CN116077670A - 一种基于dna四面体纳米团簇的靶向载药系统及其构建方法与应用 - Google Patents

一种基于dna四面体纳米团簇的靶向载药系统及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于DNA四面体纳米团簇的靶向载药系统及其构建方法与应用。所述靶向载药系统包括由7条DNA探针组装而成的DNA四面体、T4 DNA连接酶、sgc8核酸适配体和蒽环类抗癌药物。该靶向载药系统具有良好的血清稳定性、靶向选择性，且具有超高载药量，能够选择性地将抗癌药物递送至靶细胞并杀死癌细胞，在抗癌治疗方面显示出巨大潜力。此外，DNA四面体纳米团簇表面的核酸适配体会在运输过程中被非特异性降解，而内部的核酸适配体能够移动到表面以补偿表面核酸适配体的降解，进一步维持纳米团簇的特异性，该组装方式可保证载药系统在递送过程中一直具有优异的靶向效果。

Description

一种基于DNA四面体纳米团簇的靶向载药系统及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术和生物医药技术领域，具体涉及一种基于DNA四面体纳米团簇的靶向载药系统及其构建方法与应用。
背景技术
众所周知，化疗药物广泛用于癌症治疗。虽然化学疗法是癌症治疗最广泛的临床方法之一，但化学治疗剂对健康组织和器官的脱靶毒性阻碍了其进一步的临床应用。理想的生物相容性、高载运能力和在肿瘤部位的充分积累是有前景的化疗药物递送载体的三个先决条件，以确保药物在肿瘤组织中的高浓度并减少脱靶效应。尽管完全由具有天然生物相容性、高度可编程性和可忽略免疫原性的DNA制成的纳米结构作为抗癌药物递送载体显示出巨大的潜力，但目前的DNA纳米结构载体由于其相对较低的载药效率和对内源性核酸酶的固有敏感性，可能导致体内早期药物泄漏和/或肿瘤靶向能力丧失。因此，开发具有细胞类型特异性识别能力、药物高负载率并且可以响应肿瘤微环境中释放药物的理想疗法是当务之急。
作为一种天然存在的生物大分子，DNA具有高度的水溶性和生物相容性。由于其独特的 Watson-Crick碱基配对特征、易于合成和结构明确，DNA可作为自组装的理想元件，能够可控组装成一维、二维和三维（1D、2D 和 3D）的纳米结构。由于DNA组件的聚合物性质，通过改变粘性末端碱基对的数量和调节ssDNA和dsDNA的结合，可以很容易地调整DNA组件的柔韧性和刚性。通过其固有的识别能力，非特异性摄取或通过靶向性基团的功能化，将这些DNA 纳米结构用做药物传递载体在诊断和治疗方面也取得了相当大的研究进展。此外，初步研究表明，致密的DNA纳米结构（如DNA四面体）具有更强的抗核酸酶降解能力，并具有更好的细胞摄取特性。然而，核酸纳米载体在有效递送药物方面仍存在一些不足之处，如缺乏肿瘤靶向活性。到目前为止，研究人员已经开发出用于靶向药物传递的各种配体，其中包括抗体、多肽、小分子和适体。与广泛使用的抗体相比，适体具有生产成本低、免疫原性和毒性低、组织渗透速度快、结合亲和力高等优点，是常规化疗药物靶向运输的理想选择。核酸适体是一种短的单链寡核苷酸，具有独特的分子内构象和对同源靶标的特异性识别能力。更有趣的是，核酸适体可以很容易地整合到DNA纳米结构中，而不需要任何化学修饰。在这方面，已经有不少适体整合的DNA纳米结构被提出用于靶向给药，以提高疗效和减少副作用。
目前，基于DNA纳米结构的药物传递主要针对癌细胞。作为一种很有前途的药物输送候选材料，DNA纳米结构可以很容易地通过膜屏障，其具有一系列优异的特征，其中包括：（1）可预测和明确的结构；（2）较高的药物负载能力；（3）优良的生物相容性；（4）生理条件下结构稳定；（5）能够被细胞内在化。凭借这些优势，DNA纳米结构已被用于构建体内和体外的化疗药物装载平台。核酸纳米结构的药物输送系统的独特特点是模块化，这意味着核酸纳米对象的大小和修饰（配体或药物分子）在其上或其中的位置可以在纳米级精确控制，核酸对象的形状和灵活性也可以微调。正是这种模块性使得核酸纳米技术成为一个强大的平台，能够以可控的方式引入许多方面，用于靶向抗癌药物的精准递送。
