CN104800859B - 基于荧光碳纳米颗粒的可视化球形核酸及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于荧光碳纳米颗粒的可视化球形核酸及其制备方法和应用。本发明的可视化球形核酸包括荧光碳纳米颗粒和结合在其表面的寡核苷酸。本发明通过采用一步反应法获得了具有良好荧光特性的碳纳米颗粒，然后再将其与寡核苷酸结合制备得到可视化球形核酸体系，该方法不仅简化了制备工艺，而且，在不需要任何其他转染试剂的情况下，该可视化球形核酸可高效地将核酸递送到细胞内，提高了细胞摄入率和转染效率，具有重要的应用价值。

Description

基于荧光碳纳米颗粒的可视化球形核酸及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种可视化球形核酸及其制备方法和应用，尤其涉及一种基于荧光碳纳米颗粒的可视化球形核酸及其制备方法和应用。

背景技术

基因疗法已成为治疗癌症等具有挑战性疾病的一种新颖和强大的手法。有效的基因治疗很大程度上依赖于安全和高效的转染试剂。然而，治疗性的核酸(包括siRNA和反义DNA)的递送仍然是基因调节和治疗主要难点。核酸递送载体，如阳离子高分子，脂质体和人工改造病毒，被用于核酸的输送，从而达到穿透胞膜和免于核酸酶降解的目的。这些载体存在很大的不足，比如不可降解性，严重的免疫原性或使用浓度的毒性，因此它们很难满足应用的要求(参考文献1：Verma,I.M.；Somia,N.Nature 1997,389,239-242；文献2：Choi,C.H.；Hao,L.；Narayan,S.P.；Auyeung,E.；Mirkin,C.A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2013,110,7625-7630)。

核酸在药物递送，基因治疗以及疾病诊断中应用广泛。在过去十年，球形核酸系统通常以金纳米颗粒为核心，表面覆盖核酸。与传统的方法相比，球形核酸在没有任何转染试剂的条件下，具有很高的细胞摄入率和转染效率。球形核酸由于其空间位阻结构，能有效地防止核酸酶的降解。它们还有免疫反应极小，毒性低和高效的基因调节能力等特性。这些优势都使球形核酸成为基因递送和基因治疗的理想体系(参考文献3：Williams,S.C.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2013,110,13231-13233；文献4：Cutler,J.I.；Auyeung,E.；Mirkin,C.A.J.Am.Chem.Soc.2012,134,1376-1391；文献5：Zheng,D.；Giljohann,D.A.；Chen,D.L.；Massich,M.D.；Wang,X.Q.；Iordanov,H.；Mirkin,C.A.；Paller,A.S.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2012,109,11975-11980)。

多功能化将更大程度地拓展球形核酸的应用范围，可视化是实现这一目标的重要一环。可视化的球形核酸，将有利于研究其递送情况及诊断应用。纳米金用于球形核酸具有一些不利的因素：1)长期毒性不确定；2)暗场发光，标记物分辨率低。荧光半导体纳米晶体也常被用于球形核酸，但它们一般由毒性大的重金属作为核心，与生物功能材料的基本要求相悖(参考文献6：Rosi,N.L.；Giljohann,D.A.；Thaxton,C.S.；Lytton-Jean,A.K.；Han,M.S.；Mirkin,C.A.Science 2006,312,1027-1030；文献7：Giljohann,D.A.；Seferos,D.S.；Prigodich,A.E.；Patel,P.C.；Mirkin,C.A.J.Am.Chem.Soc.2009,131,2072-2073；文献8：Young,K.L.；Scott,A.W.；Hao,L.；Mirkin,S.E.；Liu,G.；Mirkin,C.A.Nano Lett.2012,12,3867-3871；文献9：Bhunia,S.K.；Saha,A.；Maity,A.R.；Ray,S.C.；Jana,N.R.Sci.Rep.2013,3,1473；文献10：Boisselier,E.；Astruc,D.Chem.Soc.Rev.2009,38,1759-1782；文献11：Huang,X.；Zhang,F.；Zhu,L.；Choi,K.Y.；Guo,N.；Guo,J.；Tackett,K.；Anilkumar,P.；Liu,G.；Quan,Q.；Choi,H.S.；Niu,G.；Sun,Y.P.；Lee,S.；Chen,X.ACS Nano2013,7,5684-5693)。

