CN101805603A - 异硫氰酸荧光素掺杂的二氧化硅荧光纳米粒子及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种二氧化硅纳荧光纳米粒子及其制备方法,特别是一种FITC掺杂的二氧化硅荧光纳米粒子及其制备方法。该方法具体包括前驱体溶液的制备等步骤。本发明以异硫氰酸荧光素与3-氨基丙基三甲氧基硅烷反应制成前驱体,然后采用油包水微乳液法,制得了一种新的FITC掺杂的二氧化硅核壳纳米颗粒。所制备的纳米颗粒呈规则球形,具有良好的单分散性与光稳定性,不易发生染料泄漏。这种纳米颗粒对pH具有良好的响应可应用于细胞的pH实时监测。
Description
技术领域
本发明涉及一种二氧化硅纳荧光纳米粒子及其制备方法,特别是一种异硫氰酸荧光素FITC掺杂的二氧化硅荧光纳米粒子及其制备方法。
背景技术
直接对活体细胞进行原位监测,可以真实地了解活细胞的生命活动,但是传统的方法很难实现这一点。荧光纳米颗粒可直接进入单个活体细胞体内,基于荧光纳米颗粒建立的纳米生物探针可高灵敏、高选择性地监测活细胞中的活性物质如Ca2+,H+,RNA等。
H+离子对生物体的生命活动起着重要的调控作用,一些生命现象的发生常伴随着细胞内H+离子浓度的变化,因此单细胞水平上pH的测量对生命机理的解释以及疾病病变的预测具有非常重要的意义。如果将对pH敏感的荧光纳米颗粒制备成pH探针,可用于单细胞中pH的实时监测。
由于二氧化硅良好的水溶性及生物相容性,荧光染料掺杂的二氧化硅核壳荧光纳米粒子用作细胞分析的探针具有良好的应用前景。
目前现有技术采用是将异硫氰酸荧光素FITC直接掺杂合成二氧化硅核壳型纳米粒子,但是此法容易引起染料泄露。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种新型的FITC掺杂的二氧化硅荧光纳米粒子。
本发明的目的之二在于提供该荧光纳米粒子的制备方法。
为达到上述目的,本发明采用的机理为:
根据上述机理,本发明采用如下技术方案:
一种异硫氰酸荧光素掺杂的二氧化硅荧光纳米粒子,其特征在于该荧光纳米粒子是异硫氰酸荧光素通过其分子中的活性官能团异硫氰基与3-氨基丙基三甲氧基硅烷分子的氨基发生加成反应形成schiff碱;然后在氨水作用下,该schiff碱与正硅酸乙酯共水解之后发生聚合反应而形成的核壳型异硫氰酸荧光素掺杂的二氧化硅荧光纳米粒子,其结构式为:
一种制备上述的异硫氰酸荧光素掺杂的二氧化硅荧光纳米粒子的方法,其特征在于该方法的具体步骤为:
a.FITC与APTMS反应制得前驱体FITC-APTMS;
b.将环己烷、Triton X-100、正己醇按4∶1∶1~5∶1∶1的体积比混和形成混合液,
再将该混合液与去离子水按60∶1~50∶1的体积比混合形成清澈透明的微乳液;
c.将步骤a所得前驱体FITC-APTMS的水溶液加入上述微乳液中,充分搅拌混匀,并控制前驱体与微乳液的质量比为1∶8~1∶10,充分搅拌混匀,加入正硅酸乙酯,其与前驱体的用量体积比为1∶10~2∶10,然后加入氨水,使其与正硅酸乙酯体积比为3∶5~1∶5,室温避光磁力搅拌反应24小时后加入丙酮破乳,再用无水乙醇和超纯水交替离心、洗涤,得到纯的FITC-APTMS/SiO2核壳型荧光纳米粒子,最后将该荧光纳米粒子烘干。
本发明将FITC与APTMS反应制成前驱体FITC-APTMS,采用油包水微乳液法,制得了一种新的FITC掺杂的二氧化硅核壳纳米颗粒简称FAS。由于APTMS与正硅酸乙酯(TEOS)的共水解与聚合作用,使FITC通过牢固的化学键与二氧化硅外壳相连接,有效地防止了FITC荧光染料分子的泄露,同时硅壳的保护作用,提高了染料的化学稳定性与光稳定性。此外,由于二氧化硅壳层是多孔网状立体结构,裸露的质子能穿透过去,而且该纳米颗粒能被单个小鼠神经干细胞吞噬并对pH有良好的响应,因此可望用做纳米pH传感器件,实现对单个细胞的pH实时监测。
附图说明
图1为本发明的荧光纳米粒子和FITC的紫外-可见吸收光谱图,其中(a)为荧光纳米粒子,(b)为FITC。
图2为本发明的荧光纳米粒子和FITC的荧光光谱,其中(a)为荧光纳米粒子,(b)为FITC。
图3为本发明的荧光纳米粒子的透射电镜图。
图4为本发明的荧光纳米粒子和FITC的光稳定性实验曲线(a)为FITC,(b)为荧光纳米粒子。
图5为本发明的荧光纳米粒子和FITC的染料泄露曲线,其中实线为荧光纳米粒子和虚线为FITC硅纳米粒子。
图6为本发明的荧光纳米粒子的荧光强度随pH值变化曲线.