基于上述原因，我们设计了一种基于DNA四面体纳米团簇的靶向载药系统，它由多层堆叠的小DNA构建块（DNA四面体单元）与多价核酸适体和物理插入层的化疗药物组成，以特异性、高效的靶向肿瘤。该靶向载药系统组装过程可控，其中DNA四面体纳米团簇的尺寸均匀、稳定性好。该靶向载药系统由于加载了核酸适体可以选择性靶向靶细胞，并且可以针对不同的靶细胞设计不同的靶向适体。该靶向载药系统具有高载药量，可以精准控制治疗药物的配比，而且在正常生理环境中长期稳定，能够选择性的在肿瘤微环境中释放。该靶向载药系统由于加载了抗癌药物，能够选择性地将抗癌药物递送至靶细胞并杀死癌细胞，在抗癌治疗方面显示出巨大潜力。除此之外，DNA四面体纳米团簇表面的核酸适配体会在运输过程中被非特异性降解，而内部的核酸适配体能够移动到表面以补偿表面核酸适配体的降解，进一步维持纳米团簇的特异性，该组装方式可以保证载药系统在递送过程中一直具有优异的靶向效果。综上，本发明所构建的基于DNA四面体纳米团簇的靶向载药系统具有设计和制备简单、生物相容性好、负载能力高、选择性识别等优势，这使得基于DNA四面体纳米团簇的靶向载药系统成为多功能生物成像和药物输送的一个有效平台。
发明内容
本发明的目的在于基于DNA四面体基本单元来制备DNA纳米团簇的精准靶向载药系统，进而提供一种基于DNA四面体纳米团簇的靶向载药系统及其制备方法与应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明首先提供了一种基于DNA四面体纳米团簇的靶向载药系统，所述的载药系统是由由七条DNA探针组装而成的DNA四面体（其中有6条DNA探针在DNA序列的5’端修饰磷酸化基团）、T4 DNA连接酶、sgc8核酸适配体探针和抗癌药物组成；
所述抗癌药物为蒽环类等抗癌药物；
所述的用于组装DNA四面体的七条DNA探针如下：
DNA四面体组装探针1（T1）： 5’-p-AGGAGATACACGATTACAGCTTGCTACACGATTCAGACTTAGGAATGTTCGATCAGGCAGGGTCCAAT-3’，
DNA四面体组装探针2（T2）： 5’-p-GCAGTTGACACGAACATTCCTAAGTCTGAAATTTATCCATCGCCATAGTAGACCTATCACCGTGGAAG -3’，
DNA四面体组装探针3（T3）： 5’-ATGGACCATCTCGAGACATATTTCGTGTAGCAAGCTGTAATCGACTCTACCCTAAGTAAGCAAGACACAACTACTATGGCGATGGATAAA-3’，
DNA四面体组装探针4（T4）： 5’-p-TAAGCCAGCCATAAGTCAGTATCTCCTATTGGACCCTGCCTGAACACTGATCCG-3’，
DNA四面体组装探针5（T5）： 5’-p-GCGAGTATGGAGTCAACTGCCTTCCACGGTGATAGGATCGAATGCTGGATACGT-3’，
DNA四面体组装探针6（T6）： 5’-p-CAGCATTCGAAGTCCAGTTTCTGGACATGTGTCTTGCTTACTTAGGGTAGAGAACCACGTTTCGTGGTAGACTTATGGC-3’，
DNA四面体连接探针（LS）： 5’-p-TGGCTTACGGATCAGTGAACCATACTCGCACGTATC-3’；
所述的sgc8核酸适配体探针为： 5’-TATGTCTCGAGATGGTCCATTTTTTATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA-3’。
