CN104546726B - 一种自组装核酸纳米管制剂及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种自组装核酸纳米管制剂及制备方法和应用，所述制剂包括由序列SEQ ID NO：1所示的mTOR siRNA、序列如SEQ ID NO：2所示的L、序列如SEQ ID NO：3所示的M、序列如SEQ ID NO：4所示的S和序列如SEQ ID NO：5所示的S′。通过单链核酸分子碱基互补配对的核酸交联成管状的核酸纳米制剂。该制剂使siRNA双螺旋化，并自组装进入纳米管系统，使siRNA不易被核酸酶降解，形成复合纳米管结构，充分发挥了纳米粒子易被细胞摄取的优点，显著增强了对细胞的转染效率。因此siRNA进入细胞结构稳定，保持原有生物活性，调控细胞自噬及增殖，能有效抑制肺动脉平滑肌细胞的异常生长，可用于制备治疗肺动脉高压的药物。

Description

一种自组装核酸纳米管制剂及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种生物制剂，特别涉及一种包含siRNA的管状核酸纳米制剂及制备方法和应用。

背景技术

开发通用的药物载体是纳米医学最重要的研究主题。以前的研究已经报道了许多药物递送系统，例如：合成的高分子聚合物、阳离子脂质体、碳纳米管、环糊精材料、纳米粒子、病毒衣壳等。这些递送系统的有效性已被清楚的演示，然而，它们大多数都是非自然或者外生性分子，缺乏组织特异性及具有潜在毒性。近来在DNA结构方面的研究使得它能进一步运用于生物学领域。DNA是人体内的自然组分，它相对稳定，且能进行生物降解，不产生免疫原性。因此，自组装的DNA纳米结构在疾病基因治疗领域具有巨大的潜力。

肺动脉高压(PAH)是慢性肺部疾病的严重并发症，临床疗效差，病死率高。肺血管的异常增殖和重构是其病理基础。以前的研究表明，肺动脉平滑肌细胞的异常增殖和凋亡抵抗在肺高压形成中发挥关键作用，近来的研究证实自噬对哺乳动物细胞具有强大的调控机制。自噬在肺血管疾病发病机制中扮演关键作用。

哺乳动物雷帕霉素蛋白(mTOR)，一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是细胞应对生理条件及环境压力时调控自噬及生长的关键成分。哺乳动物雷帕霉素蛋白已被证实与肿瘤的发生、发展，心血管疾病，自身免疫性疾病，代谢紊乱和老年性疾病等多种疾病密切相关。因此，靶标哺乳动物雷帕霉素蛋白在治疗多种疾病中提供了一种创新策略。研究表明哺乳动物雷帕霉素蛋白激活可以抑制自噬，相反，抑制mTOR则诱导自噬。小干扰RNA(smallinterfering RNA，siRNA)，可高效、特异地抑制靶基因翻译过程，实现靶基因的表达下调。因此，如何设计开发临床适用的针对肺动脉高压治疗的siRNA递送系统仍然具有巨大的挑战。

发明内容

本发明的目的是提供一种自组装核酸纳米管制剂及制备方法和应用，该制剂使siRNA双螺旋化，并自组装进入纳米管系统，使siRNA不易被核酸酶降解，形成复合纳米管结构，充分发挥了纳米粒子易被细胞摄取的优点，显著增强了对细胞的转染效率。因此siRNA进入细胞结构稳定，保持原有生物活性。该制剂对肺动脉平滑肌细胞的转染效率显著提高，能有效调控肺动脉平滑肌细胞的自噬，抑制肺动脉平滑肌细胞的异常增殖，可用于制备治疗肺动脉高压的药物。

申请人发明了一种通过控制时间和温度交联四条DNA单链形成的纳米管系统，将功能基因mTOR siRNA通过特定的摩尔比反应绑定到纳米管结构上形成纳米复合体制剂。核酸纳米载体由于具有较高的可编程性、较好的生物稳定性和生物相容性，不会导致细胞异常转化或死亡，而且具有纳米粒子特殊的结构和表面电荷，能较好的被细胞摄取，并将释放交联系统中的siRNA，使其具有较高的转染效率及生物学效应。

