CN110713829A - 橙光碳点的制备及其对Fe3+的检测 - Google Patents

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Abstract

橙光碳点的制备及其对Fe3+的检测，属于金属离子检测领域，以间苯二酚为碳源，尿素为氮源，在140‑240℃的高温反应釜中进行溶剂热1‑24小时，冷却、提纯、干燥后得到橙光碳点固体粉末。该橙光碳点激发波长在570纳米，发射波长在585纳米。此外，橙光碳点还具有良好的水溶性和生物相容性且在水溶液中具有高的荧光量子效率。以该碳点为主要功能成分开发了具有在水环境中检测Fe3+的荧光材料。此外，该荧光材料也可以检测生物体外细胞中的Fe3+，通过简单的荧光光度法，检测生物体中细胞中Fe3+异常状态，从而提前预防由于生物体中Fe3+的增多而引起的某些疾病。

Description

橙光碳点的制备及其对Fe3+的检测
技术领域
本发明属于金属离子检测领域，具体涉及一种新型橙光碳点的制备方法及对Fe3+检测。
背景介绍
碳点是一类离散的、尺寸小于10纳米的类球型纳米颗粒。其具有良好的化学稳定性、低毒性、抗光漂白性、良好的水溶性和易于官能化。碳点拥有的这些特性，使其在传感检测、纳米医药、光催化、光学器件及生物成像等领域具有非常大的发展潜力。碳点最初引起足够关注是由于其荧光发射特性，其荧光容易受到周围环境的影响，与其它化学物质的相互作用会引起碳点荧光的淬灭或增强。因此，碳点可以作为荧光探针对待分析物进行定性/定量的分析。尽管科研人员在合成具有不同发光特性的碳点方面投入了大量的精力，但是所制备的大部分碳点依旧在蓝-绿光的波段展现出明显的发射，并且需要紫外光的激发。而在紫外光的激发下生物组织会发出强烈的蓝色背景荧光，这会严重干扰成像制剂信号的反馈，且紫外光会对生物体造成伤害。相比之下，橙光碳点不仅被长波长的光激发还具有一定的组织穿透性，这些特性赋予其在生物成像领域的应用价值。
铁离子在生物系统中起着至关重要的作用，存在于所有组织中，大部分存在于血细胞中，其次是肝脏、脾脏和肺。其中，Fe3+含量调控失调可造成多种疾病的发生。Fe3+在肝脏出现过剩沉着，会造成肝脏的纤维化；在脑中某区域蓄积和许多神经性疾病相关；会对细胞中的DNA和蛋白质造成损害；在血液中增多会影响对某些药物的检测；Fe3+会诱导自由基的产生，从而导致癌症的发生。因此，检测Fe3+对这些疾病的早期诊断具有重要的意义。典型的Fe3+检测技术包含等离子体发射光谱法和比色法。但这些方法复杂、成本高，且受仪器精度的限制。与仪器法相比，光学法成本相对较低，更经济。其中，荧光分光光度法是一种选择性好、灵敏度高快速检测金属离子的新方法。
目前荧光碳点应用于金属离子检测的主要是发蓝-绿色荧光的碳点，其波长较短，不利于穿透生物体深层组织，因此不利于生物成像。橙光碳点发射波长较长，有利于应用于生物成像，有利于生物体内金属离子的检测。因此，用橙光碳点来检测Fe3+具有非常大的应用价值。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种高效橙光碳点的制备方法，该橙光碳点的制备方法简单，制备出的橙光碳点具有良好的水溶性，量子效率高，激发和发射波长较长。
本发明的另一个目的在于利用这种高效橙光碳点，解决现有荧光检测技术中对离子检测局限性而提供的一种利用碳点荧光强弱变化实现对环境中三价铁离子定量检测及对生物体外细胞中Fe3+含量的定性检测。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案:
一种橙光碳点的制备方法，其特征在于，包括以下步骤；
(1)将反应原料间苯二酚、尿素和N,N-二甲基甲酰胺加入到反应釜中，于烘箱中加热到120-240℃(优选140℃-200℃)，保温1-24小时(优选4-18小时)，自然冷却至室温；
(2)将反应液置于离心管中，除去大颗粒的反应残渣，得到碳点溶液。
(3)将步骤(2)得到的碳点溶液置于透析袋中(截留分子量为3KDa)，然后将透析袋放入大烧杯中，加入去离子水，搅拌，每隔4小时换一次水，透析48小时。