本发明进一步提供了上述一种基于DNA四面体纳米团簇的靶向载药系统的构建方法，包括以下步骤：
S1：基于DNA四面体的靶向DNA纳米团簇材料的构建：
S1-1：首先将浓度均为10 µM的DNA探针T1~T6和LS各取0.5 µL，与2.5µL 10×T4DNA连接酶缓冲液（400 mM 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，100 mM 氯化镁，100 mM 二硫苏糖醇，5 mM 腺嘌呤核苷三磷酸，pH=7.8）和18 µL超纯水共同加入到0.5 mL离心管中，使用微量移液器充分混合均匀；
S1-2：将步骤S1-1得到的混合溶液置于金属加热块上，在90℃加热反应5分钟后，逐渐冷却到室温以确保DNA四面体的成功组装（此冷却的过程约耗费1-2 h）；
S1-3：待步骤S1-2结束后，向反应液中加入0.5 µL 10 µM的sgc8核酸适配体，并在37℃下孵育2 h，得到sgc8配置的DNA四面体结构；
S1-4：待步骤S1-3结束后，向反应液中添加0.5µL 400 U/µL的T4 DNA连接酶，并在16℃条件下孵育过夜以促进靶向DNA纳米团簇的组装；
S1-5：待步骤S1-4结束后，将反应液在65℃下灭酶10分钟以停止反应，即得到所述基于DNA四面体的靶向DNA纳米团簇材料（sgc8-eNC）；
S2：基于DNA四面体纳米团簇的靶向载药系统的构建：
将步骤S1制得的靶向DNA纳米团簇材料sgc8-eNC（终浓度为3.5 nM）和抗癌药物（终浓度为20 µM）在1×T4 DNA连接酶缓冲液中共同孵育，在37℃的黑暗环境中过夜孵育，孵育完成后即得到所述基于DNA四面体纳米团簇的靶向载药系统。
本发明还提供了一种由上述的靶向载药系统改造而来的通用型靶向载药系统，所述通用型靶向载药系统为针对靶细胞改变载药系统中的核酸适配体探针的序列所得。
进一步的，上述通用型靶向载药系统为针对靶细胞MCF-7人乳腺癌细胞改变载药系统中的核酸适配体探针的序列所得；改变后的核酸适配体探针的序列为：
5’-TATGTCTCGAGATGGTCCATTTTTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’。
进一步的，上述通用型靶向载药系统为针对靶细胞A549腺癌人类肺泡基底上皮细胞改变载药系统中的核酸适配体探针的序列所得；改变后的核酸适配体探针的序列为：
5’-TATGTCTCGAGATGGTCCATTTTTTTGTGGCCAGTCACTCAATTGGGTGTAGGGGTGGGGATTGTGGGTTG-3’。
本发明还提供了上述一种基于DNA四面体纳米团簇的靶向载药系统在制备靶向肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤选自白血病、淋巴瘤、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌和肺癌。
本发明还提供了上述一种基于DNA四面体纳米团簇的靶向载药系统在生物成像中的应用。
上述一种基于DNA四面体纳米团簇的靶向载药系统中，所述组成DNA四面体的部分DNA探针使用磷酸化基团修饰，该修饰结构可以保证DNA链在T4 DNA连接酶的作用下形成牢固的DNA四面体结构和DNA纳米团簇结构。上述一种基于DNA四面体纳米团簇的靶向载药系统的构建方法中，先使用sgc8核酸适配体与DNA四面体成功组装，然后再使用DNA连接酶将具有靶向效果的DNA四面体组装成为DNA纳米团簇，DNA纳米团簇表面的sgc8核酸适配体会在运输过程中被非特异性降解，而内部的sgc8适配体能够移动到表面以补偿表面sgc8核酸适配体的降解，进一步维持纳米团簇的特异性，该组装方式可以保证载药系统在递送过程中一直具有优异的靶向效果。