本发明的技术方案是：

一种自组装核酸纳米管制剂，该制剂包括DNA-RNA交联构成管状的自组装纳米制剂。

所述的管状自组装纳米制剂由序列SEQ ID NO：1所示的mTOR siRNA、序列如SEQID NO：2所示的L、序列如SEQ ID NO：3所示的M、序列如SEQ ID NO：4所示的S和序列如SEQID NO：5所示的S′，通过单链核酸分子碱基互补配对合成。

所述的管状自组装纳米制剂中mTOR siRNA、L、M、S、S′的摩尔比为6∶1∶3∶3∶3。

自组装核酸纳米管制剂的制备方法，有以下步骤：

1)取mTOR siRNA、L、M、S、S′的冻干干粉，分别加H₂O稀释，混匀，分别得到mTORsiRNA、L、M、S、S′溶液；

2)取L、M、S、S′溶液在pH 8.0的TAE-Mg²⁺缓冲液中化合合成核酸纳米管溶液，将步骤1)所得的mTOR siRNA添加进入核酸纳米管溶液，放置30min，得到自组装核酸纳米管制剂。

核酸纳米管溶液的合成为：将化合溶液于95℃放置5min，65℃放置30min，50℃放置30min，37℃放置30min，然后22℃放置30min。

所述自组装核酸纳米管制剂中mTOR siRNA、L、M、S、S′的摩尔比为6∶1∶3∶3∶3。

自组装核酸纳米管制剂在制备治疗肺动脉高压的药物中的应用。

本发明所述管状核酸纳米制剂分子量为1,314,655。

本发明所述管状核酸纳米制剂通过单链核酸分子碱基互补配对(adenine简写A，代表腺嘌呤；cytonine简写为C，代表胞嘧啶；guanine简写为G，代表鸟嘌呤；thymine简写T，代表胸腺嘧啶；uracil简写为U代表尿嘧啶；其中A可以与T或U互补配对，G和C互补配对)进行纳米组装。四条单链DNA合成纳米管作为骨架位于中央，siRNA位于纳米管的两端，单一功能性管状核酸纳米结构可靶向递送六个siRNA的DNA纳米粒子(参见图1)。与其它的药物运输载体相比较，自组装的装载siRNA的纳米管制剂具有以下优点：1)核酸是生物相容性材料且易于功能化修饰，应用其作为药物载体可以降低细胞毒性。2)核酸分子标记方法多样，对示踪研究药物的途径和机理提供了较大的便利。3)合成过程简单，核酸的变性和复性容易受温度的控制，其自组装具有较强的可操控性。4)裸露siRNA进入细胞容易被核酸酶降解，自组装纳米管纳米制剂中的siRNA与DNA结合，提高siRNA稳定性，具有一定的缓释作用；5)在管状核酸纳米制剂的基础上，具有核酸的基本性质，可以继续与目前国内外报道的药物运输载体结合，如类脂、脂质体、合成多聚体等，有利于细胞的摄取。

本发明所述管状核酸纳米制剂在介导siRNA的靶向表达或递送方面具有较好的优势，将mTOR siRNA(SEQ ID NO：1)、L(SEQ ID NO：2)序列、M(SEQ ID NO：3)序列、S(SEQ IDNO：4)序列和S′(SEQ ID NO：5)序列先交联，将siRNA包裹于纳米管纳米结构内，siRNA与DNA单链结合，提高siRNA的稳定性，使其不易被核酸酶降解。管状纳米载体的特殊结构和表面电荷在转染试剂的辅助作用下，较易被细胞摄取，使siRNA进入细胞发挥作用。

本发明所述管状核酸纳米制剂，在核酸与X-tremeGENE siRNA Transfectionreagent使用量降低为1比1，使用50nM纳米制剂，对肺动脉平滑肌细胞的转染效率仍然较高，达到75％，同时证实用DNA携带siRNA可以保护siRNA生物学活性并发挥作用；申请人通过实验，其结果表明该自组装核酸纳米材料可显著降低mTOR的mRNA和蛋白表达水平，可增强肺动脉平滑肌细胞的自噬，从而有效抑制细胞的异常增殖。本发明所述制剂在基因研究和治疗中具有巨大的潜力。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1管状核酸纳米制剂结构图；

