CN108178735A - 双反应性重氮化合物试剂及制备方法、tmv基水凝胶及应用和相转变调节方法 - Google Patents

双反应性重氮化合物试剂及制备方法、tmv基水凝胶及应用和相转变调节方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物材料领域，涉及双反应性重氮化合物试剂及制备方法、TMV基水凝胶及应用和相转变调节方法。该双反应性重氮化合物试剂具有式I所示结构。本发明制备了第一个病毒交联水凝胶，并具有良好的稳定性。这将有助于在未来的生物医学应用中使用病毒纳米材料作为水凝胶来提高载药能力。

Description

双反应性重氮化合物试剂及制备方法、TMV基水凝胶及应用和 相转变调节方法
技术领域
本发明属于生物材料领域，更具体地，涉及一种双反应性重氮化合物试剂及制备方法，TMV基水凝胶及应用和一种相转变调节方法。
背景技术
水凝胶是一种很有应用前景的生物材料，可用于诊断、药物递送、细胞培养和组织工程。蛋白质通过化学试剂或DNA模板进行交联形成了仿生凝胶材料，这些材料可以很容易地定制，以获得理想的机械和化学性质。植物病毒在纳米尺度上具有独特的蛋白表面拓扑结构，为纳米材料的可控性模板合成提供了便利。由于植物病毒与人体具有生物相容性，而且可以很容易地以高均一性进行克量级的制备，因此，植物病毒的直接交联可成为一种很有前景的水凝胶构建策略。
烟草花叶病毒(TMV)颗粒为长300纳米、直径18纳米的杆状纳米颗粒，表面具有酪氨酸(Tyr)残基。采用重氮偶联的酪氨酸修饰策略通常在原位完成，这会影响蛋白质结构，并且难以控制反应的化学计量。
为解决这一问题，需开发出新型高效的化学试剂以交联病毒蛋白。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中的上述问题，提供一种双反应性重氮化合物试剂及制备方法，该试剂可连接两个Tyr残基，从而有效实现蛋白交联。该试剂可稳定使用，可在-20℃冰箱中保存至少一年。该试剂与TMV 在缓冲液(pH 7.0)中直接混合即可形成病毒基水凝胶，并且，该水凝胶很容易被一些还原剂例如Na2S2O4降解(如图1A-图1C所示)，实现相转变。这将有助于在未来的生物医学应用中使用病毒纳米材料作为水凝胶来提高载药能力。
为了实现上述目的，本发明的第一方面提供一种双反应性重氮化合物试剂(以下简称化合物1)，该双反应性重氮化合物试剂具有式I所示结构。
所述双反应性重氮化合物试剂可通过“一锅”法制得。制得的化合物1 为浅黄色，并且两个重氮部分可通过光谱检测到(如图2A和图2B所示)。
本发明的第二方面提供所述双反应性重氮化合物试剂的制备方法，该方法包括，在酸性条件下，将式II所示化合物、亚硝酸盐与HPF6反应，制得式I所示化合物，反应方程式如图2A所示。所述酸性条件可通过例如浓盐酸提供。所述亚硝酸盐包括但不限于亚硝酸钠和/或亚硝酸钾。所述反应在低温条件下进行，优选为-5℃～-15℃。
本领域技术人员能够选择合适的反应条件和组分用量进行上述反应。根据本发明一种具体实施方式，将式II所示化合物(4,4’-二胺基苯甲酮) 溶解于浓盐酸和H2O中，冷却至-10℃。在-10℃下，向混合物中缓慢加入 NaNO2水溶液，反应1h后，在-10℃下，加入60％HPF6水溶液，搅拌1h。过滤收集产物并用冰水洗涤，得到浅黄色的化合物1固体。
本发明的第三方面提供一种TMV基水凝胶，该TMV基水凝胶通过包括以下步骤的方法制得：在水相缓冲溶液中，使TMV颗粒与所述双反应性重氮化合物试剂混合并反应，所述TMV颗粒的浓度为1mg/mL以上，所述双反应性重氮化合物试剂的浓度为1mM以上，所述反应的温度为30-50℃，反应体系的pH值为6.8以上。所述在水相缓冲溶液中可以本领域常规的可溶解TMV病毒颗粒的水相缓冲溶液，例如磷酸缓冲液或磷酸盐缓冲液。
根据本发明，所述TMV颗粒和所述双反应性重氮化合物试剂处于合适的浓度和比例关系，温度和pH处于合适范围时，才能够得到TMV基水凝胶。
优选地，所述TMV颗粒的浓度为1.25-5mg/mL。