本发明的发明原理如下：
首先，通过预先设计的碱基序列互补原则，将七条单链DNA探针通过简单的退火过程自组装成DNA构建块，即为四面体基本单元。DNA探针有二个设计要求：第一，部分DNA探针5’端有磷酸化基团，这可以让DNA结构在T4 DNA连接酶的作用下更为稳固，并且可以由DNA四面体基本单元进而组装成为DNA纳米团簇结构；第二，连接探针的独特设计可以使得DNA四面体基本单元在室温下稳定存在，在T4 DNA连接酶的作用下可以形成大小稳定的DNA纳米团簇结构。DNA四面体基本单元设计示意图见图1。
由于核酸适体能够赋予DNA纳米材料靶向选择性，所以本发明将核酸适体与DNA纳米团簇结合，组成成为一种基于DNA四面体的靶向DNA纳米团簇材料。我们设计的DNA四面体基本单元其结构允许粘性末端指向四个不同的方向，在温度比较低的时候，四面体单元之间的粘性末端杂交较为稳定，在这个低温的条件下，加入连接酶（T4 DNA ligase）将绝大多数的缺口都连接起来，如此，就形成了稳定的sgc8核酸适体探针装载的DNA纳米团簇（sgc8-eNC）。基于DNA四面体的靶向DNA纳米团簇材料的构建流程图见图2。
由于自组装的DNA四面体具有刚性结构，这使构建的基于DNA四面体的靶向DNA纳米团簇材料（sgc8-eNC）拥有优异的稳定性，同时由于逐层排列的小四面体单元提供了大量空间可寻址位点，允许它们与小分子荧光团或治疗剂结合。阿霉素（Dox）作为一种典型的化疗抗癌药物被负载到sgc8-eNC上，形成最终的基于DNA四面体的靶向DNA纳米团簇载药系统（Dox-sgc8-eNC）。当Dox-sgc8-eNC与不同种类的细胞共同孵育时，特异性靶向靶细胞并且选择性地将抗癌药物输送到靶细胞内部，从而杀伤癌细胞。基于DNA四面体纳米团簇的靶向载药系统应用于细胞靶向和治疗的示意图见图2。
本发明的优点在于：
本发明所构建的一种基于DNA四面体纳米团簇的靶向载药系统具有以下几个优点：
（1）该靶向载药系统组装过程可控，其中DNA四面体纳米团簇的尺寸均匀、稳定性好。独特的DNA设计使得DNA链组装成为三维骨架结构，并且末端的磷酸化基团修饰可以保证DNA链在T4 DNA连接酶的作用下可以形成牢固的DNA四面体结构和DNA纳米团簇结构。
（2）该靶向载药系统具有良好的稳定性。首先，与普通DNA纳米材料相比，DNA四面体纳米团簇具有显著增强的血清稳定性；其次，DNA四面体纳米团簇表面的核酸适配体会在运输过程中被非特异性降解，而内部的核酸适配体能够移动到表面以补偿表面核酸适配体的降解，进一步维持纳米团簇的特异性，该组装方式可以保证载药系统在递送过程中一直具有优异的靶向效果。
（3）该靶向载药系统由于加载了核酸适体可以选择性靶向靶细胞，并且可以针对不同的靶细胞设计不同的靶向适体，可用于制备通用型靶向载药系统。
（4）该靶向载药系统具有超高载药量，并且可以精准控制治疗药物的配比，而且在正常生理环境中长期稳定，能够选择性的在肿瘤微环境中释放。
（5）该靶向载药系统能够选择性地将抗癌药物递送至靶细胞并杀死癌细胞，在抗癌治疗方面显示出巨大潜力。
附图说明
图1：靶向DNA纳米团簇中DNA四面体基本单元设计示意图。该DNA四面体包含五个粘性末端，其中四个粘性设计在末端三角形底座上（粘性末端-ia，粘性末端-ib，粘性末端-ii，粘性末端-iii），相邻三角形底座之间不在同一个平面上（其中粘性末端-ia和粘性末端-ib位于顶点i上，粘性末端-ii位于顶点ii上，粘性末端-iii位于顶点iii上），形成三维骨架组装；另一个顶点用于核酸适配体的连接（粘性末端-iv，该末端位于顶点iv上）。部分DNA修饰磷酸化基团（T1，T2，T4，T5，T6和LS）可以保证材料在T4 DNA连接酶的作用下高效连接，而粘性末端iv未磷酸化可以保证适配体的正常连接，且有利于sgc8适配体能够移动到表面以补偿表面sgc8的降解，进一步维持纳米团簇的特异性。