图2管状核酸纳米制剂结构原子力显微镜扫描图；

图3管状核酸纳米制剂PAGE图；

图4A激光共聚焦观察不同剂量转染试剂对管状核酸纳米制剂细胞摄取的影响；

图4B IPP分析激光共聚焦观察管状核酸纳米制剂的细胞摄取；

图4C统计分析流式细胞仪检测不同剂量转染试剂对管状核酸纳米制剂的细胞转染效率；

图5A激光共聚焦观察不同剂量管状核酸纳米制剂细胞转染摄取；

图5B IPP分析激光共聚焦观察管状核酸纳米制的细胞摄取；

图5C统计分析流式细胞仪检测不同剂量管状核酸纳米制剂转染细胞的平均荧光密度，并与单独mTOR siRNA转染细胞的平均荧光密度进行比较；

图6不同时间点PASSMC细胞mTOR mRNA表达水平及半定量分析；

图7不同时间点PASMC细胞mTOR蛋白表达水平及半定量分析；

图8不同时间点PASMC细胞LC3B及PCNA蛋白表达水平及半定量分析；

图9检测管状核酸纳米制剂对PASMC细胞的生长抑制。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

一.材料

PASMC细胞购自美国模式培养物研究所；

胎牛血清、磷酸盐缓冲液(PBS)购自美国Hyclone公司；

mTOR siRNA、L、M、S、S’序列均由上海生工有限公司合成；

0.25％胰蛋白酶购自Hyclone公司；

4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)购自上海江莱生物科技有限公司；

DMEM培养基、胰蛋白酶、OPTI-MEM为Gibco公司产品；

X-tremeGENE siRNA转染试剂为瑞士Roche公司产品；

蛋白裂解液购自美国Thermo公司；

双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠(SDS)、过硫酸镁、β-巯基乙醇购自江苏聚成精细化工有限公司；

NaCl、KCl、Tri_s碱、乙酸、EDTA、乙酸镁、HCl、酚购自上海时代生物科技有限公司；

mTOR和β-actin引物由上海生工公司合成；

mTOR和β-actin抗体购自Chemicon公司；

羊抗鼠或羊抗兔二抗购自Amersham公司

RT-PCR试剂盒由日本Takara公司提供。

磁力搅拌器购自英国Jenway公司。

二甲基亚砜、MTT购自美国Sigma公司

二.实施例

实施例1：管状核酸纳米制剂的合成

将mTOR siRNA(SEQ ID NO：1)、L(SEQ ID NO：2)、M(SEQ ID NO：3)、S(SEQ ID NO：4)和S′(SEQ ID NO：5)各序列干粉样品，分别用灭菌灭酶的去离子水稀释为0.2μg/μl；将L、M、S、S′溶液在TAE-Mg²⁺缓冲液(pH 8.0)中化合，核酸纳米管(DNA纳米管)在以下条件下自组装合成：95℃放置5min，65℃放置30min，50℃放置30min，37℃放置30min，然后22℃放置30min。随后将确定剂量的mTOR siRNA添加进入纳米管溶液，再次放置30min。得到500μl管状纳米管制剂溶液。该制剂中mTOR siRNA、L、M、S、S′的摩尔比为6∶1∶3∶3∶3，可用于作为治疗肺动脉高压的药物。