表面氨基化的荧光碳纳米技术：采用氨(胺)基类化合物，如壳聚糖，丝蛋白或碳水化物与聚醚酰亚胺混合物，在水热反应或微波反应的条件下，一步可形成荧光碳纳米颗粒(FCNs)。据文献报道，这些FCNs具有稳定的光致发光，较宽的激发光谱，可调的发射波长，并且具有良好的生物相容性。这些优势是传统的有机染料重金属核壳结构量子点无可比拟的(参考文献12：Yang Y.；Cui J.；Zheng M.；Hu C.；Tan S.；Xiao Y.；Yang Q.；LiuY.Chem.Commun.2012,48,380-382.文献13：Liu C.,Zhang P.,Zhai X.,Tian F.,Li W.,Yang J.,Liu Y.,Wang H.,Wang W.,Liu W.Biomaterials 2012,33(13):3604-13.文献14：Wu Z.L.,Zhang P.,Wang W.,Leng F.,Gao M.X.,Liu C.F.,Huang C.Z.J.Mater.Chem.B,2013,1:2868–2873)。

FCNs在医学和生命科学的实践与研究中发挥着越来越重要的作用。FCNs的最大优点是具备良好荧光特性，所以在生物检测方面具有一定的优势。但目前FCNs的应用范围比较有限，如何最大限度地拓展FCNs在生物医学中的应用成为一个非常有意义的课题。

发明内容

本发明提供了一种可视化球形核酸及其制备方法和应用，特别是一种基于荧光碳纳米颗粒的可视化球形核酸及其制备方法和应用。本发明中，在不需要任何其他转染试剂的情况下，该可视化球形核酸可高效地将核酸递送到细胞内，提高了细胞摄入率和转染效率，具有重要的应用价值。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种可视化球形核酸，所述可视化球形核酸包括荧光碳纳米颗粒(FCNs)内核和结合在其表面的寡核苷酸。

本发明所述的可视化球形核酸是一种以荧光碳纳米颗粒(FCNs)为核，表面结合寡核苷酸的复合物。其中，FCNs可用于示踪球形核酸的递送情况，寡核苷酸进入细胞内释放出来，可调节目标基因的表达情况，引起相关的生物效应；另外，本发明利用碳纳米颗粒荧光性质稳定的特性，制备可用于监测的球形核酸系统，可根据实际情况选择合适发射波长的碳纳米颗粒作为球形核酸的核心。

本发明中，所述荧光碳纳米颗粒内核为表面氨基化的荧光碳纳米颗粒。

本发明中，对所述荧光碳纳米颗粒不作特别限定，例如可以是发蓝光的，也可以发绿光的，或者是发红光的，都可以应用于本发明。

本发明通过将荧光碳纳米颗粒进行表面氨基化，只需简单的一步反应法即可制备得到表面氨基化的荧光碳纳米颗粒，简化了球形核酸的复杂的合成过程。

优选地，所述荧光碳纳米颗粒的粒径小于20nm，例如可以是5nm、8nm、10nm、12nm、15nm、18nm、19nm。本发明的荧光碳纳米颗粒的粒径分布比较均匀，并且单分散性较好。

本发明中，所述寡核苷酸为巯基化修饰的核酸；优选地，所述寡核苷酸为siRNA或反义DNA。

本发明提供的可视化的球形核酸体系，在不需任何其他转染试剂的情况下，可高效地将核酸递送到细胞内，并下调目标mRNA和蛋白的表达水平；在不需任何其他转染试剂的情况下，可高效地将核酸递送到肿瘤部位，并在肿瘤部位蓄积程度高，能够抑制肿瘤的增长。

第二方面，本发明还提供了如本发明第一方面所述的可视化球形核酸的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)制备荧光碳纳米颗粒；