图2：基于DNA四面体的靶向DNA纳米团簇材料的构建流程及其应用于细胞靶向和治疗的示意图。
图3：基于DNA四面体的靶向DNA纳米团簇材料的表征图。其中A为靶向DNA纳米团簇材料的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析：泳道M代表DNA标准条带；泳道1为三个探针（T1、T2 和T3）的杂交产物，构成DNA四面体基本骨架；泳道3为T1、T2、T3和T4的杂交产物；泳道3为T1、T2、T3、T4和T5的混合物；泳道4为T1、T2、T3、T4、T5和T6等六条探针的杂交产物；泳道5为T1、T2、T3、T4、T5、T6和连接探针的混合物，但是不存在T4 DNA连接酶；泳道6为T1、T2、T3、T4、T5、T6和连接探针以及sgc8适体探针的混合物，但是不存在T4 DNA连接酶；泳道7为T1、T2、T3、T4、T5、T6和连接探针以及sgc8适体探针的混合物，存在T4 DNA连接酶，即构建的最终sgc8-eNC材料；图B为靶向DNA纳米团簇材料的AFM表征图像，分别是二维和三维结构，下部分是对粒子横截面的尺寸分析数据。
图4：基于DNA四面体的靶向DNA纳米团簇材料的稳定性分析。图A为靶向DNA纳米团簇材料与10% 新鲜鼠血清孵育不同时间点的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析数据。B为靶向DNA纳米团簇材料与10% 新鲜鼠血清孵育不同时间点的之后对靶细胞的流式分析数据。
图5：基于DNA四面体的靶向DNA纳米团簇材料在细胞靶向识别上的应用。使用激光共聚焦成像研究了基于DNA四面体的靶向DNA纳米团簇材料对CEM（A）、HeLa（B）、Ramos（C）和L02（D）四种细胞的靶向识别能力，其中A、B为sgc8适体识别的靶标癌细胞，C为sgc8适体不识别的靶标癌细胞，D为正常人细胞。
图6：一种基于DNA四面体纳米团簇的靶向载药系统的载药能力和药物选择性释放探究。其中A为精准靶向DNA纳米团簇载药系统的载药能力研究。B为精准靶向DNA纳米团簇载药系统的稳定性情况。
图7：一种基于DNA四面体纳米团簇的靶向载药系统在生物成像和肿瘤靶向给药中的应用。其中A为靶向载药系统在生物成像中的应用，B为靶向载药系统对荷瘤小鼠（HeLa）的靶向给药治疗后的肿瘤体积生长情况。
图8：一种基于DNA四面体纳米团簇的靶向载药系统的通用性评估。其中A为构建了靶向MCF-7癌细胞的载药系统（AS1411-eNC），使用激光共聚焦成像对其进行评估；其中B为构建了靶向A549癌细胞的载药系统（S6-eNC），使用激光共聚焦成像对其进行评估。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。
实施例1 一种基于DNA四面体纳米团簇的靶向载药系统的制备方法，包括以下步骤：
S1：基于DNA四面体的靶向DNA纳米团簇的构建：
S1-1：将浓度均为10 µM的DNA探针T1~T6和LS各取0.5 µL，与2.5µL 10×T4 DNA连接酶缓冲液（400 mM 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，100 mM 氯化镁，100 mM 二硫苏糖醇，5 mM腺嘌呤核苷三磷酸，pH=7.8）和18 µL超纯水共同加入到0.5 mL离心管中，使用微量移液器充分混合均匀；
S1-2：将步骤S1-1得到的混合溶液置于金属加热块上，在90 ℃加热反应5分钟后，逐渐冷却到室温以确保DNA四面体的成功组装（此冷却的过程约需耗费1-2 h）；
S1-3：待步骤S1-2结束后，向反应液中加入0.5 µL 10 µM的sgc8核酸适配体探针，并在37 ℃下孵育2 h，以形成sgc8配置的DNA四面体结构（简称为sgc8-Tetra）；
