CN110272734B - 一种用于no检测的高量子产率碳量子点制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于NO检测的高量子产率碳量子点制备方法及其应用。其包括以下步骤:以两种有机物的组合物作为碳源,将上述组合物加热溶解在水中得到混合溶液,其中有机物选用邻苯二胺和柠檬酸,邻苯二胺和柠檬酸的质量比为0.7~1.2:0.5~1.0;将上述混合溶液放置微波炉中,微波功率600‑800W,反应时间2~5min,自然冷却后得到黑色块状固体;向上述黑色块状固体中加水搅拌溶解,得到悬浊液,然后将悬浊液离心分离提纯;取上述离心完的溶液,过滤得到碳量子点溶液,透析去除杂质,得到较纯的碳量子点溶液。本发明提供的快速制备碳量子点的方法可作为荧光探针,用于溶液中NO浓度检测和肿瘤细胞的成像。
Description
技术领域
本发明属于碳量子点制备领域,具体涉及一种用于NO检测的高量子产率碳量子点制备方法及其应用。
背景技术
碳量子点(carbon quantum dots,CQDs)是一种新型的碳纳米材料,尺寸在10nm以下,具有良好的光致发光性质。自碳量子点发现以来,由于自身独特的性能,引起了广大研究者的浓厚兴趣。碳量子点有着不同于传统量子点的优异性能,如良好的水溶性、化学惰性、低毒性、易于功能化、抗光漂白性和光稳定性等,在光电子器件、生物检测、医药等领域具有广阔的应用前景。
现有的碳量子点的合成方法可分为两类:自上而下法和自下而上法。自上而下法是以大尺度的碳材料(如石墨、石墨烯、碳管等)作为前驱体,通过物理或化学方法在其表面剥落下纳米碳颗粒而合成碳量子点,主要包括电弧放电法、激光刻蚀法、电化学氧化法、强酸氧化法。这种方法的前驱体较为丰富,所制备的碳量子点表面含有大量的含氧基团,具有水溶性好、易于表面修饰、操作简便及可批量生产等优点,但是该方法对实验设备有特殊要求,制备过程中会破坏碳的芳环结构,且制备得到的碳量子点量子产率低,无法精准控制其形貌尺寸。自下而上法是通过一些有机分子作为前驱体,进行一系列的化学反应制备碳量子点,主要有燃烧法、有机物碳化法、微波法、水热法。这种方法对所需要的碳源要求较低,已经报道有多种有机物被选为碳源,例如蔗糖、柠檬酸等。
碳量子点的荧光量子产率是其荧光性能的重要指标之一。荧光量子产率是指激发态的电子跃迁到低能级时,发出荧光的电子数目与全部激发态的电子数之比。目前,文献报道的合成碳量子点量子产率相对较低,而且提纯过程复杂,不利于批量生产,大大影响了碳量子点的应用。因此研究一种快速制备高量子产率碳量子点的方法是十分有必要的。
一氧化氮(NO)是机体内一种作用广泛且性质独特的信号分子,在神经细胞间的信息交流与传递、血压恒定的维持、免疫系统的宿主防御反应等方面,都起着十分重要的作用。此外,NO还参与机体多种疾病的发展过程,因此准确的测定生物体系中的NO是很有必要的。但是实现对生物样品中NO的准确检测是很困难的,原因在于NO在生物体内浓度极低,而且是一种性质十分活泼的自由基小分子。生物、医学及分析化学工作者对NO的检测研究做了大量的工作,主要有紫外可见光谱法、化学发光法、电化学方法、色谱法和荧光分析法。其中,荧光分析法具有灵敏度高和选择性好的优点,因此近年来这种方法得到许多科研工作者的广泛研究。NO本身不具有荧光,荧光分析法主要是通过引入荧光探针与NO反应,生成与荧光探针自身光学性质不同的化合物,通过荧光探针荧光性质的变化来定性和定量的测定NO。
目前报道的NO荧光探针有很多,有金属配合物,二氯荧光素,半导体量子点等,这些荧光探针都具有一定的毒性,因而在实际检测过程中具有一定的局限性。
