴刀豆球蛋白A质量比＝1∶10
实施例7：水凝胶的性质的影响的测定
葡萄糖活性还依赖于水凝胶基质的性质。水凝胶基质可以包含一种聚合物或几种聚合物的混合物。已证明，由藻酸盐或藻酸盐和聚乙烯醇水凝胶的混合物制成的水凝胶基质是有利的。通过其与伴刀豆球蛋白A和葡聚糖的相互作用，藻酸盐水凝胶使得能够以高浓度浓缩传感成分。
第二水凝胶(例如PVA)的预聚物可以渗透入藻酸盐小球，并在其交联后与藻酸盐形成互穿网络。互穿网络的筛目宽度影响葡萄糖结合蛋白分子和配体分子的移动性，因此也影响葡萄糖活性。可以通过聚合物的性质、分子量和固体含量及交联基团的含量(其决定交点的数目)来影响筛目宽度。
越低的交联基团含量产生越高的葡萄糖活性。通过交联基团的减半，活性甚至可以提高1.5倍。因此，与溶液中的系统相比，还可以在不提高伴刀豆球蛋白A上的标记程度的情况下达到4.2倍的葡萄糖活性提高(见表7)。
表7：交联剂含量的影响
交联剂含量(mmol/g) 0.486 0.33 0.26
相对GA 2.76 4.04 4.24
天然伴刀豆球蛋白A(13mg/g)具有DOL＝1，葡聚糖具有每摩尔葡聚糖亚基(SU)0.001摩尔染料(D)，葡聚糖∶伴刀豆球蛋白A质量比＝1∶10
网络的固体含量对葡萄糖活性也具有影响。固体含量越高，葡萄糖活性越低(见表8)。
表8：固体含量的影响
SC预聚物 25％ 30％ 35％ 40％
相对GA 2.87 2.76 2.48 1.96
天然伴刀豆球蛋白A(13mg/g)具有DOL＝1，葡聚糖具有每摩尔葡聚糖亚基(SU)0.001摩尔染料(D)，葡聚糖∶伴刀豆球蛋白A质量比＝1∶10

Claims (17)

1.包含至少一种水溶性聚合物的聚合物基水凝胶在测量葡萄糖浓度的体内传感器中的用途，用于浓缩溶解的葡萄糖结合蛋白，其中所述至少一种聚合物能够与所述葡萄糖结合蛋白相互作用，且所述葡萄糖结合蛋白存在于与配体的复合体中，
其中所述传感器包埋在水凝胶中，
其中所述传感器用于测定样品中的葡萄糖含量。
2.权利要求1的用途，其中所述葡萄糖结合蛋白的配体是寡糖、糖基化大分子或糖基化纳米颗粒。
3.权利要求1或2的用途，其中与水溶液相比，所述溶解的葡萄糖结合蛋白以提高了至少5倍的浓度存在。
4.权利要求1的用途，其中所述至少一种聚合物选自藻酸盐、琼脂糖、透明质酸、脱乙酰壳多糖和鹿角菜胶。
5.权利要求1的用途，其中所述聚合物基水凝胶包含由藻酸盐制成的第一水凝胶基质，及在所述第一水凝胶基质内形成互穿网络的第二水凝胶基质。
6.权利要求1或2的用途，其中所述葡萄糖结合蛋白选自凝集素、结合葡萄糖作为底物的酶、特异性识别葡萄糖的抗体和特异性识别葡萄糖的适体。
7.权利要求6的用途，其中所述葡萄糖结合蛋白是伴刀豆球蛋白A。
8.权利要求7的用途，其中所述伴刀豆球蛋白A浓度大于0.5mg/(g聚合物)。
9.权利要求8的用途，其中所述伴刀豆球蛋白A浓度在2和60mg/(g聚合物)之间。
10.权利要求7至9中任一项的用途，其中由于化学修饰，所述伴刀豆球蛋白A与未修饰的伴刀豆球蛋白A相比显示提高的水溶性。
11.权利要求10的用途，其中所述修饰选自聚乙二醇化、乙酰化、琥珀酰化和聚噁唑啉化。
12.权利要求2的用途，其中所述葡萄糖结合蛋白与噁嗪染料连接，而所述葡萄糖结合蛋白的配体与罗丹明染料连接。
13.权利要求1的用途，其中所述传感器用于诊断受损的葡萄糖代谢。
14.权利要求1的用途，其中所述传感器用于在罹患受损的葡萄糖代谢的患者中测定对治疗措施的需要。
15.权利要求1或2的用途，其中与水溶液相比，所述溶解的葡萄糖结合蛋白以提高了至少10倍的浓度存在。
16.权利要求1或2的用途，其中与水溶液相比，所述溶解的葡萄糖结合蛋白以提高了至少15倍的浓度存在。
17.权利要求1或2的用途，其中与水溶液相比，所述溶解的葡萄糖结合蛋白以提高了至少20倍的浓度存在。
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