(2)将寡核苷酸进行巯基化修饰；

(3)以步骤(1)得到的荧光碳纳米颗粒作为内核，表面结合步骤(2)的寡核苷酸，得到可视化球形核酸。

本发明中，步骤(1)所述制备荧光碳纳米颗粒包括：以氨基类化合物为原料，采用水热合成法得到荧光碳纳米颗粒。

优选地，所述氨基类化合物为碳水化合物与聚醚酰亚胺的混合物、壳聚糖或丝蛋白中的任意一种或至少两种的混合物，优选为壳聚糖。

本发明中，步骤(2)所述巯基化修饰采用过硫化钠、盐酸硫醇亚胺或硫代硫酸钠中的任意一种或至少两种的混合物进行，优选为盐酸硫醇亚胺。

作为优选的技术方案，所述的可视化球形核酸的制备方法包括以下步骤：

(1)将壳聚糖加入到去离子水中，同时充分搅拌，然后置于密闭容器中反应，将所得产品溶液离心，然后用透析袋处理，除去小分子物质，得到的上清液即为荧光碳纳米颗粒；

(2)将siRNA或反义DNA进行巯基化修饰；

(3)将步骤(1)的荧光碳纳米颗粒进行活化：采用偶联剂与荧光碳纳米颗粒震荡反应12h，超滤离心洗涤，除去未反应完的偶联剂，收集活化的荧光碳纳米颗粒；

(4)将步骤(2)巯基化修饰的siRNA或反义DNA进行激活：取50μL 0.1M的二硫苏糖醇，加入到50μg巯基化的siRNA或反义DNA中，混匀后室温静置2h，除盐，纯化，收集样品；

(5)将步骤(3)的荧光碳纳米颗粒与步骤(4)的巯基化siRNA或反义DNA结合：将除盐处理后的巯基化siRNA或反义DNA与荧光碳纳米颗粒混合，在4h以上的时间内加入浓度为3M的NaCl至浓度为0.3M，震荡反应12h后，形成荧光的球形核酸，超滤离心，洗涤多次，收集产物。

第三方面，本发明还提供了如第一方面所述的可视化球形核酸在生物标记或药物递送中的应用。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

(1)本发明提供的可视化的球形核酸体系，在不需任何其他转染试剂的情况下，可高效地将核酸递送到细胞内，并下调目标mRNA和蛋白的表达水平；在不需任何其他转染试剂的情况下，可高效地将核酸递送到肿瘤部位，并在肿瘤部位蓄积程度高，能够抑制肿瘤的增长；

(2)本发明可操作性强，设备简单，成本低；分离提纯简单，重复性好，在一般实验室均能完成，易于规模化和推广；碳量子点表面性质可控，荧光性能良好，对于研究纳米材料与生物效应方面，提供材料和技术上的保证，无论基础研究或临床应用，均具有重要的意义。

附图说明

图1是荧光碳纳米颗粒(FCNs)/siRNA球形核酸的合成过程示意图。

图2是荧光碳纳米颗粒的理化性质表征，其中，(A)为荧光碳纳米颗粒的红外光谱图；(B)为荧光碳纳米颗粒的高清透射电镜(HR-TEM)图；(C)为荧光碳颗粒在白光和紫外光照射下的图片。

图3是MDA-MB-231-EGFP、A375细胞分别和荧光碳纳米颗粒共孵育后的细胞毒性测试。

图4是标准曲线法分析荧光碳纳米颗粒负载核酸能力；其中，(A)表示激发光为670nm时的荧光强度vs.Cy5-siRNA浓度，Excel软件线性拟合，R²＝0.999；(B)表示405nm时的吸光值vs.FCNs的浓度，Excel软件线性拟合，R²＝0.9974。

图5是纳米颗粒在MDA-MB-231-EGFP细胞中的转染情况；其中，(A)表示不同siEGFP组分处理后的荧光图片：a.阴性对照；b.FCNs；c.siEGFP；d.FCNs/Scrambled sequence(FCNs/随机序列)；e.Lipo2000/siEGFP；f.FCNs/siEGFP1；g.FCNs/siEGFP2；h.FCNs/siEGFP3，其中，比例尺表示200μm；第一行和第三行表示相差模式下的图片，第二行和第四行表示荧光模式下的图片；(B)表示不同组分处理后的EGFP的表达情况，其中，siEGFP，FCNs/随机序列和Lipo2000/siEGFP对应的siRNA浓度是150nM；FCNs/siEGFP1,FCNs/siEGFP2和FCNs/siEGFP3对应的siEGFP浓度分别是50nM，100nM和150nM(n＝3)。

