CN107603610A - 来自陈醋碳纳米粒子的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种来自陈醋碳纳米粒子的制备方法，以陈醋为主要原料，通过大孔树脂吸附法分离提纯并收集碳纳米粒子的方法，该碳纳米粒子可与多巴胺发生荧光共振能量转移，碳纳米粒子的光学特性发生改变，在365nm紫外光照射下，由蓝色荧光逐渐变为绿色荧光，该颜色可调的碳纳米粒子可直接用于活细胞荧光成像。本发明制备的陈醋碳纳米粒子方法简单，成本低，毒性小，生物相容性好，与多巴胺反应后的荧光碳纳米粒子水溶性良好，可作为荧光染料用于活细胞成像，在荧光标记及生物学方面进行应用。

Description

来自陈醋碳纳米粒子的制备方法

技术领域

本发明涉及一种来自陈醋碳纳米粒子的制备方法。

背景技术

细胞是组成有机的形态和功能的基本单位，大部分物质的合成与分解都是在细胞中完成的，如蛋白质的合成，葡萄糖的分解等，因此准确而深入地理解细胞中的各类化学变化对一些重大疾病的早期诊断和治疗具有非常重要的作用，然而，传统的细胞荧光标记物质具有一定的毒副作用，会对细胞造成一定程度的损伤，因此发明一种无毒副作用，生物相容性好且标记效果好的荧光材料显得尤为重要。

传统的有机荧光染料制备过程复杂，荧光不稳定，容易光漂白，且一般生物相容性较差，使其应用受到了一定程度的限制，而与传统的有机荧光染料相比，荧光纳米材料克服了这些缺点，并广泛应用于生物标记、生物医药等领域，其中使用较多的荧光纳米材料是量子点，量子点作为近年来发展起来的一类半导体碳纳米粒子，具有独特的光学性质和电学性质，然而常见的量子点(如CdSe)含有毒性元素，会危害环境，影响细胞或生物大分子的活性，因此，寻找一种无毒副作用，生物相容性好的荧光探针是亟需解决的问题，碳纳米粒子是荧光纳米材料家族中的一颗新星，具有化学稳定性、低毒性以及优异的生物相容性等独特的优点，可作为较为理想的细胞标记材料。

常用来制备碳纳米粒子的方法分为自上而下和自下而上两种方法，其中自上而下的方法是指大分子碳材料通过一定的物理、化学等方法破碎成小分子的碳纳米颗粒，包括：电解法、酸刻蚀、激光刻蚀和高温热解等方法；而自下而上的方法是指将小分子的碳材料通过一定的化学手段合成团聚成更大分子量的碳纳米颗粒，其中包括：化学合成法、水热法、溶剂热法等方法，然而以上的制备方法条件均较为严苛，不仅所需时间长，还需要高温，过程十分复杂，我们日常所食的食物中含有大量的碳水化合物，在热加工过程中，会形成碳纳米粒子，陈醋作为中国的传统调味品已经被人们食用上千年，以其为原料制备的碳纳米粒子既无毒副作用，又具有良好的生物相容性，因此，在细胞成像等生物应用方面有着广阔的前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种来自陈醋碳纳米粒子的制备方法。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：一种来自陈醋碳纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

A、将陈醋浓缩，去除不溶性杂质后，通过分离提纯，收集强荧光组份，干燥得到碳纳米粒子；

B、将碳纳米粒子与盐酸多巴胺按质量比30:1—30:8 混合，溶解于去离子水中，用三羟甲基氨基甲烷调节pH至8.5，避光搅拌24h，加入有机溶剂停止反应，除去沉淀，挥发后收集液体干燥得到不同荧光的碳纳米粒子。

所述步骤A中将陈醋浓缩采用旋转蒸发、冷冻干燥、真空干燥中的一种或二种以上的组合。

所述步骤A中分离提纯采用超滤、透析、超速离心、凝胶色谱、大孔树脂吸附中的一种或任意二种或二种以上的结合。

所述步骤A中的强荧光组份为陈醋中天然存在的碳纳米粒子。

所述步骤B中加入有机溶剂停止反应的有机溶剂为异丙醇。

所述异丙醇的加入量与混合溶液的体积比为1:6。

本发明一种来自陈醋碳纳米粒子的制备方法，所需原料易购；碳纳米粒子在陈醋加工过程中已经形成，无须进行人为合成；陈醋碳纳米粒子尺寸小，具有良好的荧光特性及生物相容性；陈醋碳纳米粒子具有极高的安全性；陈醋碳纳米粒子颜色可调；陈醋碳纳米粒子活细胞成像效果好，碳纳米粒子以及与多巴胺通过荧光共振能量转移反应后的颜色可调的碳纳米粒子，可作为荧光染料在活细胞成像及相关生物学方面进行应用。