优选地，所述双反应性重氮化合物试剂的浓度为1.25mM-10mM。
优选地，所述反应的温度为35-40℃。
优选地，所述反应的pH值为7.0-8.5。
最优选地，所述反应的条件包括：在0.1M PB缓冲液(pH 7.0)中， TMV浓度为2.5mg/mL，化合物1浓度为2.5mM，在37℃下反应30min。
本发明的第四方面提供上述TMV基水凝胶的相转变调节方法，该方法包括，用偶氮键还原剂处理该TMV基水凝胶。通过破坏偶氮键从而实现水凝胶至溶液的转变。所述偶氮键还原剂优选为Na2S2O4溶液。Na2S2O4溶液的浓度和用量可根据需要确定。
本发明所述的双反应性重氮化合物试剂或所述的TMV基水凝胶可用于药物递送领域。
本发明制备了第一个病毒交联水凝胶，并具有良好的稳定性。这种病毒水凝胶设计基于病毒表面上大量分布的酪氨酸残基，其可以通过本发明的双重氮试剂容易地连接。制得的病毒水凝胶严格依赖病毒的纳米结构，这对于病毒水凝胶的形成至关重要。由于这些病毒纳米结构表现出多种化学性质，如药物粘附，矿物沉积和核酸包装，因此，病毒水凝胶将有助于稳定和增强化学空间用于进一步修饰。这种设计可以作为一种通用的方法在未来的生物医学和农业应用中利用其他生物相容性病毒制备更多类型的病毒水凝胶。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述。
图1示出了双反应性重氮化合物试剂构建病毒基水凝胶的示意图。其中图1A为二氨基二苯甲酮结构；图1B为双重氮部分与TMV表面上的酪氨酸残基反应的示意图；图1C为由化合物1形成病毒水凝胶和凝胶降解的示意图。
图2A示出化合物1的合成路线、固态化合物1的照片，以及化合物1 与Fmoc-Tyr-OH的反应；图2B示出化合物1的光谱性质，其中，纵轴为 350nm处的吸光度值，横轴为室温下在PBS(50mM，pH7.4，含50％CH3CN) 中用Fmoc-Tyr-OH(400μM)处理化合物1的时间。
图3-图6分别为化合物1的1H NMR谱图、13C NMR谱图、31P NMR 谱图、19F NMR谱图。
图7示出了化合物1在水相溶液中具有良好的溶解性，图7A为不同浓度的化合物1在PBS缓冲液(50mM，pH 7.4)中，在275nm处的吸光度曲线，图7B为吸光度的线性拟合曲线(R＝0.998)。
图8示出了室温下，PBS(50mM，pH 7.4)中，化合物1(20μM)的时间依赖UV-Vis光谱。
图9示出了室温下在PBS(50mM，pH 7.4，含50％CH3CN)中，用含Tyr分子化合物2(200μM)处理化合物1(20μM)的时间依赖UV-Vis 吸收光谱。
图10为TMV与各种浓度的化合物1交联的SDS-PAGE图。反应采用 1mg/mL TMV混悬液，与不同浓度的化合物1混合，在37℃下，0.1mol/L PB(pH 7.0)中孵育60min。反应后，样品与2×SDS上样缓冲液混合，然后在99℃煮沸5分钟。然后将煮沸的样品冷却至环境温度，并以12,000rpm 离心5分钟。将上清液加载到12％SDS-PAGE中进行凝胶电泳。将PAGE 凝胶用考马斯蓝R250染色并用Quantity One软件(Bio-Rad)成像。
图11示出了5mg/mL TMV与各种浓度的化合物1交联后的SDS-PAGE 图。
图12A)-图12D)分别示出了未交联、与0.039mM，0.156mM和0.625mM 的化合物1交联的TMV的TEM图像。反应采用1mg/mL TMV混悬液，与不同浓度的化合物1混合，在37℃下，在0.1mol/L PB(pH 7.0)中孵育 60min。
图13示出了TMV与化合物1的浓度对病毒凝胶化的影响，图13A中化合物1的浓度为10mM，图13B中TMV的浓度为2.5mg/mL。反应在 0.1M PB(pH 7.0)中，在37℃下进行30min。
图14示出了TMV浓度对于病毒凝胶化的影响，反应在0.1M PB(pH 7.0)中在37℃下进行。化合物1的浓度为10mM。
图15示出了化合物1浓度对于病毒凝胶化的影响，反应在0.1M PB(pH 7.0)中在37℃下进行。TMV浓度为2.5mg/mL.