图6是不同的siPlk-1组分对A375细胞的影响情况；其中，(A)表示荧光定量PCR测定不同siPlk-1组分处理后的Plk-1mRNA水平，Plk-1mRNA的表达水平对GAPDH mRNA表达水平进行归一化处理。数据为三次独立转染实验的结果，对FCNs/随机序列组进行显著性差异分析，**p<0.01，***p<0.001(n＝3)；(B)Western blot分析不同siPlk-1组分中Plk-1蛋白的表达情况；(C)表示不同siPlk-1组分处理后诱导A375细胞凋亡的情况，其中，siRNA浓度都是100nM。

图7是FCNs/Cy5-siPlk-1的细胞摄入和共定位，其中，A375细胞与FCNs/Cy5-siPlk-1共孵育4h，激发波长：FCNs 405nm和Cy5633nm；比例尺表示20μm。

图8是流式细胞仪测定细胞对Cy5-标记siPlk-1的摄入率，其中，细胞与Cy5-siPlk-1或FCNs/Cy5-siPlk-1孵育4h后的结果。

图9是FCNs/siPlk-1用于抑制荷瘤小鼠肿瘤的结果，其中，(A)表示注射不同的siPlk-1组分后，从荷瘤小鼠上取出的肿瘤图片；(B)表示肿瘤体积随时间变化情况，肿瘤体积归一化为第16天时的百分比(每一实验组的平均值±标准差)；(C)表示体重随时间变化情况，小鼠体重归一化为第16天时的百分比(每一实验组的平均值±标准差)。

图10是FCNs/Cy5-siPlk-1复合物经尾静脉注射荷瘤小鼠24h后，小动物成像仪成像的结果。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

图1是荧光碳纳米颗粒(FCNs)/siRNA球形核酸的合成过程示意图。

实施例1：荧光碳纳米颗粒(FCNs)的制备及分离纯化

(1)荧光碳纳米颗粒(FCNs)的制备：

以低分子量壳聚糖为原料，采用水热合成法得到具有良好荧光特性的碳纳米颗粒，其制备方法为：称取0.35g的低分子量壳聚糖加入到70mL的去离子水中同时充分搅拌，然后置于密闭容器(高压釜)中反应12h，温度为180℃。

(2)荧光碳纳米颗粒(FCNs)的分离纯化：

将所得的产品溶液在高速台式冷冻离心机(14000rpm)中离心10min，然后用透析袋(截留分子量1000Da)处理除去小分子物质，透析时间为2d。

实施例2：荧光碳纳米颗粒(FCNs)的性质表征

(1)荧光碳纳米颗粒的傅立叶红外光谱

图2A为荧光碳纳米颗粒的红外光谱图，由图2A可以看出，实施例1制备所得的荧光碳纳米颗粒在1660～1580左右有N-H伸缩振动吸收峰。

(2)荧光碳纳米颗粒的高清透射电镜表征

图2B为荧光碳纳米颗粒的高清透射电镜表征图，由图2B可以看出，荧光碳纳米颗粒的粒径为11.83±2.22nm，且粒径分布比较均匀，单分散性较好。

(3)荧光碳纳米颗粒的成像

图2C为荧光碳颗粒在白光和紫外光照射下的图片，由图2C可以看出，荧光碳纳米颗粒在白光照射下，呈现棕黄色；在紫外光照射下，激发出强烈的蓝色荧光。

实施例3：荧光碳纳米颗粒(FCNs)的细胞毒性测试

将MDA-MB-231和A375细胞，按5000/孔的密度到96孔板中，置于5％CO₂，37℃培养箱中孵育24h。加入浓度分别为0，10，20，50，80，100，150，200，250，300和350μg/mL的荧光碳纳米颗粒(FCNs)。每个浓度5个复孔。48h后，吸去培养液，每孔加入换上新鲜配制的200μL浓度为5mg/ml的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)溶液，继续培养4h后，吸去孔内培养液，每孔加入200μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

由图3可以看出：荧光碳纳米颗粒毒性较低，甚至浓度高达350μg/mL，细胞的存活率也超过80％。这就为荧光碳纳米颗粒在生物医学中的应用提供了前提条件。

实施例4：荧光碳纳米颗粒(FCNs)与siRNA结合形成球形核酸

(1)荧光碳纳米颗粒(FCNs)的活化

将双功能偶联剂N-[γ-马来酰亚胺]磺基琥珀酸酯(N-[γ-maleimidobutyryloxy]sulfosuccinimide ester，sulfo-GMBS)与FCNs震荡反应12h，超滤离心洗涤，除去未反应完的偶联剂，收集活化的FCNs。