在细胞成像和活体成像领域,为了保证细胞和生命体的活性,要求用于成像的纳米材料尽可能无毒且有较高的生物相容性。传统的一些荧光量子点中含有重金属元素,对细胞的毒性较大,不可避免的会影响细胞的存活率。碳量子点不含重金属元素,天然的碳属性使其具有良好的生物相容性和很低的细胞毒性,为细胞成像和活体成像提供了有效的途径,可作为一种新颖的纳米材料广泛应用于细胞成像和活体成像领域。
发明内容
本发明针对现有技术的不足提供了一种快速制备高量子产率碳量子点的方法。本发明通过在原料中加入邻苯二胺,由此制备的碳量子点表面带有邻苯二胺基团,可用于NO浓度检测和细胞成像的目的。
一种用于NO检测的高量子产率碳量子点的制备方法,其包括以下步骤:
(1)以两种有机物的组合物作为碳源,将上述组合物加热溶解在水中得到混合溶液,其中有机物选用邻苯二胺和柠檬酸,邻苯二胺和柠檬酸的质量比为0.7~1.2:0.5~1.0;
(2)将上述混合溶液放置微波炉中,微波功率600-800W,反应时间2~5min,自然冷却后得到黑色块状固体;
(3)向上述黑色块状固体中加水搅拌溶解,得到悬浊液,然后将悬浊液离心分离提纯;
(4)取上述离心完的溶液,过滤得到碳量子点溶液,透析去除杂质,得到较纯的碳量子点溶液。
按上述方案,其中离心机转速设置为8000-10000rpm,离心时间5~15min。
按上述方案,针孔过滤器的孔径为0.22μm。
按上述方案,所述的透析为用3500DA的透析袋透析24~72h。
一种发蓝光的碳量子点,粒径3-6nm,表面修饰有邻苯二胺基团。
一种用于检测NO含量的非诊断检测方法,利用本发明方法制备的碳量子点作为荧光探针,根据不同浓度的NO对碳量子点荧光强度的影响,进行NO含量的定量检测。
具体步骤为:在待检测体系中加入碳量子点,用荧光光谱仪检测其荧光强度,基于不同浓度的NO溶液与碳量子点溶液荧光强度变化的标准关系曲线,获得NO含量。
按上述方案,所述的不同浓度的NO溶液与碳量子点溶液荧光强度变化的标准关系的获得方法:在所述的不同浓度的NO溶液与碳量子点溶液荧光强度变化的标准关系的获得方法:在不同浓度的标准NO溶液中,加入碳量子点,对应测定不同浓度的标准NO溶液加入后碳量子点荧光强度的下降比值,然后进行线性拟合,得到不同浓度的NO溶液与碳量子点溶液荧光强度变化的标准关系曲线。
具体可为:在pH=7.4的PBS缓冲溶液中,加入碳量子点,再加入不同量的NO定量释放剂,对应测定不同浓度的标准NO溶液加入后碳量子点荧光强度的下降比值(即加入NO 溶液前后碳量子点的荧光强度比值I0/I),然后进行线性拟合,得到不同浓度的NO溶液与碳量子点溶液荧光强度变化的标准关系曲线。
本发明制备的碳量子点荧光量子产率测定选用硫酸奎宁作为标定荧光剂(溶剂为0.1mol/L硫酸,荧光量子产率为0.54),通过分别测试标定荧光剂和碳量子点在不同浓度下的荧光积分强度和激发光对应波长的紫外吸收强度,计算得到碳量子点的荧光量子产率为63.7%。
本发明选用柠檬酸和邻苯二胺为原料,利用微波反应法制备的碳量子点表面带有邻苯二胺基团,该基团作为电子供体可增加碳量子点的荧光,而在NO存在下,邻苯二胺基团会与NO反应生成无电子的芳基三唑部分,从而利用邻苯二胺基团作为NO识别基团,使该碳量子点可作为荧光探针,用于溶液中NO浓度的检测。
此外,该方法制备的碳量子点具有优异的荧光性能以及良好的生物相容性,因此可用于细胞如肿瘤细胞成像。具体方法:用含有碳量子点溶液的培养基培养细胞一段时间,然后置于荧光显微镜下观察结果;其中:培养之前细胞需先进行饥饿处理,荧光显微镜的激发波长设置为380nm。