管状核酸纳米制剂结构的原子力显微镜扫描图见图2；

将合成的少量样品在6％非变性PAGE胶中冰浴(4℃)下电泳，通过凝胶呈像系统扫描图片，管状核酸纳米制剂电泳图片见图3。

经image J图像分析软件分析，结果显示管状核酸纳米制剂的条带含量约占88.9％，具有较高的纯度。

实施例2：不同剂量转染试剂对管状核酸纳米制剂转染的影响

将处于对数生长期的PASMC用0.25％胰蛋白酶消化，细胞爬片，细胞接种于24孔板内(内置盖玻片)，置于37℃、5％CO₂孵箱中培养48小时后，待细胞密度达50％～60％时即可用于转染；实验分组为：管状核酸纳米制剂(50nM)：X-tremeGENE siRNA的比例分别为1∶0、1∶0.25、1∶0.5、1∶1和1∶2，将携带mTOR siRNA的DNA纳米管纳米制剂按照X-tremeGENE siRNA转染试剂说明书进行转染；转染纳米制剂后置于37℃、5％CO₂孵箱中培养24小时。之后，将24孔板培养基弃掉，用37℃PBS轻轻漂洗3min×3次；沿着培养板壁加入4％多聚甲醛1ml，室温固定5分钟；PBS冲洗5min×3次，弃去PBS液体；加入60μl DAPI染液，室温固定3分钟；PBS冲洗5min×5次，弃去PBS液体；取出盖玻片，使用抗淬灭封片剂(约10μl)封片，避光保存；激光共聚焦显微镜下照相，利用IPP软件对荧光强度进行定量分析。

流式细胞术检测转染效率。转染后并孵育24小时，收集细胞，用PBS清洗贴壁细胞2遍后弃去液体；加入0.25％胰蛋白酶消化细胞，倒置显微镜下观察细胞形态，待细胞逐渐变圆变亮时，吸弃胰蛋白酶，加入培养基终止消化，用滴管反复地轻轻吹打贴壁细胞，制成单细胞悬液；1000rpm，离心10分钟，弃上清，每个样本中加入1ml PBS缓冲液吹打重悬细胞，重复此步骤一次；采用激光光源为氩离子气体激光器，激发波长为530nm，运用Beckman公司流式细胞仪检测，软件分析细胞转染效率，每组实验重复3次。

由激光共聚焦图4A和图4B，DNA纳米管携带的Cy3-mTOR siRNA在细胞中呈红色荧光分布，细胞摄取纳米管制剂的量伴随着转染试剂X-tremeGENE siRNA的增加而升高。类似的，流式细胞仪检测结果(见图4C)也有相同的趋势，在核酸纳米制剂与X-tremeGENE siRNA的比例为1∶1时，转染效率达到了75.8％。

实施例3：不同剂量管状核酸纳米制剂对细胞转染的影响

设计管状核酸纳米制剂的浓度分组为0nM、12.5nM、25nM、50nM和100nM五个浓度，激光共聚焦观察时设单独的Cy3-mTOR siRN浓度为12.5nM为对照组，在流式细胞术检测时每个浓度均以单独的Cy3-mTOR siRNA作为对照，并设空白对照组。其激光共聚焦观察细胞转染效率实验和流式细胞仪检测平均荧光密度的实验操作与实施例2相同。

由激光共聚焦图5A和图5B，管状核酸纳米载体携带的Cy3-mTOR siRNA在细胞中呈红色荧光分布，并且伴随着管状核酸自组装纳米制剂的增加，DNA纳米管进入细胞的量增加。流式细胞仪检测结果(见图5C)显示：核酸纳米制剂较单独的Cy3-mTOR siRNA转染细胞具有更高的平均荧光密度，差异显著。

实施例4：管状核酸纳米制剂对细胞mTOR mRNA、蛋白表达的影响

转染前一天，计数PASMC细胞，细胞爬片，接种于细胞培养瓶中，以50pmol/ml管状核酸纳米制剂转染PASMC细胞，将自组装核酸纳米管纳米材料转染PASMC细胞进行比较。转染后分别在0小时、12小时、24小时和48小时后，应用PBS冲洗2遍；加入TRIzol试剂(美国Invitrogen公司)1ml，按照TRIzol试剂提取说明书进行RNA提取。应用核酸定量分析仪测定RNA浓度和纯度。所有RNA的A260/A280比值均在1.8～2.0之间。然后用逆转录PCR(RT-PCR)试剂检测各时间点mTOR mRNA的情况，β-actin作为阳性对照。引物设计如下：

mTOR(195bp)，

F：5′CGCAGGGAAGGTGATGAGGAAT 3′，(SEQ ID NO：6)

R：5′GCTAAGGAGCAGCCAGGGAGAT 3′；(SEQ ID NO：7)

β-actin(432bp)，

F：5′TCAGGTCATCACTATCGGCAAT3′(SEQ ID NO：8)

R：5′AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA3′(SEQ ID NO：9)。

RT反应条件：45℃、45分钟，95℃、30秒，4℃、10分钟，反应体积为10μl；PCR反应条件为：94℃、3分钟变性，循环条件为94℃、30秒，54℃、45秒，72℃、30秒，35次循环，72℃延伸10分钟，反应体积为50μl。应用自动成像分析仪对PCR产物进行半定量分析。

