CN109833307B - pH和ATP响应型纳米载体的制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种pH和ATP响应型纳米载体的制备与应用，所述pH和ATP响应型纳米载体包括核酸纳米载体与固载在核酸纳米载体上的抗肿瘤药物；所述抗肿瘤药物为蒽环类抗生素；所述核酸纳米载体包括ATP适配体双螺旋结构和i‑motif的茎环结构。本发明提供的pH和ATP响应型纳米载体利用肿瘤细胞高浓度ATP的特征，促发适配体与其互补序列的解离；利用肿瘤细胞酸性环境，促使i‑motif构象变化，实现药物在胞内的高效、快速释放。

Description

pH和ATP响应型纳米载体的制备与应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种pH和ATP响应型纳米载体的制备与应用。

背景技术

肿瘤的治疗以化疗和放疗为主要手段。传统小分子化学药物治疗效果好，但存在水溶性差、生物利用度低、毒性强等缺点，需要大剂量给药，给病人带来很大的毒副作用(Chari R V J,Miller M L,Widdison W C.ChemInform Abstract:Antibody—DrugConjugates:An Emerging Concept in Cancer Therapy[J].Cheminform,2014,45(22).)。以强效抗肿瘤药物道诺霉素为例，其主要通过嵌入DNA双链中形成稳定的复合物，影响DNA的结构和功能，阻止DNA复制和RNA的合成而发挥作用的，具有很强的抗肿瘤活性，但因其缺乏肿瘤靶向性、毒副作用大，临床应用受到很大限制。

药物载体成功将药物分子递送至肿瘤细胞是肿瘤治疗的一个重要保障。目前，已经报道了许多药物传递载体，如高分子聚合物、阳离子脂质体、各种纳米材料、病毒衣壳等。这些传递系统的有效性已被证实，然而其大部分为外源性物质，缺乏组织特异性且具有潜在毒性。DNA纳米系统作为运载体已越来越受到重视，相对于其它药物传递材料，DNA纳米载体，因其自身特性，通常情况下通过受体介导的内吞方式进入肿瘤细胞，具有免疫原性低、易生物降解、低毒或无毒、结构稳定、合成简单等优点，是一种非常理想的递送平台(Kovacic J C,Mercader N,Torres M,et al.Epithelial-to-mesenchymal andendothelial-to-mesenchymal transition:from cardiovascular development todisease.[J].Circulation,2012,125(14):1795-808.)。

智能化药物运输系统可以实现抗肿瘤药物的高效递送及肿瘤细胞内的快速释放，利用胞内微环境与外界的细微差别对载体结构进行合理设计，实现药物在胞内释放的高强度、高速度和专一性，保证良好的药物治疗效果(Yoo J W,Lee C H.Drug deliverysystems for hormone therapy[J].Journal of Controlled Release Official Journalof the Controlled Release Society,2006,112(1):1-14.)。

ATP作为生命活动的直接供能物质，在胞内胞外广泛存在，而其在胞内的浓度要远大于其在胞外的浓度，这种现象在代谢旺盛的肿瘤细胞中更加明显。利用胞内胞外浓度的显著差异，基于ATP aptamer-ATP特异性识别作用，有很多响应型运输体系被设计合成。

i-motif是一类富含胞嘧啶的核酸序列，通过连续-CG-碱基序列的设计在其上装载道诺霉素药物分子，在肿瘤微酸性环境中，由质子化的胞嘧啶和非质子化的胞嘧啶杂合形成独特的四链体结构，构象变化导致序列无法与其碱基配对进而促发药物释放，实现药物的递送。这种基于构象变化的设计能够对肿瘤低酸环境产生高效响应，达到智能化递送药物的目的，从而降低药物对人体的毒副作用，且能够通过连续序列长度的设计方便的调整载药量。

基于此，有必要设计合成一种能够特异性识别、并能在肿瘤特异环境中起效的载体，实现高效治疗肿瘤疾病。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种pH和ATP响应型纳米载体的制备与应用，通过设计一段核酸序列，一部分为富含连续-GC-序列的ATP响应型核酸适配体与其cDNA形成双链，另一部分为i-motif，两者之间用一段linker连接。将道诺霉素分子插入到核酸适配体和i-motif的-GC-序列区；用肿瘤细胞高浓度ATP的特征，促发适配体与其互补序列的解离；利用肿瘤细胞酸性环境，促使i-motif构象变化，实现药物在胞内的高效、快速释放。

