CN103361047A - 基于天然糖类材料的功能性碳荧光纳米颗粒及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于天然糖类材料的功能性碳荧光纳米颗粒(Carbon Nanoparticles,简称CNPs)的制备、表征及其在生物检测技术中的应用。特征是将1g的碳源(纤维素、淀粉、壳聚糖、环糊精)与0.1g NaOH溶于15ml的去离子水中,然后置于高压釜中反应4h,温度为160℃。反应所得的碳纳米颗粒经酸碱中和、微波处理。本发明原料来源丰富、廉价易得、制备方法简单;合成的碳纳米颗粒具有良好的荧光特性,包括荧光稳定、无光闪烁、波长可调谐、激发光谱宽、发射光谱窄等特点,可作为荧光标记物在生物医药领域中进行应用。
Description
技术领域
本发明涉及纳米荧光材料,具体地说是基于4种天然多糖的碳纳米颗粒的制备、表征及应用。
背景技术
荧光材料在生物技术及光学材料领域受到了越来越多的关注,其中,荧光标记在生物检测、传感、造影等诸多的应用领域中得到长足的发展。荧光纳米粒子的相关研究正是在这种背景下逐渐受到国内外研究者的关注,并在近年来得到了快速发展。其应用焦点目前主要集中在荧光显微镜检测、细胞标记、DNA标记与体内活体成像方面的应用。现在已报道的技术及其存在的问题包括如下几个方面:
(1)荧光纳米粒子ZnS-CdSe(又称量子点)技术(文献1:Warren C.W.Chan and Shuming Nie,Science,1998,281,2016-2018)。量子点的发明,开创了纳米粒子作为荧光标记物应用的新领域。但是量子点在水中分散不好、易结块、发光不稳定易闪烁、毒性大等缺点,在一定程度上限制它的使用。
(2)金刚石结构的荧光碳纳米粒子技术(文献2:Vial S,Mansuy C,Sagan S,et.al.Chem.Biochem,2008,9:2113-2119;文献3:YangW S,Auciello O,Butler J E,et.al.Nat.Mater,2002,1,253-257;文献4:HartlA,Schmich E,Garrido J A,et.al.Nat.Mater.,2004,3,736-742)。纳米金刚石粉末的制备方法主要有催化还原合成法与爆轰法,第一种是催化还原合成法,其合成所需时间较长、合成工艺有一定的危险性;第二种是爆轰法属于动压法,其是利用炸药爆炸瞬时产生的高压高温由炸药中的碳或添加的碳转变而来的。金刚石由于具有5.5eV的带隙,在可见光范围内并不是一种好的荧光发射材料,但是它以高的硬度、低的化学活性以及良好的生物相容性被誉为“21世纪生物材料”。另外,它还具有一个重要特性是易于被各种功能化基团修饰,所以功能化纳米金刚石并开发其在生物医药技术领域上的应用已经成为生命科学的重要研究方向。与其它纳米粒子相比,具有上述优异性能的纳米金刚石在生物医药领域上表现出了很好的应用前景。
(3)非金刚石的碳纳米颗粒具备好的生物相容性,低的毒性,良好的荧光特性,例如荧光稳定、无光闪烁、波长可调谐、可实现上转换荧光发射和具有红外光发射等特点。基于这些特征,非金刚石结构 的碳纳米颗粒作为标记物的生物检测技术在近几年来已经取得了重大的进展(文献5:Li Cao,Xi Wang,Mohammed J.Meziani,et.al.J.Am.Chem.Soc.2007,129,11318-11318;文献6:Zhen-An Qiao,Yifan Wang,Yang Gao,et.al.Chem.Commun.,2010,46,8812-8814;文献7:Ruili Liu,Dongqing Wu,et.al.Angew.Chem.Int.Ed.2009,48,4598-4601),其在医学和生命科学的实践与研究中发挥着越来越重要的作用。碳纳米颗粒的最大优点是具备良好荧光特性,所以在生物检测方面具有一定的优势。但目前碳纳米颗粒的制备工艺比较复杂,碳源来源探索还不够广泛,所得碳纳米颗粒较难分离等问题尚待进一步解决。