转染前一天，计数PASMC细胞，细胞爬片，接种于6孔板中，以50nM mTOR siRNA，转染PASMC细胞进行比较。转染48小时后，从培养箱中取出细胞，弃掉细胞培养液，应用预冷的PBS冲洗2遍。每瓶加入细胞裂解液200μl蛋白裂解液提取细胞总蛋白，并测定蛋白浓度。取40μg蛋白经8％聚丙烯酰胺凝胶电泳2小时分离蛋白[聚丙烯酰胺凝胶配方如下(15ml)：去离子水，6.9ml；30％双丙烯酰胺(丙烯酰胺29g加上N，N’-亚甲双丙烯酰胺1g，溶解于100m去离子水)，4ml；Tris缓冲盐溶液(在800ml蒸馏水中溶解8g NaCl、0.2g KCl和3g Tris碱，pH值调至7.4，用蒸馏水定容至1L)，4.8ml；10％SDS：(称取100g SDS慢慢转移到约含0.9L的水的烧杯中，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解。用水定容至1L)，0.15ml；10％过硫酸镁(10g过硫酸镁溶于100ml去离子水中)，0.15ml；β-巯基乙醇，0.008ml)；TEMED，0.009ml]，电泳结束后应用电转印装置将蛋白转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，300毫安电流转膜3小时。应用含5％奶粉的洗膜液-Tris缓冲盐溶液(Tris buffered saline Tween 20，TBST，即100ml TBST中加入5g脱脂奶粉)封闭2小时。分别加入兔抗人mTOR(1∶1000稀释使用)、鼠抗人β-actin(1∶5000稀释使用)TBST稀释的一抗室温孵育2小时，TBST漂洗3次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠或羊抗兔二抗常温孵育1小时，TBST漂洗3次，配制增强化学发光(enhancedchemilumines cence，ECL)显色剂，滴加至PVDF膜上，避光孵育5分钟，将膜放在暗盒中，于X线室曝光显像，采用Alpha InnoTechTM2000凝胶成像系统获取X线片的蛋白条带图象，并应用image J分析蛋白条带的相对吸光度。

检测发现管状核酸纳米制剂携带的mTOR siRNA能够显著下调细胞mTOR mRNA的表达，在24小时，48小时mTOR mRNA显著低于0小时组(*代表p＜0.05)(见图6)，并且WesternBlotting结果也显示管状核酸纳米包裹siRNA能干扰mTOR蛋白的表达，较单独转染siRNA的干扰效果明显增强(见7)，说明管状核酸纳米制剂在细胞中能够稳定的发挥作用。

实施例5：管状核酸纳米制剂对细胞LC3B、PANA蛋白表达的影响。

转染前一天，计数PASMC细胞，细胞爬片，接种于6孔板中，以50nM mTOR siRNA，转染PASMC细胞进行比较。转染48小时后，从培养箱中取出细胞，弃掉细胞培养液，应用预冷的PBS冲洗2遍。每瓶加入细胞裂解液200μl蛋白裂解液提取细胞总蛋白，并测定蛋白浓度。取40μg蛋白经12％聚丙烯酰胺凝胶电泳2小时分离蛋白[聚丙烯酰胺凝胶配方如下(15ml)：去离子水，4.9ml；30％双丙烯酰胺(丙烯酰胺29g加上N，N’-亚甲双丙烯酰胺1g，溶解于100m去离子水)，6ml；Tris缓冲盐溶液(在800ml蒸馏水中溶解8g NaCl、0.2g KCl和3g Tris碱，pH值调至7.4，用蒸馏水定容至1L)，3.8ml；10％SDS：(称取100g SDS慢慢转移到约含0.9L的水的烧杯中，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解。用水定容至1L)，0.15ml；10％过硫酸镁(10g过硫酸镁溶于100ml去离子水中)，0.15ml；β-巯基乙醇，0.008ml)；TEMED，0.006ml]，电泳结束后应用电转印装置将蛋白转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，300毫安电流转膜1小时。应用含5％奶粉的洗膜液-Tris缓冲盐溶液(Tris buffered saline Tween 20，TBST，即100ml TBST中加入5g脱脂奶粉)封闭2小时。分别加入兔抗人LC3B(1∶500稀释使用)、PANA(1∶1000稀释使用)、鼠抗人β-actin(1∶5000稀释使用)TBST稀释的一抗室温孵育2小时，TBST漂洗3次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠或羊抗兔二抗常温孵育1小时，TBST漂洗3次，配制增强化学发光(enhanced chemilumines cence，ECL)显色剂，滴加至PVDF膜上，避光孵育5分钟，将膜放在暗盒中，于X线室曝光显像，采用Alpha InnoTechTM2000凝胶成像系统获取X线片的蛋白条带图象，并应用image J分析蛋白条带的相对吸光度。