为解决上述问题，本发明提供如下方案：

一方面，本发明在于提供一种pH和ATP响应型纳米载体，包括核酸纳米载体与固载在核酸纳米载体上的抗肿瘤药物；所述抗肿瘤药物为蒽环类抗生素；所述核酸纳米载体包括ATP适配体双螺旋结构和i-motif的茎环结构。

进一步地，所述蒽环类抗生素为阿霉素、道诺霉素、伊达比星、米托蒽醌或表阿霉素。

进一步地，所述核酸纳米载体与蒽环类抗生素的摩尔比为1:1～10。优选地，摩尔比为1:2；1:3；1:5；1:6；1:8；1:10。

进一步地，所述核酸纳米载体的核苷酸序列包括ATP aptamer-i-motif段核苷酸序列和cDNA段核苷酸序列；

所述ATP aptamer-i-motif段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，具体为5’-ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGTTTTTCGCCCCTAACCCTAACCCTAACCCTGCG-3’；

所述cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，具体为5’-ACTCCCCCAGGT-3’；

所述ATP aptamer-i-motif中ATP aptamer部分的前12个碱基与cDNA互补退火形成ATP适配体双螺旋结构，所述ATP aptamer-i-motif中的imotif部分退火后形成茎环结构；具体如图1所示。

另一方面，本发明在于提供一种pH和ATP响应型纳米载体的制备方法，具体包括如下步骤：

步骤1：核酸纳米载体的制备：取ATP aptamer-i-motif溶液、cDNA溶液、退火液按1：1：1的摩尔比例混匀后进行退火即得；

步骤2：蒽环类抗生素固载：将步骤1所得的核酸纳米载体溶液，加入蒽环类抗生素溶液中混匀后进行固载，即得pH和ATP响应型纳米载体。

进一步优选地，所述退火液中含200mM KCl、4mM MgCl₂、28mM Tris-HCl。

进一步优选地，所述ATP aptamer-i-motif溶液的制备过程如下：向ATP aptamer-i-motif加入无核酸酶水，溶成浓度为100mM的溶液。

进一步地，所述ATP aptamer-i-motif的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，具体为5’-ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGTTTTTCGCCCCTAACCCTAACCCTAACCCTGCG-3’。其中，ATPaptamer段的核苷酸序列为5’-ACC TGG GGG AGT ATT GCG GAG GAA GGT；link段的核苷酸序列为TTT T；i-motif段的核苷酸序列为5’-CG CCC CTA ACC CTA ACC CTA ACC CTG CG-3’。

进一步优选地，所述cDNA溶液的制备过程如下：向cDNA加入无核酸酶水，溶成浓度为100mM的溶液。

进一步地，所述cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，具体为5’-ACT CCC CCAGGT-3’。

进一步优选地，所述退火的条件为：95℃加热10mins，然后缓慢降至室温。

进一步地，所述步骤2中固载在冰浴避光环境中进行4h。

进一步地，所述核酸纳米载体与蒽环类抗生素的摩尔比为1:10。

另一方面，本发明提供一种pH和ATP响应型纳米载体在制备治疗肿瘤疾病药物中的用途。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供一种pH和ATP响应型纳米载体的制备与应用，所述pH和ATP响应型纳米载体将单一的化疗药道诺霉素与核酸纳米载体结合后，增加了药物的生物相容性，并赋予其靶向性，为减少化疗药物对正常细胞杀伤作用提供一种可能。

本发明提供的pH和ATP响应型纳米载体中的核酸纳米载体包含两个部分：一部分为富含连续-GC-序列的ATP响应型核酸适配体与其cDNA形成的双链结构，另一部分为i-motif，两者之间用一段linker连接；而道诺霉素分子插入到核酸适配体和i-motif的-GC-序列区。所提供的pH和ATP响应型纳米载体在ATP和酸性环境中具有双响应释放的特征，而且在血清中稳定，具有抗酶解能力。只有在肿瘤细胞高浓度的ATP和酸性环境特征下，才实现肿瘤药物的选择性靶向解离，实现药物在肿瘤细胞内的高效快速释放，达到高效定点抑制肿瘤增殖的作用的目的。