(2)巯基化siRNA的激活

取50μL 0.1M的二硫苏糖醇(DTT)，加入到50μg巯基化的siRNA中，混匀后室温静置2h，利用尺寸排阻柱(Sephadex^TMG-25DNA Grade)除盐，纯化，收集样品。

(3)荧光碳纳米颗粒(FCNs)与巯基化siRNA结合

将除盐处理后的巯基化siRNA与碳纳米颗粒混合，在4h以上的时间内缓慢加入3M的NaCl至0.3M，震荡反应12h后，形成荧光的球形核酸体系，超滤离心，洗涤多次，收集产物。

实施例5：荧光碳纳米颗粒(FCNs)的负载能力测试

荧光碳纳米颗粒(FCNs)的负载能力可通过标准曲线法测定。将DTT还原后纯化所得的Cy5-siRNA制备成浓度分别为0，0.01，0.02，0.04，0.08，0.16mg/mL的溶液，各取100μL滴加到黑底96孔板中，测定其在激发波长为650nm，发射波长为670nm处的荧光强度，并绘制标准曲线(如图4A)。取100μL制备好的FCNs/Cy5-siRNA滴加到黑底96孔板中，多功能酶标仪测定其荧光强度为33069，可计算出Cy5-siRNA浓度为0.072mg/mL。将FCNs制备成0，0.25，0.5，1，2，4mg/mL的溶液，各取100μL滴加到透明96孔板中，测定其在405nm时的吸光度，并绘制标准曲线(如图4B)。取100μL制备好的FCNs/Cy5-siRNA滴加到透明96孔板中，多功能酶标仪测定其吸光值为0.434，可测得FCNs浓度为3.147mg/mL。通过负载能力(Loadingcapability(LC))计算公式：LC＝FCNs的浓度/Cy5-siRNA的浓度，可计算出LC为43.71。

实施例6：荧光碳纳米颗粒(FCNs)/siRNA用于沉默靶基因

(1)增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的沉默

将靶向EGFP的FCNs/siRNA复合物(FCNs/siEGFP)与稳转EGFP质粒的MDA-MB-231细胞共孵育48h后，倒置荧光显微镜观察沉默情况。与对照组(siEGFP,FCNs/随机序列orLipo2000/siEGFP)相比，FCNs/siEGFP的沉默效果明显。将细胞裂解后，14000rpm高速离心，取上清，多功能酶标仪测定荧光情况。其中的蛋白浓度可通过BCA试剂盒测定。EGFP的表达情况可表示为相对荧光强度(Relative light units，即RLU)对总蛋白浓度的归一化处理值，即RLU/mg蛋白。其中，针对EGFP进行双链设计的siRNA为：

正义链:5’-Thiol-ACCCUGAAGUUCAUCUGCACC-3’；

反义链:5’-UGCAGAUGAACUUCAGGGUCA-3’。

(上述引入参考文献：Afonin,K.A.；Viard,M.；Martins,A.N.；Lockett,S.J.；Maciag,A.E.；Freed,E.O.；Heldman,E.；Jaeger,L.；Blumenthal,R.；Shapiro,B.A.Nat.Nanotechnol.2013,8:296-304.)

图5A是siEGFP的不同组分转染MDA-MB-231后，荧光显微镜观察的图片，FCNs/siEGFP相比其他组，能最有效地抑制EGFP的表达。图5B可定量测定EGFP的表达情况，FCNs/siEGFP可下调EGFP表达量是阳性对照Lipo2000/siEGFP的5倍以上。

(2)Plk-1基因的沉默

将靶向Plk-1的FCNs/siRNA复合物(FCNs/siPlk-1)分别与A375和A375细胞共孵育48h后，提取细胞的总RNA，反转录生成cDNA。以cDNA为模板，在引物5’-AGCCTGAGGCCCGATACTACCTAC-3’(Plk-1-forward)，5’-ATTAGGAGTCCCACACAGGGTCTTC-3’(Plk-1-reverse)的存在下扩增。