发明内容
为了解决上述问题,本发明的目的是以廉价的天然糖类材料为原料,采用简便的合成方法获得具有良好荧光特性的水溶性碳纳米颗粒(Carbon Nanoparticles),然后对所得的碳纳米颗粒进行表征分析及应用方面的研究。
为了实现上述目的,本发明的技术方案如下:
以天然糖类材料纤维素、壳聚糖、淀粉、环糊精为原料,采用水热合成法得到具有良好荧光特性的碳纳米颗粒。
名称 | 分子量 |
纤维素 | 1.1×104 |
壳聚糖 | 3.0×105 |
淀粉 | 4.9×105 |
β-环糊精 | 1.1×105 |
其制备方法为:采用水热合成法制备而成,将天然糖类材料碳源与强碱置于高压釜反应器中,然后加入一定量的去离子水后,一步反应得碳纳米颗粒。接着,将所得的碳纳米颗粒进行微波处理,最终的得到碳纳米颗粒。
具体实验操作过程:称取1g的天然糖类材料碳源(纤维素、壳聚糖、淀粉、环糊精)和0.1g的氢氧化钠,溶于15ml去离子水后充分震荡。然后置于密闭容器(高压釜)中反应4h,温度为160℃。反应完后,用HCl中和处理,用透析袋(MWCO 3000)透析2天(期间换水8次),每六小时换一次水,取透析袋内溶液为产品溶液。先用4000rmp除去产品溶液中较大的杂质分子,然后分别用混合纤维素材质的孔径0.8μm、0.45μm、0.22μm微滤膜处理除去相对较小的杂质,即得到荧光碳纳米颗粒,最后用旋转蒸发仪浓缩至3ml。得到四种样品,分别为cel-CNPs(纤维素碳荧光纳米颗粒,样品1); chi-CNPs(壳聚糖碳荧光纳米颗粒,样品2);sta-CNPs(淀粉碳荧光纳米颗粒,样品3);cyc-CNPs(环糊精碳荧光纳米颗粒,样品4)。
微波处理四种碳纳米颗粒:取上述浓缩液置于烧杯中稀释至50ml,放在微波炉中央,调中高火加热5分钟,冷却后用超纯水定溶到原来的体积,测量它们的量子产率。
碳纳米颗粒的表征:(1)用荧光光谱仪分析微波后四种碳纳米颗粒的荧光特性。(2)用紫外分光光度计分析微波后四种碳纳米颗粒的全波长吸收情况与具体激发光作用下的吸收值。(3)用傅立叶红外光谱仪分析所得四种碳纳米颗粒的官能团结构。(4)分析微波前与微波后碳纳米颗粒的量子产率(QYs)。(5)不同pH值对碳纳米颗粒荧光特性的影响(pH=3、5、7、9)。(6)不同金属离子对碳纳米颗粒荧光特性的影响(Cu2+、Zn2+、Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Ni2+)。
本发明具有如下优点:
(1)利用纤维素、壳聚糖、淀粉、环糊精等常规天然糖类材料为碳源,只需简单的一步反应法即可以制备碳纳米颗粒,扩大了碳纳米颗粒碳源的选择范围,简化了碳纳米颗粒复杂合成过程
(2)不需要经过繁琐的合成步骤及设备进行制备及分离纯化,适合进行大规模生产
(3)得到的碳纳米颗粒荧光性质稳定,在荧光显微镜检测方面的应用具有一定的优势
(4)得到的碳纳米颗粒在水中分散性好,荧光发射光谱可调,有望作为生物标记物应用于生物检测
附图说明:
图1是cel-CNPs、chi-CNPs、sta-CNPs、cyc-CNPs的透射电子显微镜照片
图2是cel-CNPs紫外吸收光谱与荧光光谱
图3是chi-CNPs紫外吸收光谱与荧光光谱