附图说明

图1(a)Aaim@DNM递药系统工作机制：pH和ATP响应型纳米载体载药及可控释放药物原理：纳米载体载药被细胞内吐进入胞内，一旦进入癌细胞胞内偏酸和高浓度ATP环境，马上响应释放药物，达到抗癌药物的高效运载，靶向运送至癌细胞的效果。(b)pH和ATP响应型给药系统Aaim@DNM在正常细胞环境(中性pH、低浓度ATP)和癌细胞环境(酸性pH、高浓度ATP)中的药物固载与释放。

图2本发明实施例1药物固载的荧光图。

图3-a为pH＝7.4时本发明所制备的纳米载体对ATP响应释放。

图3-b为pH＝5.6时本发明所制备的纳米载体对ATP响应释放。

图3-c为本发明pH和ATP响应型纳米载体相对pH的响应释放图。

图3-d为本发明pH和ATP响应型纳米载体相对ATP和pH的双响应释放图。

图4为本发明pH和ATP响应型纳米载体的耐核酸酶的稳定性考察；图中，1-4依此为Aaim、Aaim+DNase I、Aaim@DNM、Aaim@DNM+DNase I。

图5为本发明pH和ATP响应型纳米载体在FBS中的稳定性考察；图中，1-8依次为无血清的Aaim@DNM纳米粒子，Aaim@DNM与血清孵育0h、3h、6h、9h、12h、24h和48h。

图6为本发明pH和ATP响应型纳米载体的细胞毒性试验结果图。图6-a是纯药物DNM和本发明所制备的纳米载体对HepG2细胞的细胞毒性，图6-b是纯药物DNM和本发明所制备的纳米载体对LO2细胞的细胞毒性，图6-c是前两图的IC50值汇总。

图7为本发明pH和ATP响应型纳米载体对细胞的凋亡检测结果图。(a)HepG2细胞-空白对照组、(b)HepG2细胞-DNM组、(c)HepG2细胞-Aaim@DNM组、(d)LO2细胞-空白对照组、(e)LO2细胞-DNM组、(f)LO2细胞-Aaim@DNM组。

图8为本发明pH和ATP响应型纳米载体对细胞影响情况的周期检测结果图。(a)HepG2细胞-空白对照组、(b)HepG2细胞-DNM组、(c)HepG2细胞-Aaim@DNM组、(d)LO2细胞-空白对照组、(e)LO2细胞-DNM组、(f)LO2细胞-Aaim@DNM组、(g)HepG2细胞周期(图8a、8b、8c的整合)、(h)LO2细胞周期(图8d、8e、8f的整合)。

图9为考察不同细胞对本发明pH和ATP响应型纳米载体的摄取情况图。(a)HepG2(b)LO2

图中，fluorescence intensity荧光强度；wavelength波长。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

以下实施例中如无特殊说明，所使用原料均来源于市售，所采用方法均为本领域技术人员公知的常规操作方法。

实施例1 pH和ATP响应型纳米给药系统的制备：

主要反应溶液的配制：

退火缓冲液(200mM KCl，4mM MgCl₂，28mM Tris-HCl)：准确称取0.0190g MgCl₂，0.7456g KCl，0.1695g Tris，加适量水溶解，盐酸调节pH＝8.0，定容至50mL。

1.核酸序列退火

ATP aptamer-i-motif和cDNA的单链DNA干粉分别加入无核酸酶水，分别溶成浓度为100mM的核酸溶液。

将ATP aptamer-i-motif溶液、cDNA溶液、退火液按1：1：1的比例加入PCR管中震荡混匀，混合液体在PCR扩增仪中进行退火程序(95℃加热10mins，然后缓慢降至室温)，以形成ATP适配体双螺旋结构(ATP-aptamer-cDNA，以下简称Aa)和i-motif(以下简称im)的茎环结构，得到核酸纳米载体(以下简称Aaim)溶液。