(4)将透析后的溶液置于离心管中进行冷冻处理，冷冻2-3小时，然后将离心管置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥即可得到橙光碳点的固体粉末。
间苯二酚和尿素的摩尔比为1：(0.1-2)，优选1：0.6-1。
一种橙光碳点检测三价铁离子的方法，其特征在于，包括以下几个步骤。
(1)分别配置不同浓度的三价铁离子及橙光碳点水溶液，将不同浓度的三价铁离子溶液取相同体积分别加入到一定浓度的橙光碳点水溶液中，三价铁离子的浓度范围为0～100μM。
(2)通过荧光分光光度计测试碳点的最佳激发波长，并用最佳激发波长的光激发。
(3)将步骤(1)中配置的碳点浓度相同但三价铁离子浓度不同的混合溶液用步骤(2)中得到的最佳激发波长激发，记录碳点在不同浓度的三价铁离子溶液中的荧光强度。
(4)绘制碳点的荧光强度随三价铁离子浓度的变化曲线，选取其中的线性部分进行拟合，得出拟合公式。
(5)将待测三价铁离子水溶液按照步骤(2)(3)方法得到待测水溶液中三价铁离子对应的荧光强度值，将所得荧光强度数值带入步骤(4)的拟合公式即得到待检测水溶液中三价铁离子浓度。
一种橙光碳点定性检测细胞中三价铁离子的浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将橙光碳点溶于PBS缓冲液中，配成0-200μg/mL碳点缓冲液；(优选20μg/mL)。
(2)将所得的细胞放入培养皿用1毫升胰酶进行分散处理，放入烘箱中培养2分钟，待细胞完全分散。向培养皿中加入4毫升细胞培养液，用移液枪吹打，使细胞完全分散于培养液(DMEM)中。将细胞液放入离心管中，1000rpm离心5分钟。离心完成后去掉上清液，加入2毫升培养液重新分散，计算细胞数。
(3)将步骤(2)中的细胞分散液取一定体积加入到6孔板中，每个孔加入5万个细胞，每个孔培养液的总体积为2毫升，放入培养箱中培养24小时。之后将细胞培养液替换为碳点缓冲液，放入到培养箱中继续培养1-4小时(优选1小时)。
(4)步骤(3)后用不含碳点的缓冲液对细胞洗涤3次，用800微升4％的甲醛溶液在室温下固定20分钟，之后用缓冲液冲洗三次。放到共聚焦荧光显微镜下进行荧光成像。若是细胞中荧光完全淬灭，根据橙光碳点浓度与三价铁离子浓度关系曲线，可以定性的确定细胞中的三价铁离子浓度大于10μM。
本发明的有益效果如下：
1.本发明提供了一种简单有效的方法来制备长波长的橙光碳点；
2.本发明的橙光碳点在水中具有良好的溶解性且具有良好的生物相容性；
3.本发明的橙光碳点在水溶液中具有高的荧光量子效率；
4.本发明的橙光碳点在水环境及生物体外细胞可以达到定性检测Fe3+的目的。
附图说明
图1为实施例1中橙光碳点不同放大倍数下的透射电镜及其纳米颗粒的尺寸分布图。
图2为实例1中橙光碳点的XRD图。
图3为实例1中橙光碳点的红外光谱图。
图4为实例1中橙光碳点的光谱图，其中a图为橙光碳点的紫外吸收谱，b图为橙光碳点不同激发波长下的发射光谱。
图5为实例2中Fe3+浓度与橙光碳点荧光强度的关系。
图6为实例3中不同金属离子同浓度条件下对橙光碳点荧光强度的影响。
图7为实例4中橙光碳点在细胞中荧光成像和在细胞内含有橙光碳点的基础上加入Fe3+后的细胞成像以及它们分别对应的细胞光学成像。
具体实施方式
为了更好地说明本发明，下面结合实例和附图对本发明做进一步说明。下面给出的本发明的实施例，是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。
实例1
本发明所用橙光碳点的制备方法如下：
(1)将28毫克间苯二酚、18毫克尿素和7毫升N,N-二甲基甲酰胺加入到20毫升反应釜中，室温下超声3分钟。
(2)将反应釜置于鼓风烘箱中升温至140℃，并在140℃下保温5小时。反应完成后，自然冷却至室温。
(3)将步骤(2)得到的反应液取出，置于离心管中并用9000rpm离心5分钟，去掉底层黑色沉淀，得到上清液。
(4)将步骤(3)所得上清液放入透析袋(截留分子量为3KDa)中，然后将透析袋放入大烧杯中，加入去离子水，每隔4小时左右换一次水，透析48小时。
(5)将步骤(4)所得透析后的溶液放入50毫升试管中，然后将试管放入冰箱中冷冻3-4小时。之后，将试管放入真空冷冻干燥机中，冷冻干燥一段时间，得到所需要的固体粉末即为橙光碳点。