附图说明

图1是本发明一种来自陈醋碳纳米粒子的制备方法的陈醋碳纳米粒子的透射电子显微镜的照片。

图2是本发明一种来自陈醋碳纳米粒子的制备方法的陈醋碳纳米粒子的XRD的图谱。

图3是本发明一种来自陈醋碳纳米粒子的制备方法的陈醋碳纳米粒子的紫外，荧光光谱。

图4是本发明一种来自陈醋碳纳米粒子的制备方法的陈醋碳纳米粒子的荧光寿命图谱。

图5是本发明一种来自陈醋碳纳米粒子的制备方法的陈醋碳纳米粒子的FT-IR图谱。

图6是本发明一种来自陈醋碳纳米粒子的制备方法的陈醋碳纳米粒子的XPS图谱。

图7是本发明一种来自陈醋碳纳米粒子的制备方法的陈醋碳纳米粒子的pH稳定性的图谱。

图8是本发明一种来自陈醋碳纳米粒子的制备方法的陈醋碳纳米粒子的细胞毒性结果。

图9是本发明一种来自陈醋碳纳米粒子的制备方法的陈醋碳纳米粒子与多巴胺反应后的碳纳米粒子的细胞毒性结果。

图10是本发明一种来自陈醋碳纳米粒子的制备方法的陈醋碳纳米粒子的细胞成像图。

具体实施方式

实施例1，为来自陈醋碳纳米粒子的制备方法，具体步骤为：S1、将约100mL 的陈醋在45℃条件下旋转蒸发至约10mL，依次通过0.45µm、0.22µm的水系滤膜过滤，收集滤液。随后用大孔吸附树脂柱分离提纯，在365nm紫外灯照射下辅助观察，收集强荧光组分，冷冻干燥后得到碳纳米粒子固体粉末；S2、将碳纳米粒子与盐酸多巴胺以质量比15:4的比例混合，并溶解于去离子水中。用三羟甲基氨基甲烷调节pH至8.5，避光搅拌24小时，加入上述混合液6倍体积的异丙醇，高速离心（10000rpm，10min）除去沉淀，旋转蒸发除去异丙醇，冷冻干燥后得到颜色改变的碳纳米粒子。

实施例2，为陈醋碳纳米粒子性质的表征，S1、陈醋碳纳米粒子的形态及大小尺寸，图1是陈醋碳纳米粒子的透射电子显微镜照片及粒径统计图，结果显示，经过分离提纯的陈醋碳纳米粒子大小均匀，形态规则成近球型，统计得到陈醋碳纳米粒子粒径尺寸集中在1-2nm；S2、陈醋碳纳米粒子的X射线光电子衍射(XRD)实验，图2是陈醋碳纳米粒子的XRD图谱，可见2 theta = 21.96°处仅有一馒头峰，根据XRD图谱，说明该碳纳米粒子具有无定形的碳结构；S3、陈醋碳纳米粒子的紫外光谱和荧光光谱特征，图3是陈醋碳纳米粒子的紫外光谱和荧光光谱，由紫外光谱图可见在270nm处出现了n→π*跃迁的特征吸收峰，由陈醋碳纳米粒子的荧光光谱可见随着波长增加出现了明显的红移现象，陈醋碳纳米粒子的最大激发波长出现在320nm处；S4、陈醋碳纳米粒子的荧光寿命，图4是陈醋碳纳米粒子的荧光寿命图谱，配置3mg/mL的陈醋碳纳米粒子水溶液，在320nm的激发光下激发，最大发射峰为400nm发射，测得荧光寿命，经实验中发现陈醋碳纳米粒子是双指数猝灭，经拟合计算陈醋碳纳米粒子的荧光寿命是6.30ns；S5、陈醋碳纳米粒子的傅立叶变换红外光谱表征，图5是陈醋碳纳米粒子的红外图谱，图中结果表明经过纯化后的陈醋碳纳米粒子在3391cm-1含有O-H的伸缩振动峰，2980cm-1和2936cm-1处有2种C-H的伸缩振动峰，1715 cm-1有C=O的伸缩振动峰，1607cm-1有O-C=O的伸缩振动峰，1404cm-1有C-N的变形振动峰，1047cm-1有C-O的伸缩振动峰；S6、陈醋碳纳米粒子的X射线光电子能谱(XPS)表征，图6是陈醋碳纳米粒子XPS的图谱，图中结果表明啤酒碳点中主要含有C和O两种元素并且含有少量的N元素；S7、陈醋碳纳米粒子的pH稳定性实验，图7是陈醋碳纳米粒子的pH的稳定图，配置不同pH(2-11)的B-R缓冲溶液，取碳纳米粒子溶液分别加入不同的pH溶液中(3mg/mL)，用荧光分光光度计测荧光强度，取三次平均值，图中可以看出陈醋碳纳米粒子在强酸性条件下荧光较稳定，在pH＝3处荧光强度明显下降，碱性条件下荧光强度较酸性条件高。