2.药物固载

道诺霉素(DNM)拥有自身荧光，当与DNA结合后，其荧光淬灭。利用这一特性来测定Aaim对DNM药物分子的固载情况。

取6μl浓度为333.3uM的DNM溶于2.5ml的超纯水中，荧光分光光度计测其荧光，每加入一次1μl浓度为33.3uM的退火后的Aaim，需待充分混匀反应5min后，测其荧光改变情况，直至荧光强度保持不变，加入过程中的荧光检测结果如图1所示。DNM的荧光条件设置为激发波长Ex＝475nm，发射波长扫描Em＝500-750nm。

图2结果显示：DNM溶液中随着加入Aaim加入量的逐渐增加，DNM的荧光强度逐渐变弱，直至荧光强度基本保持不变，说明已达最大固载比。最终测得DNM的最大固载比为DNM：DNA＝10:1(摩尔比)。

按最大固载比取Aaim和DNM加入离心管中，震荡均匀后在冰浴避光固载4h即得到固载药物的核酸纳米载体溶液Aaim@DNM，4℃避光保存备用。

实施例2 pH和ATP响应型纳米载体的相关性能考察

1.纳米系统Aaim@DNM响应性释放的考察

ATP响应：将Aaim@DNM分别用pH为7.4的PBS缓冲液稀释至2.5ml，测定其荧光值，后逐次加入一定量400mM ATP溶液，荧光测量参数同实施例1，测定其荧光强度的变化。结果如图3-a所示。类似的，得到pH＝5.6时的荧光强度变化检测结果如图3-b所示。

由图3-a和图3-b可知，随着ATP的增加，荧光强度变化越大，Aaim@DNM释放DNM越多。

pH响应：将Aaim@DNM分别用pH为3.8、5.6、6.8、7.4的PBS缓冲液稀释至2.5ml，分别测定其荧光值。荧光检测结果如图3-c所示。

由图3-c可知，随着pH的降低，荧光强度变化越大，Aaim@DNM释放DNM越多。

由图3-d可知，pH值和ATP浓度显著影响载药体系药物的释放。

2.纳米系统Aaim@DNM的稳定性考察

Aaim@DNM纳米载药体系主要用于肿瘤细胞的药物输送及靶向治疗，因此需要考察整个复合体系的抗酶解能力及在血清中的稳定性。

主要溶液的配制：

10XTBE储备液：称取10.8058g的Tris，0.7426g的乙二胺四乙酸(EDTA)、5.5009g的硼酸于容器中，加水溶解，调ph至8.3，定量至100mL。

1XTBE电泳缓冲液：取10XTBE储备液稀释100倍得到。

1％的琼脂糖胶：称量0.15g琼脂糖加至15ml的1XTBE缓冲液中，加热使其溶解成透明溶液，待温度降至60℃左右后加入2μl 4S Green Nucleic Acid Stain(核酸染料)，摇匀倒入制胶板中，静置二十分钟凝固。

分别取退火后Aaim、Aaim@DNM纳米材料各两管，其中一管加入1U的DNase I作为实验组，另一管加入等体积的无核酸酶水作为对照组。37℃恒温孵育30min后，取样进行凝胶电泳。实验组和对照组溶液各取8μL，分别加入2μL Loading buffer，震荡混匀后上样。120V恒压电泳30min后取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像仪中观察拍照。结果如图4所示。

由图4可知，条带2略暗于条带1，说明Aaim与酶作用，但有一部分可稳定存在。条带4与条带3亮度相差不大，说明固载药后Aaim@DNM抗酶解能力增强。

取Aaim@DNM 27μl。加入3μl的FBS(FBS终浓度为10％)，混匀，37℃恒温水浴孵育。选择0h，3h，6h，9h，12h，24h，48h时间点取样。所取样品均为8μL，加入2μl Loading buffer(上样缓冲液)，震荡混匀后上样至琼脂糖凝胶上样孔中，设置电压120V，恒压电泳30min。凝胶成像仪观察拍照。结果如图5所示。