图1中的左图是橙光碳点的透射电镜图及粒径分布图，从电镜图片中可以看出制备出了均匀分布的碳纳米颗粒，从碳点的粒径分布图中得出碳点的平均粒径为4.02纳米，从而证实了所合成的物质是碳点。右图是橙光碳点的高分辨透射电镜图，从图中可以看出碳点的晶格间距为0.21纳米，与石墨化碳的(100)晶面相对应。
图2是橙光碳点的XRD图，可以看出在26.7°有一个峰，对应石墨化碳的(100)晶面，这与图1得出的结论相对应。
图3是橙光碳点的红外光谱，从图中可以看出橙光碳点含有大量的官能团，其中羟基是亲水官能团，因此这种碳点可以应用于水环境中，有利于水环境及生物体中金属离子的检测。
图4中a图是橙光碳点的紫外可见吸收光谱，从图中可以看出在500纳米之前有3个吸收峰外，在570纳米处还有一个吸收峰。b图是橙光碳点的荧光光谱图，可以看出这种橙光碳点具有非激发依赖性，其最大激发波长在570纳米处，最大发射波长在585纳米处，发长波长的橙色荧光。
实例2
橙光碳点在水环境中对Fe3+的选择性检测
(1)将橙光碳点固体粉末加入到去离子水中，配成30μg/mL的碳点水溶液，用荧光分光光度计测试其荧光性质，得到最大的激发波长为570纳米。
(2)取多支4毫升离心管，每支离心管中加入上述配置好的碳点溶液2毫升，用移液枪分别将FeCl3加入到含有碳点溶液的离心管中使其浓度为0-100μM。摇动均匀，静置2分钟。
(3)用荧光分光光度计测试不同三价铁离子浓度下的橙光碳点溶液的荧光强度，用570纳米的激发波长激发，记录最大发射波长处的荧光强度变化曲线。
(4)绘制橙光碳点溶液浓度随Fe3+的浓度(0-100μM)变化曲线，并对0-4μM之间的数据进行拟合，得到拟合公式ΔI＝0.0717[Fe3+]-0.0787。
(5)将待测含三价铁离子溶液加入到步骤(1)中配制的碳点溶液中摇匀，然后将混合溶液加入到石英荧光比色皿中。
(6)利用荧光分光光度计测试(5)中混合液的荧光荧光强度，激发波长选为570纳米，记录其最大荧光强度，并计算ΔI＝(I0-I)/I0，其中I0是纯碳点的荧光强度，I为加入三价铁离子后混合溶液的荧光强度。
(7)将ΔI的值代入步骤(4)的拟合公式中，计算待检测液中三价铁离子的含量。
(8)若计算得到ΔI＝0.2，则表明三价铁离子的浓度为3.9μM。
图5中的a图为碳点荧光强度与Fe3+浓度关系的荧光图，从图中可以看出，随着Fe3+浓度的增高，碳点的荧光强度逐渐降低；从b图得出，Fe3+的浓度在0-10μM升时，橙光碳点的荧光强度与Fe3+的浓度呈线性关系，检测限为0.022μM。
实例3
(1)向2毫升含有30μg/mL的碳量子点溶液中分别加入20微升浓度为5mM K+、Na+、Pb2+、Ag+、Mg2+、Fe3+、Fe2+、Cu2+、Ca2+、Cd2+、Co2+溶液，得到不同的混合溶液，搅拌均匀后静置2分钟。
(2)用荧光分光光度计测试上述混合溶液的荧光强度，激发波长选为570纳米，记录溶液荧光强度变化ΔI。
(3)从图5中可以看出，碳点溶液对三价铁离子有很好的选择性。
图6是11种金属离子在相同的浓度下对碳点荧光强度的影响，从图中可以看出，除三价铁离子外其它金属离子对橙光碳点的荧光几乎没有影响，因此，避免了其它金属离子对橙光碳点检测Fe3+的干扰。
实例4
(1)将橙光碳点溶于PBS缓冲液中，配成浓度为20μg/mL缓冲液。
(2)将培养皿中的C6细胞用1毫升胰酶进行分散处理，放入培养箱中培养2分钟，待细胞完全分散。向培养皿中加入4毫升细胞培养液(本发明优选均为高糖型DMEM)，用移液枪吹打，使细胞完全分散于培养液中。将细胞液放入离心管中，1000rpm离心5分钟。离心完成后去掉上清液，加入2毫升培养液重新分散，计算细胞数。
(3)将步骤(2)中的C6细胞液取一定体积加入到6孔板中，每个孔加入5万个细胞及一定量的培养液，使每个孔培养液的总体积为2毫升，放入培养箱中培养24小时。之后将细胞培养液替换为碳点缓冲液，放入到培养箱中继续培养1小时。
(4)步骤(3)后用不含碳点的缓冲液对细胞洗涤3次，用800微升4％的甲醛溶液在室温下固定20分钟，之后用缓冲液冲洗三次。放到共聚焦荧光显微镜下进行荧光成像。C6细胞中荧光完全淬灭，根据橙光碳点浓度与三价铁离子浓度关系曲线，可以定性的确定C6细胞中的三价铁离子浓度大于10μM。