实施例3，为细胞毒性实验，选用MCF-7细胞和含有10％的胎牛血清的高糖DMEM培养基，添加抗生素和非必需氨基酸，将MCF-7细胞以10000个/孔接种于96 孔板中，待贴壁完全后(12h)，弃去原培养基，将陈醋碳纳米粒子、与多巴胺反应后的碳纳米粒子分别以培养基溶解后，再以培养基稀释成不同浓度，并加入到上述96孔板中，孵育48h后，以MTT法测定增值率，如图8所示，陈醋碳纳米粒子在较大浓度下(10mg/mL)，MCF-7细胞存活率仍能达到70％以上，说明陈醋碳纳米粒子毒性较低，如图9所示，与多巴胺反应后的碳纳米粒子对MCF-7细胞的毒性同样较低。

实施例4，为陈醋碳纳米粒子的细胞成像实验，MCF-7细胞经胰酶消化后形成单细胞悬液，以1×105cells/mL的密度接种于培养皿中，向培养基中加入2mL浓度为5mg/mL的陈醋碳纳米粒子，在37℃，5％的CO2条件下孵育24h，随后倾去培养基，并用磷酸盐缓冲液洗脱2次，将培养皿置于激光共聚焦显微镜下，分别在405nm，488nm波段下激发，观察碳纳米粒子的细胞标记情况，如图10所示，与对照组相比，经陈醋碳纳米粒子标记的细胞都能发出明显的荧光，在405nm波段激发下发出明显的蓝光，在488nm波段激发下发出明显的绿光。由此说明陈醋碳纳米粒子可以作为良好的荧光染料应用于细胞荧光成像。

Claims (6)

1.一种来自陈醋碳纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、将陈醋浓缩，去除不溶性杂质后，通过分离提纯，收集强荧光组份，干燥得到碳纳米粒子；

B、将碳纳米粒子与盐酸多巴胺按质量比30:1—30:8 混合，溶解于去离子水中，用三羟甲基氨基甲烷调节pH至8.5，避光搅拌24h，加入有机溶剂停止反应，除去沉淀，挥发后收集液体干燥得到不同荧光的碳纳米粒子。

2.根据权利要求1所述的一种来自陈醋碳纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述步骤A中将陈醋浓缩采用旋转蒸发、冷冻干燥、真空干燥中的一种或二种以上的组合。

3.根据权利要求1所述的一种来自陈醋碳纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述步骤A中分离提纯采用超滤、透析、超速离心、凝胶色谱、大孔树脂吸附中的一种或任意二种或二种以上的结合。

4.根据权利要求1所述的一种来自陈醋碳纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述步骤A中的强荧光组份为陈醋中天然存在的碳纳米粒子。

5.根据权利要求1所述的一种来自陈醋碳纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述步骤B中加入有机溶剂停止反应的有机溶剂为异丙醇。

6.根据权利要求5所述的一种来自陈醋碳纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述异丙醇的加入量与混合溶液的体积比为1:6。