由图5可知，随着时间的延长，条带没有被完全降解，血清环境下Aaim@DNM纳米系统大部分仍可稳定存在。总之，本发明制备的纳米载药体系抗酶解能力和抗血清能力良好。

3.细胞毒性实验-MTT实验

为验证Aaim@DNM对肿瘤细胞的选择性释放，用人的正常肝细胞LO2和人的肝癌细胞HepG-2测试Aaim@DNM的控释效果。

取对数期生长状况良好的LO2细胞和HepG-2细胞，分别用0.25％胰酶消化成单细胞悬液，血球计数板进行细胞计数后，用完全培养基调节细胞密度为1×10⁴cell/ml，分别接种于96孔板中，每孔200μl，于37℃、5％CO₂培养箱中培养24h；细胞贴壁后，每组每孔加入含有Aaim@DNM样品的培养基100μl，设置6个浓度，每个浓度设置4个复孔，培养箱中培养48h。在培养结束前4h，吸出板中含药物的培养基，加含有10％MTT的培养基100μl，继续培养4h，结束后弃上清，每孔再加入150μl DMSO，轻微震荡反应10min，使结晶颗粒充分溶解，置酶标仪上于490nm波长处测定OD值。

计算细胞增殖抑制率，存活率＝(OD_实验-OD_空白)/(OD_对照-OD_空白)×100％。将存活率与药物浓度作图，得出剂量反应曲线，计算出相应细胞株的IC50值，即半数抑制浓值。所有实验均重复3次后取平均值。具体结果如图6。

HepG2肝癌细胞：Aaim@dnm组IC50＝0.4736uM，DNM组IC50＝0.6433uM

LO2正常肝细胞：Aaim@dnm组IC50＝0.9020uM，DNM组为IC50＝0.5784uM

由图6可知，本发明所制备的载体给药对HepG2细胞的细胞毒性与纯药物效果相当，甚至更强；而本发明所制备的载体给药对于癌细胞的细胞毒性是正常细胞的1.9倍。(IC50值越小，细胞毒性越大。)

4.细胞凋亡检测

取对数生长期的HepG-2细胞和LO2细胞，用胰酶消化1-2min，吸出胰酶加入新鲜培养液用移液枪轻轻吹打成单细胞细胞悬液，计数后以1×10⁶个/孔的细胞密度接种到6孔板中。将细胞在37℃，5％CO₂的培养箱中培养24h，使细胞融合度达到80％，取出6孔板，吸去培养基无菌PBS洗两遍，空白组加入新鲜培养液，阳性对照组加入含DNM的培养液，实验组加入含Aaim@DNM的培养液，培养24h后，收集培养液至离心管中，再用PBS洗两遍，加入不含EDTA的胰酶消化，吸出胰酶，加入之前收集的培养液，轻轻吹打细胞成单个细胞悬液收集至离心管中，1000rpm，离心5min，弃上清，用PBS清洗2遍后，每管依次加入195μL Annexin V-FITC的结合液、5μL Annexin V-FITC和10μL PI，轻轻混匀，室温条件下避光孵育20min，随即进行流式检测。结果如图7。

从图7可知，Aaim@DNM使HepG-2肝癌细胞大量凋亡(51.7％)，而对LO2正常细胞毒性较小(8.4％)，具有良好的响应性。

5.细胞周期分布

取对数生长期的HepG-2细胞和LO2细胞，用胰酶消化1-2min，吸出胰酶加入新鲜培养液用移液枪轻轻吹打成单细胞细胞悬液，计数后以1×10⁶个/孔的细胞密度接种到6孔板中。将细胞在37℃，5％CO₂的培养箱中培养24h，使细胞融合度达到80％，取出6孔板，吸去培养基无菌PBS洗两遍，空白组加入新鲜培养液，阳性对照组加入含DNM的培养液，实验组加入含Aaim@DNM的培养液，培养24h后，收集培养液至离心管中，再用PBS洗两遍，加入胰酶消化，吸出胰酶，加入之前收集的培养液，轻轻吹打细胞成单个细胞悬液收集至离心管中，1000rpm，离心5min，弃上清，加入1mL冷的70％乙醇，轻轻吹打混匀后放在冰箱4℃固定24h。之后离心弃上清加入1mL冷的PBS重悬，然后再次离心弃上清。用手指轻弹试管底部，让细胞分散均匀，加入0.5mLPI染色液染色，让其充分与细胞接触，37℃避光孵育30min，随即进行流式检测。结果如图8。