以“看家”基因GAPDH为内参，引物序列为：

Forward:5’-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3’；

Reverse:5’-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3’。

图6A表示荧光定量PCR检测基因和内参基因的表达量。与阴性对照组(PBS)相比，单独的siPlk-1或FCNs/随机序列并没有明显的沉默效果。作为阳性对照Lipo2000/siPlk-1中Plk-1mRNA水平相对于FCNs/随机序列只下调了44％。相比之下，当FCNs/siPlk-1中，Plk-1mRNA的表达量则下调了80％。这比阳性对照Lipo2000/siPlk-1要高出很多。

Western blot用于分析Plk-1蛋白的变化情况。转染48h后的细胞先用4℃的PBS缓冲液洗涤三次，然后加入新鲜配制含有Roche's蛋白酶抑制剂的50μL裂解液(50mM HEPES，pH 7.5，150mM NaCl，1％Triton X-100，10％glycerol，1.5mM MgCl2和1mM EGTA)。所有的裂解液经SDS凝胶电泳处理后，采用1：1000稀释的Plk-1一抗(Rabbit mAb#4513,CellSignalling Technology)进行免疫印迹实验。从图6B可见，对照组中(NC，FCNs，单纯的siPlk-1，FCNs/随机序列和阳性对照Lipo2000/siPlk-1)，Plk-1蛋白的下调不明显，而FCNs/siPlk-1中，条带灰度值大约为FCNs/随机序列的1/500。荧光定量PCR和Western blot的结果都表明，FCNs/siPlk-1能有效地沉默目标基因。

从图6C可以看出，Plk-1蛋白的表达的抑制会引起细胞的凋亡，通过测试了FCNs/siPlk-1诱导细胞凋亡的效果，以A375细胞为模型，转染后48h，流式细胞仪测得，30％以上的细胞处于凋亡状态。

针对Plk-1进行双链设计的siRNA为：

正义链：5’-Thiol-UGAAGAAGAUCACCCUCCUUAdTdT-3’；

反义链：5’-UAAGGAGGGUGAUCUUCUUCAdTdT-3’。

(参考文献：Sun,T.M.；Du,J.Z.；Yao,Y.D.；Mao,C.Q.；Dou,S.；Huang,S.Y.；Zhang,P.Z.；Leong,K.W.；Song,E.W.；Wang,J.ACS Nano 2011,5:1483-1494.)。

实施例7：细胞对FCNs/siPlk-1的摄入和共定位

按前面的合成方法，FCNs结合Cy5标记的siPlk-1后，形成FCNs/Cy5-siPlk-1复合物。在Opti-men低血清培养基中，配制含有Cy5-siPlk-1或FCNs/Cy5-siPlk-1的悬液(悬液中Cy5-siPlk-1浓度为100nM)。A375细胞作为模型细胞，按5×10⁵/孔的密度种植在6孔板中。在5％CO₂，37℃培养箱中孵育24h后，吸去培养液，换上新配制的Cy5-siPlk-1或FCNs/Cy5-siPlk-1悬液，共孵育4h。之后，吸去转染液，PBS缓冲液洗涤3次，4％多聚甲醛固定15min。PBS缓冲液洗涤后，激光共聚焦显微镜(LSM 710；CarlZeiss,Germany)观察。FCNs的激发波长为405nm，Cy5的激发波长为633nm。

为定量测定细胞的摄入效率，将转染后的细胞经胰酶消化后，PBS缓冲液洗涤2次，200μL PBS缓冲液重悬。流式细胞仪测定Cy5阳性细胞的百分比。单纯Cy5-siPlk-1标记的细胞作为对照。

从图7的共聚焦图片可看到，FCNs/Cy5-siPlk-1与细胞共孵育4h后，大量的核酸复合物进入到细胞内。需要特别说明的是，这是在没有任何转染试剂的情况下实现的。通过流式细胞仪定量测定，由图8可以看出，超过99％的细胞摄入了核酸复合物，而作为对照的Cy5-siPlk-1或Lipo2000/Cy5-siPlk-1则分别为0.51％和3.39％。