图16示出了孵育温度对病毒凝胶化的影响，反应在0.1M PB(pH 7.0) 中进行，化合物1浓度为2.5mM，TMV浓度为2.5mg/mL。
图17示出了pH值对病毒凝胶化的影响，反应在0.1M PB(pH 7.0) 中在37℃下进行，化合物1浓度为2.5mM，TMV浓度为2.5mg/mL。
图18示出了在37℃下、0.1M PB中，解组装的TMV的交联。化合物 1和TMV的浓度分别为10mM和2.5mg/ml。图中从左至右依次为空白样、不含SDS、SDS终浓度为0.5％(W/V)和SDS终浓度5％(W/V)。在交联之前，将2.5mg/ml TMV溶液首先通过SDS解组装并温育10分钟。然后用交联剂化合物1处理解组装的TMV。
图19示出了酪蛋白与溶菌酶在37℃下、0.1M PB中交联。标签T代表酪蛋白，标签L代表溶菌酶。交联剂化合物1和蛋白质的浓度分别为10mM 和2.5mg/mL。
图20示出了不同浓度的Na2S2O4对病毒凝胶的降解作用。化合物1和 TMV的浓度分别为10mM和2.5mg/mL。反应在0.1M PB(pH 7.0)中，在 37℃下进行1h和12h。在指定的时间，样品上下摇晃，以分散凝胶。
图21示出了在0.1mol/L PB(pH 7.0)中，在37℃和不同作用时间下，不同浓度的Na2S2O4对病毒凝胶的降解作用。化合物1和TMV的浓度分别为10mM和2.5mg/mL。
图22示出了在0.1M PB(pH7.0)中，在37℃下，不同浓度的Na2S2O4对病毒凝胶的降解作用。化合物1和TMV的浓度分别为2.5mM和 2.5mg/mL。
图23示出了在37℃，不同时间下，在0.1M PB(pH 7.0)中，不同浓度的Na2S2O4对于在50℃下制备TMV凝胶的化学降解。化合物1和TMV 的浓度分别为2.5mM和2.5mg/mL。TMV胶凝化反应在50℃下进行，然后用于Na2S2O4降解。
图24示出了Na2S2O4对病毒水凝胶膜的降解。将50μL反应样品转移到载玻片上并在37℃干燥制备病毒水凝胶膜。当病毒膜可见后，将50μL 不同浓度的Na2S2O4滴在膜的中心，37℃孵育30min。病毒凝胶通过浓度分别为2.5mM和2.5mg/mL的交联剂化合物1和TMV构建。
图25示出了以不同浓度的喜树碱(CPT)加载病毒水凝胶，图中从左至右依次为空白样、DMSO、10nM CPT、100nM CPT、500nM CPT、1μM CPT、 10μM CPT、100μM CPT、500μM CPT。化合物1和TMV的浓度分别为10mM 和2.5mg/mL。将CPT溶解于DMSO中，并与含有化合物1的0.1M PB缓冲液(pH7.0)混合。反应在50℃下进行30分钟。
图26示出了CPT浓度和荧光强度的标准曲线。图26A用含有5％DMSO 的0.1M PB缓冲液(pH7.5)将CPT稀释成各种浓度。激发波长为370nm。图26B根据CPT浓度与荧光强度之间的关系建立线性回归方程。
图27示出了使用透析袋在管中释放含有CPT的TMV水凝胶。
图28示出了TMV水凝胶CPT释放的时间依赖性。TMV水凝胶由10mM化合物1和5mg/mLTMV制成。在TMV水凝胶中加入100μM CPT。将含有CPT的TMV水凝胶置于透析袋中并浸入50mL100mM磷酸盐缓冲液(PB，pH7.5)中。在指定的时间，将2mL透析液体转移到石英池中检测荧光强度。激发波长和发射波长分别为370nm和450nm。
图29示出了含有100μM CPT的TMV水凝胶的时间依赖性CPT释放。将含有100μM CPT的TMV水凝胶密封到透析袋中，再浸入含有50mL 100mM磷酸盐缓冲液(PB，pH7.5)的管中。在指定的时间，将2mL透析液体转移到石英池中以检测荧光强度。激发波长和发射波长分别为370nm 和450nm。
图30A)和图30B)为TMV基水凝胶的SEM图像。比例尺显示在插图中。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