检测发现管状核酸纳米制剂携带的mTOR siRNA能够显著增强细胞LC3B蛋白表达，同时有效抑制细胞PCNA蛋白表达。在24小时，48小时及72小时，LC3B均显著高于0小时组(*代表p＜0.05)，且在48小时最明显；PCNA随时间逐渐下降(见图8)，说明管状核酸纳米制剂可以诱导细胞自噬，并抑制细胞的增殖。

实施例6：管状核酸纳米制剂对PASMC细胞增殖的影响

将处于对数生长期的PASMC用0.25％胰蛋白酶消化，进行细胞计数，制成细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔加入100μl细胞悬液，细胞密度为1×10⁴细胞/孔。设置0nM、12.5nM、25nM、50nM 1和100nM五组实验，每组设置5个复孔，另设调零孔。置于37℃、5％CO₂孵箱中培养24小时后用于转染，转染培养6小时后，弃去混合液，加入200μl的PBS洗涤残余的转染混合液2次，弃去PBS混合液，更换为含10％胎牛血清的1640培养基，于37℃、5％CO₂孵箱中培养，分别在0小时、12小时、24小时、36小时和48小时，每孔加入5mg/ml MTT溶液10μl，继续培养4小时后终止培养；吸尽孔内液体，每孔加入150ul DMSO，置于水平摇床振荡摇匀10min，使结晶充分溶解；酶标仪检测在490nm波长处各孔的吸光度(A值)，重复实验3次；细胞生长抑制率(Inhibition Rate，IR)按以下公式计算：抑制率(％)＝[(对照组A值-实验组A值)/对照组A值]×100％。

MTT法检测结果显示管状管状管状核酸纳米制剂随着浓度增加，对细胞生长的抑制率显著升高，同一浓度的纳米制剂随转染时间增加，其对细胞生长的抑制也逐渐增加(见图9)，说明装载mTOR siRNA的核酸纳米管制剂能有效的抑制肺动脉平滑肌细胞的生长。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与改进，因此本发明之保护范围当视权利要求所界定者为准。

Claims (4)

1.一种自组装核酸纳米管制剂，其特征在于：该制剂包括DNA-RNA交联构成管状的自组装纳米制剂，所述的管状自组装纳米制剂由序列如SEQ ID NO：1所示的mTOR siRNA、序列如SEQ ID NO：2所示的 L、序列如SEQ ID NO：3所示的M、序列如SEQ ID NO：4所示的S和序列如SEQ ID NO：5所示的S′，通过单链核酸分子碱基互补配对合成，所述的管状自组装纳米制剂中mTOR siRNA、L、M、S、S′的摩尔比为6:1:3:3:3。

2.权利要求1所述制剂的制备方法，其特征在于，有以下步骤：

1）取mTOR siRNA、L、M、S、S′的冻干干粉，分别加H₂O稀释，混匀，分别得到mTOR siRNA、L、M、S、S′溶液；

2）取L、M、S、S′溶液在 pH 8.0的TAE-Mg²⁺缓冲液中化合合成核酸纳米管溶液，将步骤1）所得的mTOR siRNA添加进入核酸纳米管溶液，放置30 min，得到自组装核酸纳米管制剂。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：核酸纳米管溶液的合成为：将L、M、S、S′溶液于95°C放置5 min，65°C放置30 min，50°C放置30 min，37°C放置30 min，然后 22°C 放置30 min。

4.权利要求1所述的制剂在制备治疗肺动脉高压的药物中的应用。