实施例8：肿瘤抑制研究

将体积为200μL，数量为3×10⁶的A375细胞(人黑色素瘤细胞)皮下接种到周龄为6周的BALB/c雌性小鼠。当肿瘤长成体积约为100mm³时，小鼠被随机分到6组中(分别标记为PBS，FCNs，siPlk-1，FCNs/随机序列，Lipo2000/siPlk-1和FCNs/siPlk-1组)，每组4只。从接种细胞后的第16d开始，隔日尾静脉注射以上组分。第32d，采用引颈处死法，处死所有小鼠。肿瘤体积的计算公式为V(mm³)＝0.5×length×width²。

从图9可看到，经过单独的PBS，FCNs及随机序列修饰的FCNs处理后，肿瘤的体积明显增加，与注射药物前相比，第30d时的肿瘤体积甚至可增大8倍。在个别情况下，注射siPlk-1或Lipo2000/siPlk-1能抑制肿瘤体积的增加，这表明它们在体内应用时疗效有限。出人意料的是，FCNs/siPlk-1能有效抑制肿瘤体积的增加(图9A，B)。而注射药物后，小鼠的体重只有轻微的减轻，反映出FCNs/siPlk-1在体内使用时，毒性较低(图9C)。

实施例9：FCNs/Cy5-siPlk-1的体内跟踪

将FCNs/Cy5-siPlk-1尾静脉注射到接种A375细胞30d的BALB/c小鼠中。24h后，麻醉小鼠。小动物成像仪观察FCNs/Cy5-siPlk-1在体内的分布情况。

从图10可知，FCNs/Cy5-siPlk-1能在肿瘤部位聚集，这就为抑制肿瘤提供了可能性。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (8)

1.一种用于药物递送的可视化球形核酸，其特征在于，所述可视化球形核酸包括荧光碳纳米颗粒内核和结合在其表面的寡核苷酸；

所述荧光碳纳米颗粒内核为表面氨基化的荧光碳纳米颗粒；所述荧光碳纳米颗粒的制备方法包括：以氨基类化合物为原料，采用水热合成法得到荧光碳纳米颗粒；

所述寡核苷酸为巯基化修饰的寡核苷酸；所述荧光碳纳米颗粒的粒径大于10nm且小于20nm；

其中，所述巯基化修饰的寡核苷酸为：

针对Plk-1进行双链设计的siRNA：

Plk-1siRNA正义链：5’-Thiol-UGAAGAAGAUCACCCUCCUUAdTdT-3’；

Plk-1siRNA反义链：5’-UAAGGAGGGUGAUCUUCUUCAdTdT-3’。

2.根据权利要求1所述的可视化球形核酸的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)制备荧光碳纳米颗粒；

(2)将寡核苷酸进行巯基化修饰；

(3)以步骤(1)得到的荧光碳纳米颗粒作为内核，表面结合步骤(2)的寡核苷酸，得到可视化球形核酸。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述制备荧光碳纳米颗粒包括：以氨基类化合物为原料，采用水热合成法得到荧光碳纳米颗粒。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述氨基类化合物为碳水化合物与聚醚酰亚胺的混合物、壳聚糖或丝蛋白中的任意一种或至少两种的混合物。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述氨基类化合物为壳聚糖。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述巯基化修饰采用过硫化钠、盐酸硫醇亚胺或硫代硫酸钠中的任意一种或至少两种的混合物进行。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述巯基化修饰采用盐酸硫醇亚胺进行。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将壳聚糖加入到去离子水中，同时充分搅拌，然后置于密闭容器中反应，将所得产品溶液离心，然后用透析袋处理，除去小分子物质，得到的上清液即为荧光碳纳米颗粒；

(2)将siRNA进行巯基化修饰；

(3)将步骤(1)的荧光碳纳米颗粒进行活化：采用偶联剂与荧光碳纳米颗粒震荡反应12h，超滤离心洗涤，除去未反应完的偶联剂，收集活化的荧光碳纳米颗粒；

(4)将步骤(2)巯基化修饰的siRNA进行激活：取50μL 0.1M的二硫苏糖醇，加入到50μg巯基化的siRNA中，混匀后室温静置2h，除盐，纯化，收集样品；

(5)将步骤(3)的荧光碳纳米颗粒与步骤(4)的巯基化siRNA结合：将除盐处理后的巯基化siRNA与荧光碳纳米颗粒混合，在4h以上的时间内加入浓度为3M的NaCl至浓度为0.3M，震荡反应12h后，形成荧光的球形核酸，超滤离心，洗涤多次，收集产物。