图4是sta-CNPs紫外吸收光谱与荧光光谱
图5是cyc-CNPs紫外吸收光谱与荧光光谱
图6是cel-CNPs、chi-CNPs、sta-CNPs、cyc-CNPs的傅立叶变换红外光谱
图7是罗丹明B、荧光素、cel-CNPs、chi-CNPs、sta-CNPs、cyc-CNPs的光稳定性
图8是pH值对微波后cel-CNPs、chi-CNPs、sta-CNPs、cyc-CNPs四种碳纳米颗粒荧光特性的影响
图9是金属离子对微波后cel-CNPs、chi-CNPs、sta-CNPs、cyc-CNPs 四种碳纳米颗粒荧光特性的影响
图10是sta-CNPs碳纳米颗粒标记黑色素瘤细胞荧光显微镜照片图
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1:碳纳米颗粒制备及分离纯化
(1)cel-CNPs、chi-CNPs、sta-CNPs、cyc-CNPs碳纳米颗粒的制备
分别称取1g的淀粉(纤维素、壳聚糖或环糊精)与0.1g的NaOH置于烧杯中,加入15ml的去离子水。然后将反应物置于高压反应釜中反应4h,温度为160度。放至室温冷却后,反应产物用1M的HCl将pH调到7。
(2)cel-CNPs、chi-CNPs、sta-CNPs、cyc-CNPs碳纳米颗粒的分离纯化:
将所得的产品溶液用离心机进行除杂,先用4000rmp除去产品溶液中较大的杂质分子,然后分别用混合纤维素材质的孔径0.8μm、0.45μm、0.22μm微滤膜处理除去相对较小的杂质。然后用透析袋(3000Da)处理所得的样液,除去盐等小分子物质。
实施例2:碳纳米颗粒性质表征
(1)碳纳米颗粒的透射电镜表征
由图1可见,cel-CNPs的粒径在150nm左右,chi-CNPs的粒径在100nm左右,且粒径分布比较均匀,单分散性较好;sta-CNPs、cyc-CNPs的粒径大约在100~200nm,粒径分布较宽,但是单分散性较好。
(2)碳纳米颗粒的紫外吸收光谱和荧光光谱图
图2,图3,图4和图5分别为cel-CNPs,chi-CNPs,sta-CNPs,cyc-CNPs的紫外吸收光谱与荧光光谱图,从图中可以看出四种碳纳米颗粒在250-300nm都有相似的吸收峰,该峰为C=C典型峰。四种碳纳米颗粒在不同波长(300nm-500nm)激发光作用下,发射光的波长有所不同,主要集中在可见光范围内。随着激发波长的增加,发射波长发生红移。其中,chi-CNPs,cel-CNPs,cyc-CNPs在360nm激发光作用下,有较强的发射峰;sta-CNPs在320nm激发光作用下,有较强的发射峰。
(3)碳纳米颗粒的傅立叶红外光谱图
图6中a、b、c、d分别为sta-CNPs,cel-CNPs,chi-CNPs,cyc-CNPs的红外光谱图,四种碳纳米颗粒在3427cm-1左右有O-H伸缩振动吸收峰,在1656cm-1左右有C=O伸缩振动吸收峰。O-H为亲水基团与合成四种碳纳米颗粒有良好水溶性相一致。
(4)碳纳米颗粒的光稳定性实验结果图
碳纳米颗粒、罗丹明B及荧光素在水溶液中的光稳定性如图7所示,所用的光源为30W白炽灯,样品距离白炽灯为10cm,分别于碳纳米颗粒的最大激发波长320nm(360nm)、荧光素最大激发波长319nm、罗丹明B最大激发波长552nm测其最大荧光强度。实验结果表明:随着时间的延长,荧光素和罗丹明的荧光强度不断减弱。其中,荧光素在前10min内急剧骤降,50min后衰减至起始强度的27%,荧光素的荧光强度衰减至起始的82%。而四种碳纳米颗粒的荧光强度较稳定,cel-CNPs衰减至起始的97%,chi-CNPs衰减至起始的99%,cyc-CNPs衰减至起始的96%,sta-CNPs衰减至起始的96%。