本发明的有益效果:
(1)本发明提供的快速制备碳量子点的方法,具有制备工艺简单、制备时间较短、易重复性等优点。制备得到的碳量子点量子产率较高、光稳定性好、低毒性以及生物相容性好等诸多优势。
(2)该方法制备的碳量子点可作为荧光探针,用于溶液中NO浓度检测和肿瘤细胞的成像。
附图说明
图1是本发明实施例1中制备的碳量子点的透射电子显微镜图片;
图2是本发明实施例1中制备的碳量子点的荧光3D扫描图;
图3是本发明实施例1中制备的碳量子点的荧光和紫外吸收图谱;
图4是本发明实施例1中制备的碳量子点的细胞毒性测试48h结果;
图5是本发明实施例4中碳量子点荧光强度比值与NO浓度线性拟合图;
图6是本发明实施例5中碳量子点在肿瘤细胞中成像图片,图6(a)所示为明场像所拍的照片,图6(b)为380nm波长激发,曝光时间为900ms下的细胞荧光成像照片。
具体实施方式
实施例1
将1.0g邻苯二胺与0.7g的柠檬酸加热溶解于10mL的去离子水中,得到澄清溶液;将所得的澄清溶液移至微波炉中,微波功率700W,反应3min后取出,自然冷却至室温,加入10mL的去离子水溶解,得到一种浑浊液;将浑浊液在离心机中离心10min,离心机转速设置为9000转/分钟。离心完毕后用孔径为0.22μm的针孔过滤器过滤,得到澄清的碳量子点溶液。然后进一步用3500DA的透析袋透析48h去除可溶性杂质,得到较纯的碳量子点溶液。
碳量子点性能测试:碳量子点的透射电子显微镜图片如图1所示,用这种方法制备的碳量子点分布均匀,粒径尺寸在5nm左右。荧光3D扫描图、荧光和紫外吸收图谱如图2、3所示,最佳激发波长在390nm,发射波长在455nm,紫外吸收光谱中,在244nm处的吸收峰对应碳量子点骨架中C-C上π-π*跃迁,在272nm附近的吸收峰对应的C=O上的n-π*跃迁和C=C上的π-π*跃迁。以硫酸奎宁为参比,用荧光光谱仪及紫外吸收分光光度计测试并计算得到碳量子点的量子产率为63.7%。
碳量子点细胞毒性测试:在96孔板中配置100μL的胃癌细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24h后,向培养板加入10μL的碳量子点溶液。将培养板在培养箱孵育48小时后,向每孔加入10μL CCK8溶液,继续培养2h,然后用酶标仪测定在450nm处的吸光度。最后细胞培养48h处理结果如图4所示,在加入碳量子点的量最大的情况下,细胞的存活率也在80%以上,因此说明碳量子点的细胞毒性较低,生物相容性较好。
实施例2
除将实施例1中的柠檬酸的量改为1.2g,其他实施方法同实施例1。
实施例3
除将实施例1中微波反应时间改为2min,其他实施方法同实施例1。
实施例4
将实施例1中合成的碳量子点用于溶液中一氧化氮浓度的检测。取1mL PBS缓冲溶液(pH=7.4)置于洁净的比色皿中,然后加入20μL碳量子点溶液,用荧光光谱仪检测其荧光强度。然后再向比色皿中加入NO定量释放剂SNAP(S-Nitroso-N-Acetyl-Dl-Penicillamine)溶液,用荧光光谱仪检测其荧光强度变化。通过检测不同浓度的NO溶液与碳量子点溶液荧光强度变化的关系,根据Stern-Volmer方程进行线性拟合,如图5所示,在NO浓度为 500nmol/L~600μmol/L之间时,碳量子点溶液可以对其进行定量检测。
实施例5