图7为橙光碳点在C6细胞中的荧光成像图和加入Fe3+后C6细胞的荧光成像图及它们分别对应的细胞光学成像。C6细胞的荧光成像显示，对照组中不加Fe3+，C6细胞显示荧光，而加Fe3+的实验组，C6细胞则不显荧光，从而证明橙光碳点可以检测细胞中的Fe3+。
本发明的上述实施例仅为清楚说明本发明所作的举例，并非是对本发明实施方式的限定。在上述说明的基础上引申出的显而易见的变化仍处于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种橙光碳点的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将反应原料间苯二酚、尿素和N,N-二甲基甲酰胺加入到反应釜中，超声分散，于烘箱中加热到120-240℃，保温1-24小时，自然冷却至室温，得到红色溶液；间苯二酚和尿素的摩尔比为1：(0.1-2)；
(2)将反应液取出，置于离心管中，除去大颗粒的不溶物，得到碳点溶液；
(3)将步骤2中得到的碳点溶液移到透析袋中(截留分子量为3KDa)；透析48小时；
(4)将透析后的碳点溶液移入离心管中，先冷冻，然后将其放入冷冻干燥机中，冷冻干燥一段时间后得到橙光碳点的固体粉末。
2.按照权利1要求所述的制备方法，其特征在于，间苯二酚与尿素的摩尔比为1：(0.6-1)。
3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)120-200℃烘箱中反应4-18小时。
4.按照权利1要求所述的制备方法，其特征在于，每28毫克间苯二酚对应5-10毫升N,N-二甲基甲酰胺。
5.按照权利1-4任一项方法制备得到的橙光碳点。
6.一种橙光碳点检测三价铁离子的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将体积相同但浓度不同的三价铁离子溶液加入到一定浓度的橙光碳点溶液中，形成混合溶液；在混合溶液中，橙光碳点的浓度不变，三价铁离子的浓度范围为0-100μM；所述的碳点为按照权利要求1-4任一方法制备得到的橙光碳点；
(2)通过荧光分光光度计测试碳点的最佳激发波长，并将荧光分光光度计的激发波长调整为最佳激发波长，记录不同浓度的三价铁离子溶液的荧光强度；
(3)绘制碳点溶液随铁离子浓度的增加而荧光强度下降的变化曲线，选取其中的线性部分进行拟合并得出拟合公式；
(4)将待测三价铁离子溶液按照步骤(1)的方法配制碳点和三价铁离子混合溶液；按照步骤(2)的最佳激发波长通过荧光分光光度计测定荧光强度值，将所得荧光强度带入步骤(3)的拟合公式得到铁离子浓度。
7.按照权利要求6的方法，其特征在于，激发波长选为570nm。
8.一种橙光碳点定性检测细胞中三价铁离子的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将橙光碳点溶于缓冲液中，配成0-200μg/mL碳点缓冲液；所述的橙光碳点为按照权利要求1-4任一项方法制备得到的荧光碳点；
(2)将所得的细胞放入培养皿，加入胰酶然后将培养皿放入烘箱中培养几分钟。待细胞完全分散后，向培养皿中加入细胞培养液，用移液枪吹打，使细胞完全分散于培养液中。将细胞液放入离心管中，1000rpm离心5分钟。离心完成后去掉上清液，加入2毫升培养液重新分散，计算细胞密度；
(3)将步骤(2)中的细胞分散液取一定体积加入到6孔板中，每个孔加入5万个细胞，每个孔培养液的总体积为2毫升，放入培养箱中培养24小时。之后将细胞培养液替换为碳点缓冲液，放入培养箱中继续培养1-4小时；
(4)步骤(3)后用不含碳点的缓冲液对细胞洗涤3次，用800微升4％的甲醛溶液在室温下固定20分钟，之后用缓冲液冲洗三次。放到荧光显微镜下进行荧光成像。若是细胞中荧光完全淬灭，根据橙光碳点浓度与三价铁离子浓度关系曲线，可以定性的确定细胞中的三价铁离子浓度大于10μM。
9.按照权利要求8的方法，其特征在于，橙光碳点的浓度为20μg/mL。
10.按照权利要求8的方法，其特征在于，加入碳点缓冲液后放入培养箱中继续培养1小时。
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