实施例3:微波处理提高碳纳米颗粒荧光量子产率
(1)微波处理方法
取一定量的碳纳米颗粒(sta-CNPs,cel-CNPs,chi-CNPs,cyc-CNPs),加去离子水至50ml,然后放在微波炉中央,800W加热5分钟,冷却后用超纯水定容到原来的体积。
(2)微波处理后的四种碳纳米颗粒荧光量子产率
表1为四种碳纳米颗粒微波前后荧光量子产率情况,不同碳源的碳纳米颗粒的量子产率存在差别,其中以淀粉为碳源所得的纳米颗粒量子产率较高。另外,同一碳源得到的纳米颗粒在不同激发光作用下的量子产率也存在明显差异。以纤维素和壳聚糖作为碳源,得到的碳纳米颗粒在320nm激发光作用下的量子产率较高,分别为0.87%、1.06%。以环糊精和淀粉作为碳源,得到的碳纳米颗粒在380nm激发光作用下的量子产率较高,分别为1.08%、1.66%。四种碳纳米颗粒经微波处理后,量子产率相应提高,最大量子产率所对应的激发波长有所改变。其中,以淀粉为碳源所得的碳纳米颗粒的量子产率提高幅度最大,最高量子产率为11.12%。
表1:四种碳纳米颗粒微波前与微波后的量子产率值
(3)pH值对碳纳米颗粒荧光性质的影响
分别取0.5ml的sta-CNPs,cel-CNPs,chi-CNPs,cyc-CNPs样品,加入4.5ml的去离子水,再用5M的HCl和5M NaOH调pH至3、 5、7、9、11,做三组平行实验。图8为pH值对微波处理后四种碳纳米颗粒荧光特性的影响,图中可得出的结论是,四种碳纳米颗粒荧光强度受pH影响,当pH偏酸或者偏碱时,四种碳纳米颗粒荧光强度相应变弱;当pH偏中性时,四种碳纳米颗粒荧光强度相对较强,其中,pH为7时达到最大值。
(4)金属离子对碳纳米颗粒荧光性质的影响
分别称取0.0295g、0.0555g、0.125g、0.068g、0.069g、0.1015g、0.1315g的NaCl,CaCl2,CuSO4·5H2O,ZnCl2,K2CO3,MgCl2·6H2O,NiSO4·6H2O置于烧杯中,加入50ml的去离子水,得浓度为10-2M的金属离子溶液。然后取10ml浓度为10-2M金属离子溶液置于100ml容量瓶进行定容,得10-3M的金属离子溶液。再取1ml的10-3M金属离子溶液置于100ml容量瓶中进行定容,得10-5M的金属离子溶液。取4.5ml 10-3M、10-5M的金属离子溶液置于5ml的小离心管中,然后加入0.5ml各种碳纳米颗粒(cel-CNPs、chi-CNPs、sta-CNPs、cyc-CNPs的浓度为0.2mg/ml),得浓度为0.9×10-4,0.9×10-6的金属离子溶液。震荡混匀2h后,分析其荧光特性。
图9为不同金属离子对微波处理后的四种碳纳米颗粒荧光特性的影响。实验结果表明,七种金属离子对所合成碳纳米颗粒荧光特性影响包括淬灭与增加作用。不同金属离子对同一碳纳米颗粒的作用有所不同,另外,同一种金属离子的不同浓度对碳纳米颗粒荧光强度的影响也有所不同。其中,Cu2+使cel-CNPs与chi-CNPs的荧光强度大大减小,起到淬灭作用,而对sta-CNPs荧光强度起到增强的作用。相反Ni2+在一定程度上增强cel-CNPs和chi-CNPs的荧光强度,而对sta-CNPs荧光强度起到淬灭作用。
实施例4:碳纳米颗粒标记细胞
黑色瘤细胞B16-F10,经胰酶消化后形成单细胞悬液,以3×104密度种入24孔板中,加500ul的培养液,然后加入经PBS缓冲溶液稀释的碳纳米颗粒,置于5%CO2中37℃孵育24h。孵育完用0.1M的PBS缓冲溶液吹洗两次,最后用甲醛固定细胞,制载玻片后在荧光显微镜下,观察进入细胞情况及荧光强度。