图7为吞噬本发明的荧光纳米粒子的神经干细胞荧光成像图.
图8为不同pH值本发明的荧光纳米粒子的的荧光光谱。
具体实施方式
一、仪器与试剂:FITC、APTMS、表面活性剂TritonX-100等均为分析纯,购于Sigma公司;小鼠神经干细胞由上海大学生命科学学院提供;其他试剂均从上海国药集团化学试剂有限公司购买,均为分析纯。所用水均为超纯水。
FV1000激光共聚焦扫描显微镜(日本Olympus公司);SPM-9600原子力显微镜(日本Shimadzu公司);JSM-2010F型透射电子显微镜(日本JEOL公司);F-7000型荧光分光光度计(日本Hitachi公司);U-3010型紫外-可见分光光度计(日本Hitachi公司);CR21GII高速离心机(日本Hitachi公司);PHS-3C精密pH计(上海雷磁仪器厂)。
二、FITC-APTMS/SiO2核壳型荧光纳米粒子的制备及表征
FITC与APTMS反应制成前驱体schiff碱FITC-APTMS的方法请参见参考文献(SantraS,2006)。
1.制备:反应所用的玻璃容器反应前用5%HF溶液清洗,再用去离子水清洗,以除去玻璃容器可能带来的成核位点。称取1mg FITC,溶于1mL经过重蒸的无水乙醇,超声分散。
然后加入5μL APTMS。在干燥密闭的环境中避光搅拌反应24小时,制得前驱体FITC-APTMS。将环己烷、Triton X-100、正己醇按4∶1∶1~5∶1∶1的体积比加入烧瓶形成混和溶液,磁力搅拌30min,缓慢滴加去离子水,混合液与去离子水的体积比为60∶1~50∶1,搅拌30min使之混匀,形成清澈透明的微乳液。将前驱体FITC-APTMS加入上述微乳液中,充分搅拌混匀,并控制前驱体FITC-APTMS与微乳液的质量比为1∶8~1∶10,充分搅拌混匀,加入正硅酸乙酯,其与前驱体的用量体积比为1∶10~2∶10,然后加入氨水,使其与正硅酸乙酯体积比为3∶5~1∶5,室温避光磁力搅拌反应24h后加入少量丙酮破乳,再用无水乙醇和超纯水交替离心、洗涤数次,洗掉残留的表面活性剂和染料分子等,得到纯的FITC-APTMS/SiO2核壳型荧光纳米粒子(简称FAS),最后将纳米粒子在真空中80℃烘干。
2.FAS纳米粒子的光谱表征:将1mgFITC和1mg FAS纳米粒子分别溶于2mL超纯水中,分别测量紫外-可见光谱及荧光光谱如图1及图2所示。由图1可知,FAS纳米粒子与FITC的最大吸收波长分别为498nm,492nm。与单纯的FITC相比,FAS纳米粒子的吸收峰明显变窄,峰值位置稍有移动,这可能是由于FITC被限域在SiO2空间网状结构中以及FITC分子与SiO2空间网络的硅羟基相互作用引起的。图2显示FAS纳米粒子与FITC在激发波长为492nm时,最大发射波长分别为518nm和515nm。FAS纳米粒子发射峰的位置较FITC略有红移,原因可能是由于二氧化硅基质与染料相互作用引起能量的损失,从而导致荧光发射峰的红移。
3.FAS纳米粒子的TEM表征:将所得的FAS纳米颗粒充分分散到乙醇相中,用移液器吸取少许滴加到铜网上,常温放置自然干燥后用透射电子显微镜对其进行扫描,观察其形貌,结果如图3所示。由图3可看出所制备的FAS纳米粒子呈规则球型,大小比较均匀且分散性好,平均粒径约为150±15nm。
三、FAS纳米粒子的光稳定性实验:
将1mg的FITC和1mg的FAS纳米粒子分别溶于pH值7.8的0.05mol/LTris-HCl缓冲溶液中,以100W的氤灯作为激发光源分别对两种溶液进行照射,样品距氙灯的距离为5cm,每隔10分钟测量一次最大发射波长处的荧光强度,共测试70分钟。实验结果如图4所示,发现氙灯照射70min后,FITC水溶液的荧光强度下降达52%,而FAS纳米粒子的荧光强度下降小于5%,表明FAS纳米粒子具有良好的光稳定性。由此可见,将FITC用二氧化硅包覆形成纳米粒子后,由于二氧化硅壳层的保护作用,有效地减少外界光源对荧光分子的光漂白作用,使其抗光稳定性显著提高。
四、FAS纳米粒子的染料泄漏实验:
将纯化的FAS纳米复合物及FITC直接掺杂的SiO2纳米粒子分别溶于超纯水中,超声,每隔一小时取出1mL溶液,离心,弃去上清液,加入1mL水,超声分散后用F-2500型荧光分光光度计在激发波长492nm下检测纳米颗粒悬浮液的荧光强度,通过荧光强度的变化确定有机荧光染料泄露的程度。两种纳米粒子的染料泄露实验结果如图5所示,由图看出,FAS纳米复合物的荧光强度在6小时内基本保持不变,6小时后下降不到8%,而FITC直接掺杂的二氧化硅纳米粒子的荧光强度则下降超过40%。实验结果表明,FAS纳米粒子在溶液中不易发生染料泄露。原因是由于FITC与APTMS形成前驱体FITC-APTMS后,由于APTMS与正硅酸乙酯(TEOS)的共水解作用,使FITC通过牢固的化学键与二氧化硅外壳相连接,有效地防止了FITC荧光染料分子的泄露。
五、FAS纳米粒子对pH的响应:
将FAS纳米颗粒经超声分散后,分别取300μL 1mg/mL纳米颗粒悬浮液加入到1mL不同pH值的磷酸缓冲溶液中,充分混匀后分别测量其在最大激发波长下的发射光谱及荧光强度随pH值的变化情况。实验测得FAS纳米粒子的荧光光谱随pH值变化如图7所示(图6中的1,2,3,4,5,6,7分别与插图中的pH值由低到高一一对应)。结果表明,在实验检测pH值范围3.6~9.7内,FAS纳米粒子对pH有良好的响应,随着pH值的增加,荧光强度逐渐增强,当pH从3.6变至9.7时荧光强度增加了大约30倍,且在pH值6.0~9.0之间呈良好的线性关系。从图中还可看出随着pH值的增加,荧光强度增加,但发射波长没有发生变化。
六、小鼠神经干细胞的培养、细胞的荧光成像与pH检测:
将小鼠神经干细胞悬浮液接种到培养瓶中,放入二氧化碳培养箱中培养过夜(5%CO2,37℃)。然后用0.01mol/L PBS(pH7.4)洗三次。将100μL 1mg/mL经高温消毒的FAS荧光纳米颗粒悬浮液加入到含1ml培养液的小鼠神经干细胞的培养瓶中,放入二氧化碳培养箱中培育30min(5%CO2,37℃),PBS洗涤3次,最后在FV1000激光共聚焦扫描显微镜下观察细胞的荧光成像。通过改变细胞培养液的pH值,调节细胞的pH值,分别测量在不同pH值时细胞的荧光光谱与荧光显微成像。图7为FAS纳米粒子与小鼠神经干细胞共培育30min后的激光共聚焦扫描显微镜图片,可看到在细胞内检测到较强荧光信号,且pH7.8的细胞荧光信号高于pH6.6的细胞。图8为它们的荧光光谱图。这表明FAS纳米颗粒可被小鼠神经干细胞有效摄入,且在活细胞体内保持较强的荧光信号,随pH值的不同,荧光强度不同。由此可知,将FAS纳米粒子与细胞共培育后,通过细胞成像测量其荧光强度可检测细胞内的pH值。
Claims (2)
1.一种异硫氰酸荧光素掺杂的二氧化硅荧光纳米粒子,其特征在于该荧光纳米粒子是异硫氰酸荧光素通过其分子中的活性官能团异硫氰基与3-氨基丙基三甲氧基硅烷分子的氨基发生加成反应形成schiff碱;然后在氨水作用下,该schiff碱与正硅酸乙酯共水解之后发生聚合反应而形成的核壳型纳米纳米粒子,其结构式为:
2.一种制备根据权利要求1所述的异硫氰酸荧光素掺杂的二氧化硅荧光纳米粒子的方法,其特征在于该方法的具体步骤为:
a.FITC与APTMS反应制得前驱体FITC-APTMS;
b.将环己烷、Triton X-100、正己醇按4∶1∶1~5∶1∶1的体积比混和形成混合液,再将该混合液与去离子水按60∶1~50∶1的体积比混合形成清澈透明的微乳液;
c.将步骤a所得前驱体FITC-APTMS加入上述微乳液中,充分搅拌混匀,并控制前驱体与微乳液的质量比为1∶8~1∶10,充分搅拌混匀,加入正硅酸乙酯,其与前驱体的用量体积比为1∶10~2∶10,然后加入氨水,其与正硅酸乙酯体积比为3∶5~1∶5,室温避光磁力搅拌反应24小时后加入丙酮破乳,再用无水乙醇和超纯水交替离心、洗涤,得到纯的FITC-APTMS/SiO2核壳型荧光纳米粒子,最后将该荧光纳米粒子烘干。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20100818 |