由图8中可明显看到Aaim@DNM将癌细胞有效阻滞在G2/M期，通过阻滞细胞周期进而影响癌细胞正常生长。

6.纳米载药体系的细胞摄取

因DNM自身具有红色荧光，所以利用激光共聚焦显微镜考察细胞对Aaim@DNM的摄取及其在不同细胞内的药物释放情况。具体步骤为：细胞培养如上述细胞毒性实验-MTT实验培养，细胞密度为1×10⁵细胞/ml，接种于6孔板中，培养24h，分别加入空白、Aaim@DNM或DNM培养6h，去掉培养液，用PBS洗3次，每孔中加入DAPI进行核染，荧光显微镜拍照，拍照结果如图9所示。

正常的细胞核呈圆形，凋亡细胞的核呈致密浓染或呈碎块状。故可以此观察细胞给药后的凋亡情况。道诺霉素有自身荧光，一旦被释放就可被检测到，荧光越强释放量越大。由图9可知，以DNM的观察结果作为对照，Aaim@DNM在HepG-2肝癌细胞大量释放，有细胞杀伤作用，在LO2正常细胞环境中少量释放，毒性不明显，具有良好的响应性。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广东药科大学

<120> pH和ATP响应型纳米载体的制备与应用

<130> 2019

<141> 2019-03-20

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

acctggggga gtattgcgga ggaaggtttt tcgcccctaa ccctaaccct aaccctgcg 59

<210> 2

<211> 12

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

actcccccag gt 12

Claims (6)

1.一种pH和ATP响应型纳米载体，其特征在于，包括核酸纳米载体与固载在核酸纳米载体上的抗肿瘤药物；所述抗肿瘤药物为蒽环类抗生素；所述核酸纳米载体包括ATP适配体双螺旋结构和i-Motif的茎环结构；

所述蒽环类抗生素为道诺霉素；

所述核酸纳米载体与蒽环类抗生素的摩尔比为1:1～10；

所述核酸纳米载体的核苷酸序列包括ATP aptamer-i-motif段核苷酸序列和cDNA段核苷酸序列；所述ATP aptamer-i-motif段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述ATP aptamer-i-motif中ATP aptamer部分的前12个碱基与cDNA互补退火形成ATP适配体双螺旋结构，所述ATP aptamer-i-motif中的imotif部分退火后形成茎环结构。

2.一种权利要求1所述的pH和ATP响应型纳米载体的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

步骤1：核酸纳米载体的制备：取ATP aptamer-i-Motif溶液、cDNA溶液、退火液按1：1：1的摩尔比例混匀后进行退火即得；

步骤2：蒽环类抗生素固载：将步骤1所得的核酸纳米载体溶液，加入蒽环类抗生素溶液中混匀后进行固载，即得pH和ATP响应型纳米载体；

所述ATP aptamer-i-Motif的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.根据权利要求2所述的pH和ATP响应型纳米载体的制备方法，其特征在于，所述退火液中含200mM KCl、4mM MgCl₂、28mM Tris-HCl；

所述ATP aptamer-i-Motif溶液的制备过程如下：向ATP aptamer-i-Motif加入无核酸酶水，溶成浓度为100mM的溶液；

所述cDNA溶液的制备过程如下：向cDNA加入无核酸酶水，溶成浓度为100mM的溶液。

4.根据权利要求2所述的pH和ATP响应型纳米载体的制备方法，其特征在于，所述退火的条件为：95℃加热10mins，然后缓慢降至室温。

5.根据权利要求2所述的pH和ATP响应型纳米载体的制备方法，其特征在于，所述步骤2中固载在冰浴避光环境中进行4h；所述核酸纳米载体与蒽环类抗生素的摩尔比为1:10。

6.权利要求1所述的pH和ATP响应型纳米载体或权利要求2～5任一所述的方法制备的pH和ATP响应型纳米载体在制备治疗肿瘤疾病药物中的用途。

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