1、式I所示的双反应性重氮化合物的制备及确认
4,4’-二胺基苯甲酮(1.06g，5.0mmol)溶解于15mL浓盐酸和30mL H2O 中，冷却至-10℃。在-10℃下，向混合物中缓慢加入NaNO2水溶液(2.77g， 40.1mmol)，反应1h后，在-10℃下，加入60％HPF6水溶液(2mL，13.7 mmol)，搅拌1h。过滤收集产物并用冰水洗涤，得到浅黄色的化合物1固体(1.20g，45.6％)。化合物1的核磁数据如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6) δ8.69(d,J＝8.8Hz,4H),8.14(d,J＝8.8Hz,4H).13C NMR(101MHz, DMSO-d6)δ158.1,133.1,128.6,115.1,94.2.31P NMR(162MHz,DMSO-d6)δ -144.19(h,JP-F＝710.6Hz).19F NMR(376MHz,DMSO-d6)δ-70.08(d,JP-F＝ 710.6Hz)。化合物1的1H NMR谱图、13C NMR谱图、31PNMR谱图、19F NMR 谱图分别如图3-图6所示。8.69ppm和8.14ppm的位移值指示了正电荷重氮基团的存在。
2、化合物1的性质
2.1化合物1的溶解性
化合物1的双重氮部分可通过光谱检测，图7A示出了不同浓度的化合物1的PBS缓冲液在275nm的吸收曲线，可见，化合物1在水溶液中具有好的溶解性。在水相溶液中，化合物1也会缓慢降解，伴随275nm处的吸收强度下降，但是仍会保持碱性重氮试剂的光谱特性(如图8所示)，因此，化合物1应当新鲜制备以进行即时的蛋白标记。
2.2化合物1的反应性
为验证化合物1是否可与酚基反应，选择酪氨酸类似物来研究其反应动力学性质。由于化合物1能够与酪氨酸类似物反应生成两个偶氮键，反应发生仅5min，即可观察到350nm处的最大吸收。反应速度非常快，反应速率常数k2为19.66M-1S-1(图2B、图9)。可见，化合物1的重氮部分可与酪氨酸的酚羟基发生快速、高效的反应。
3、TMV衣壳蛋白(CP)的交联与TMV凝胶化
进一步用化合物1标记TMV衣壳蛋白以研究衣壳蛋白是否可以交联。据我们所知，TMV的两个Tyr残基伸出衣壳蛋白之外。当使用1mg/mL TMV 悬浮液时，随着化合物1浓度的增加，样品颜色变得更暗红。SDS-PAGE 分析也显示高浓度的化合物1诱导了更多的蛋白质交联产物，从二聚体至四聚体再到聚合物，最终不能有效地转移到SDS-PAGE凝胶中。正如预期， 1.25mM和2.5mM的化合物1都能有效地将TMV溶液转化为TMV水凝胶，而其他浓度低于1.25mM的TMV仍然保持溶液状态(图10)。为了研究TMV 凝胶化是否与TMV浓度相关，我们将TMV浓度提高到5mg/mL。正如所见，相同浓度下的化合物1不能完全交联TMV衣壳蛋白，并且在化合物1 的所有浓度下都几乎观察不到TMV凝胶化(图11)。这表明TMV凝胶化应该至少达到TMV浓度与化合物1浓度之间的阈值。由于TMV凝胶化使得难以用TEM检测，所以选择三种低浓度化合物1的样品(0.039mM， 0.156mM和0.625mM)，观察TMV交联。如图12所示，与SDS-PAGE检测一致，低浓度的化合物1确实诱导TMV棒交联，而更高的低浓度化合物 1可以使多个TMV棒成为一串，这表明TMV棒之间有强的胶合相互作用。这些结果清楚地表明化合物1表现出优异的用于蛋白质交联的胶合功能。
选择高浓度的化合物1(2.5mM)的凝胶样品进行扫描电镜SEM检测。如图30A)和图30B)所示，SEM图显示出多个病毒棒连接在一起形成了多孔结构。
4、凝胶化最优条件的确定