图10为碳纳米颗粒标记细胞图,从图中可看出碳纳米颗粒进入细胞后,在不同激发光作用下发出不同颜色的光。(a)为紫外光(330~380nm)作用下的荧光图,发出蓝色的光。(b)为蓝光(380~420nm)作用下的荧光图,发出绿色的光。(c)为绿光(450-490nm)作用下的荧光图,发出红光。
Claims (8)
1.基于天然糖类材料的功能性碳荧光纳米颗粒,其特征在于:分别以纤维素、壳聚糖、淀粉或环糊精为碳源,采用水热合成法获得具有荧光特性的碳纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的功能性碳纳米颗粒,其特征在于:
分别称取1g的碳源纤维素、壳聚糖、淀粉或环糊精和0.08g~0.2g的氢氧化钠,溶于15ml~30ml去离子水后充分震荡;然后置于密闭容器中反应4h~20h,温度为120℃~180℃;反应完后,用HCl中和处理至pH 7.0~8.0,用透析袋(MWCO 3000)透析2天,取透析袋内溶液为产品溶液;
将所得的产品溶液用离心机进行除杂,先用4000rmp-6000rpm除去产品溶液中较大的杂质分子,然后分别用混合纤维素材质的孔径0.8μm、0.45μm、0.22μm微滤膜处理除去相对较小的杂质,即得到荧光碳纳米颗粒,最后用旋转蒸发仪浓缩至3ml,最后得到四种样品,分别为cel-CNPs(纤维素碳荧光纳米颗粒,样品1);chi-CNPs(壳聚糖碳荧光纳米颗粒,样品2);sta-CNPs(淀粉碳荧光纳米颗粒,样品3);cyc-CNPs(环糊精碳荧光纳米颗粒,样品4)。
3.根据权利要求2所述的功能性碳纳米颗粒,其特征在于:取制备好的碳纳米颗粒溶液于烧杯中,放在微波炉内,调中高火加热5~7min。高火时,微波炉功率750~800W分钟,所得碳纳米颗粒的荧光量子产率得到提高。
4.一种权利要求1所述的功能性碳纳米颗粒的制备方法,其特征在于:
分别称取1g的碳源纤维素、壳聚糖、淀粉或环糊精和0.08g~0.2g的氢氧化钠,溶于15ml~30ml去离子水后充分震荡;然后置于密闭容器中反应4h~20h,温度为120℃~180℃;反应完后,用HCl中和处理至pH 7.0~8.0,用透析袋(MWCO 3000)透析2天,取透析袋内溶液为产品溶液;
将所得的产品溶液用离心机进行除杂,先用4000rmp-6000rpm除去产品溶液中较大的杂质分子,然后分别用混合纤维素材质的孔径0.8μm、0.45μm、0.22μm微滤膜处理除去相对较小的杂质,即得到荧光碳纳米颗粒,最后用旋转蒸发仪浓缩至3ml,最后得到四种样品,分别为cel-CNPs(纤维素碳荧光纳米颗粒,样品1);chi-CNPs(壳聚糖碳荧光纳米颗粒,样品2);sta-CNPs(淀粉碳荧光纳米颗粒,样品3);cyc-CNPs(环糊精碳荧光纳米颗粒,样品4)。
5.根据权利要求4所述的功能性碳纳米颗粒的制备方法,其特征在于:取制备好的碳纳米颗粒溶液于烧杯中,放在微波炉内,调中高火加热5~7min。高火时,微波炉功率750~800W分钟,所得碳纳米颗粒的荧光量子产率得到提高。
6.一种权利要求1-3任一项所述的碳纳米颗粒在生物标记中的应用。
7.一种权利要求4所述的碳纳米颗粒生物标记应用,其特征在于:所述生物包括多肽、抗体、抗原、蛋白、核酸等分子中的一种或多种。
8.一种权利要求4所述的碳纳米颗粒用于血液中葡萄糖含量或果汁中葡萄糖含量的检测。
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