将实施例1中合成的碳量子点应用于肿瘤细胞成像。取24mm×24mm盖玻片,用清洁剂清洗干净后在纯水中浸泡30min,然后换成75%无水乙醇浸泡。酒精灯下灼烧盖玻片灭菌,冷却后放入洁净六孔板内待用。将肿瘤细胞用胰蛋白酶消化,配制成浓度为1×104个/mL 的细胞悬液。在含盖玻片的六孔板上每孔添加2mL细胞悬液后放入培养箱中培养24h。已贴壁完全的细胞爬片后,将培养基换成无血清培养基处理6h。然后将培养基换成含碳量子点溶液的培养基分别处理12h后,用荧光显微镜观察细胞吞噬情况。如图6(a)所示为明场像所拍的照片,图6(b)为380nm波长激发,曝光时间为900ms下的细胞荧光成像照片。
Claims (8)
1.一种高量子产率碳量子点在NO检测中的应用,其特征在于:所述的高量子产率碳量子点的制备方法包括以下步骤:
(1)以两种有机物的组合物作为碳源,将上述组合物加热溶解在水中得到混合溶液,其中有机物选用邻苯二胺和柠檬酸,邻苯二胺和柠檬酸的质量比为0.7~1.2:0.5~1.0;
(2)将上述混合溶液放置微波炉中,微波反应2~5min,自然冷却后得到黑色块状固体;
(3)向上述黑色块状固体中加水搅拌溶解,得到悬浊液,然后将悬浊液离心分离提纯,
(4)取上述离心完的溶液,过滤,得到碳量子点溶液,透析去除杂质,得到较纯的碳量子点溶液。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:步骤(3)中离心机转速设置为8000-10000rpm,离心时间为5~15min。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:步骤(4)中所述的过滤为针孔过滤器过滤,针孔过滤器的孔径为0.22μm。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:步骤(4)中所述的透析为用3500DA的透析袋透析24~72h。
5.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述高量子产率碳量子点的粒径3-6nm,表面修饰有邻苯二胺基团,发蓝光。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于:所述高量子产率碳量子点的发射波长为450nm。
7.一种用于检测NO含量的非诊断检测方法,其特征在于:利用高量子产率碳量子点作为荧光探针,根据不同浓度的NO对碳量子点荧光强度的影响,进行NO含量的定量检测,具体步骤为:在待检测体系中加入碳量子点,用荧光光谱仪检测其荧光强度,基于不同浓度的NO溶液与碳量子点溶液荧光强度变化的标准关系曲线,获得NO含量;
所述的高量子产率碳量子点的制备方法包括以下步骤:
(1)以两种有机物的组合物作为碳源,将上述组合物加热溶解在水中得到混合溶液,其中有机物选用邻苯二胺和柠檬酸,邻苯二胺和柠檬酸的质量比为0.7~1.2:0.5~1.0;
(2)将上述混合溶液放置微波炉中,微波反应2~5min,自然冷却后得到黑色块状固体;
(3)向上述黑色块状固体中加水搅拌溶解,得到悬浊液,然后将悬浊液离心分离提纯,
(4)取上述离心完的溶液,过滤,得到碳量子点溶液,透析去除杂质,得到较纯的碳量子点溶液。
8.根据权利要求7所述的非诊断检测方法,其特征在于:所述的不同浓度的NO溶液与碳量子点溶液荧光强度变化的标准关系的获得方法:在不同浓度的标准NO溶液中,加入碳量子点,对应测定不同浓度的标准NO溶液加入后碳量子点荧光强度的下降比值,然后进行线性拟合,得到不同浓度的NO溶液与碳量子点溶液荧光强度变化的标准关系曲线。
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