接下来研究化合物1与TMV溶液的凝胶化。如上所述，凝胶化需要病毒基质浓度与交联剂浓度处于合适的比例。当使用10mM化合物1时，测试不同浓度的TMV基质样品以找到凝胶浓度阈值。结果表明，浓度为2.5 mg/mL和5mg/mL的TMV基质均易于固化，浓度为0.625mg/mL和0.3125 mg/mL的TMV基质仍保持液体状态。只有1.25mg/mL的TMV基质保持半固态，不能长期粘附在玻璃壁上(图13A，图14)。这表明TMV基质浓度应该至少达到1.25mg/mL才能固化。否则，即使交联剂化合物1过量，也很难得到TMV水凝胶。由于2.5mg/mL的TMV基质可以形成水凝胶，我们使用该浓度来测试交联剂化合物1对TMV凝胶化的影响。与各种浓度的化合物1反应后，TMV基质显示浓度依赖性的颜色变化。浓度较高的化合物1显示较深的颜色。1.25mM化合物1将2.5mg/mL TMV基质诱导成半流体凝胶，较低浓度的化合物1(0.625mM)不能有效连接所有衣壳蛋白以形成凝胶(图13B，图15)。这些结果揭示了至少1.25mM化合物1能够完全胶合2.5mg/mL TMV的所有衣壳蛋白以形成凝胶。高于这个浓度后，区别仅在于凝胶强度。来自10mM化合物1的TMV水凝胶表现出更强的抗摇动性，而来自1.25mM化合物1的TMV水凝胶相比前者更弱，通过简单的上下摇动可容易地破坏TMV水凝胶。它类似于琼脂糖，其强度只能由琼脂糖基质重量来调节。
为了获得化合物1与TMV凝胶化条件的详细信息，进一步研究了不同温度和pH下的TMV凝胶化效率。4℃等较低温度下，化合物1与Tyr残基反应缓慢，不能快速诱导TMV基质凝胶化。而当反应温度升高到50℃时，即使经过12小时的培养，TMV基质仍保持流体状态。这表明由于同时发生的化学连接和自我降解，TMV胶凝在短时间内完成。反应温度在37℃以上则适合于TMV的凝胶化。如果将培养温度设定在25℃，则TMV基质将是半流动的，可以很容易地摇摆起来。孵化温度提高到50℃时，也不能进一步固化。化合物1诱导的TMV凝胶化在50℃(≥5分钟)比37℃(≥ 30分钟)快得多。然而，在50℃时可以产生比37℃更多的气泡(图16)，这可以通过调节TMV的浓度和温度来避免。
因此，优选TMV浓度为2.5mg/mL，化合物1浓度为2.5mM，在37℃下反应30min，产生均匀的TMV水凝胶，气泡少，强度较高。
与温育温度相同，TMV凝胶化需要合适的pH范围。接下来测试了一系列pH梯度来观察TMV基质凝固的变化。TMV凝胶显示偏好中性和弱碱性条件。在pH 5.5和pH 6.6下，没有观察到凝胶状态，而TMV基质在其它pH范围(7.0、7.5、8.0、8.5)均正常聚集成凝胶，这与重氮反应一致 (图17)。
5、病毒纳米结构决定凝胶化
基于上述结果，我们提出病毒纳米结构决定了病毒溶液向水凝胶的转变，这与衣壳蛋白组织排列成棒状纳米结构紧密相关。如果使用5％SDS 破坏棒状结构，含有SDS的TMV溶液几乎不能转化为凝胶(图18)，这与纯蛋白质与化合物1交联一致，如酪蛋白和溶菌酶所示。那些纯蛋白质可以通过相同的交联剂化合物1转化成蛋白质凝胶(图19)。这些结果充分表明交联剂不是病毒水凝胶形成的决定因素。它主要依靠病毒颗粒的高度组织纳米结构。
6、“凝胶-溶液”相变
为了调节“凝胶-溶液”相变，选择Na2S2O4通过破坏作为连接桥的偶氮键来降解TMV凝胶。如图20和图21所示，由10mM化合物1和2.5mg/mL TMV基质制备的TMV凝胶随着Na2S2O4的量和温育时间的增加而逐渐降解，这可以通过颜色从深棕色到淡黄色看出。添加0.1M PB缓冲液不能改变凝胶强度，其仍然表现出强的抗摇动性。当使用50mM Na2S2O4时，培养 12小时后凝胶强度显著降低，但也能保持凝胶状态。当添加过量的Na2S2O4时，降解效率进一步加强。降解结果表明，应加入至少25当量的化合物1 来分解TMV凝胶。降解速度和效率也与交联剂化合物1的浓度有关。2.5mM 化合物1和2.5mg/mL TMV基质制成的TMV凝胶抗摇动性较差。当使用 200和400当量的化合物1时，这种类型的TMV凝胶容易在60分钟内降解(图22)。结果表明，病毒凝胶的降解主要取决于Na2S2O4与交联剂化合物1的摩尔比。相反，50℃制备的TMV凝胶比37℃的凝胶强度更高。Na2S2O4的添加不能将TMV凝胶完全转化成溶液，但将凝胶分解成浅黄色的小部分(图23)。与上述TMV凝胶不同，这种类型的TMV凝胶需要至少24小时降解。它完全受到Na2S2O4与偶氮键的反应速率、凝胶强度和凝胶深度的限制。
为了检测凝胶强度对凝胶降解的影响，将反应混合物涂在载玻片周围以形成凝胶膜，并将相同浓度的Na2S2O4滴在凝胶膜的中心以降解TMV凝胶。在30分钟内，膜中心的黄色部分变成白色，这表明病毒凝胶可以在短时间内降解，但凝胶深度会影响降解时间(图24)。因此，使用更灵敏的化学断裂反应来控制凝胶至溶液的变化将是更有希望的。这些结果清楚地表明了本发明是简单、快速和有效的病毒水凝胶制备和降解的方法。
7、TMV基水凝胶的药物递送
正如我们所知，基于水凝胶的药物递送已被广泛应用于生物医学。为了测试TMV水凝胶是否可以包装和释放药物，我们构建了一种TMV水凝胶，其中含有不同浓度的喜树碱(CPT)。CPT具有有效的抗肿瘤活性，但具有相对较低的水溶性，限制了其在水相中的应用。我们测试了不同浓度的CPT对TMV凝胶化的影响，发现从10nM到500μM的CPT不影响TMV 凝胶化，这表明疏水性CPT可以以更高的量包裹在TMV水凝胶基质中(图 25)。为了进一步探索CPT释放，我们将含有100μM CPT(1mL)的TMV 水凝胶放入透析袋中，并将其浸入50mL 0.1MPB(pH 7.5)中以释放CPT。在指定的时间，测定450nm处的发射荧光强度，以计算TMV水凝胶释放的CPT的量(图26，图27)。结果显示透析12小时可检测到50％的CPT 释放，释放速度快。12小时后，CPT释放速度减慢至稳定状态，72小时后可释放72.1％的CPT(图28，图29)。可能是由于透析袋内外浓度差异小，导致CPT释放速度放慢。TMV水凝胶表现出与其他水凝胶如琼脂糖一样的缓释特性。因此，使用TMV水凝胶改善载药能力并增加在水相中的溶解度将是一个很好的选择。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

Claims (10)

1.一种双反应性重氮化合物试剂，其特征在于，该双反应性重氮化合物试剂具有式I所示结构。
2.权利要求1所述的双反应性重氮化合物试剂的制备方法，其特征在于，该方法包括，在酸性条件下，将式II所示化合物、亚硝酸盐与HPF6反应，制得式I所示化合物。
3.一种TMV基水凝胶，其特征在于，该TMV基水凝胶通过以下步骤制得：在水相缓冲溶液中，使TMV颗粒与权利要求1所述的双反应性重氮化合物试剂混合并反应，所述TMV颗粒的浓度为1mg/mL以上，所述双反应性重氮化合物试剂的浓度为1mM以上，所述反应的温度为30-50℃，反应体系的pH值为6.8以上。
4.根据权利要求3所述的TMV基水凝胶，其中，所述水相缓冲溶液为磷酸缓冲液或磷酸盐缓冲液。
5.根据权利要求3所述的TMV基水凝胶，其中，所述TMV颗粒的浓度为1.25-5mg/mL。
6.根据权利要求3所述的TMV基水凝胶，其中，所述双反应性重氮化合物试剂的浓度为1.25-10mM。
7.根据权利要求3所述的TMV基水凝胶，其中，所述反应的温度为35-40℃。
8.根据权利要求3所述的TMV基水凝胶，其中，反应体系的pH值为7.0-8.5。
9.权利要求3-8中任意一项所述的TMV基水凝胶的相转变调节方法，该方法包括，用偶氮键还原剂处理该TMV基水凝胶。
10.权利要求1所述的双反应性重氮化合物试剂或权利要求3-8中任意一项所述的TMV基水凝胶在药物递送中的应用。
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