S1-4：待步骤S1-3结束后，向反应液中加入添加0.5µL 400 U/µL的T4 DNA连接酶，混合均匀后在16℃下过夜，以促进靶向DNA纳米团簇（sgc8-eNC）的组装；
S1-5：待步骤S1-3结束后，将反应液在65℃下失活10分钟以停止连接酶继续反应，即得到所述基于DNA四面体的靶向DNA纳米团簇材料（sgc8-eNC）。
S2：基于DNA四面体纳米团簇的靶向载药系统的构建：
将步骤S1制得的靶向DNA纳米团簇材料sgc8-eNC（终浓度为3.5 nM）和阿霉素（终浓度为20 µM）在1×T4 DNA连接酶缓冲液中共同孵育，孵育条件为：在37℃的黑暗环境中过夜孵育。孵育完成后，即得到基于DNA四面体纳米团簇的靶向载药系统（简称为Dox-sgc8-NC）。
其中，所述DNA探针T1为：
5’-p-AGGAGATACACGATTACAGCTTGCTACACGATTCAGACTTAGGAATGTTCGATCAGGCAGGGTCCAAT-3’；
所述DNA探针T2为： 5’-p-GCAGTTGACACGAACATTCCTAAGTCTGAAATTTATCCATCGCCATAGTAGACCTATCACCGTGGAAG -3’；
所述DNA探针T3为： 5’-ATGGACCATCTCGAGACATATTTCGTGTAGCAAGCTGTAATCGACTCTACCCTAAGTAAGCAAGACACAACTACTATGGCGATGGATAAA-3’；
所述DNA探针T4为：
5’-p-TAAGCCAGCCATAAGTCAGTATCTCCTATTGGACCCTGCCTGAACACTGATCCG-3’；
所述DNA探针T5为： 5’-p-GCGAGTATGGAGTCAACTGCCTTCCACGGTGATAGGATCGAATGCTGGATACGT-3’；
所述DNA探针T6为： 5’-p-CAGCATTCGAAGTCCAGTTTCTGGACATGTGTCTTGCTTACTTAGGGTAGAGAACCACGTTTCGTGGTAGACTTATGGC-3’；
所述DNA探针LS为：5’-p-TGGCTTACGGATCAGTGAACCATACTCGCACGTATC-3’；
所述sgc8核酸适配体探针（sgc8）为： 5’-TATGTCTCGAGATGGTCCATTTTTTATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA-3’。
图3A为sgc8-eNC的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析图。如图3A所示，因DNA探针固有的电泳迁移率而决定其处于不同位置，可以清楚的观察到各个DNA组分或组装的中间体的条带。泳道1为T1、T2 和 T3探针的杂交产物（即为DNA四面体的基本骨架），随后在此骨架中逐条添加DNA序列，如泳道2~6所示，均会引起明显的迁移率变化，揭示了不同DNA组装体的形成。泳道6为T1、T2、T3、T4、T5、T6和LS探针以及sgc8适体探针的混合物（即为适体结合的四面体基本结构单元），泳道7为sgc8-eNC，可以看出，随着T4连接酶的加入出现了一条堵孔的非穿透带，这表明成功形成了具有极高分子量和空间复杂性的DNA纳米团簇结构。同时对制备得到的靶向DNA纳米团簇材料sgc8-eNC的结构进行了AFM表征，如图3B所示，结果显示其形貌类似于球形，而且此球形结构的高度大约在36 (± 2) nm，宽度大概有200 (± 30) nm，显然是一种三维的DNA纳米结构。
实施例2 基于DNA四面体的靶向DNA纳米团簇材料（sgc8-eNC）的血清稳定性分析
首先根据实施例1的方法构建基于DNA四面体的靶向DNA纳米团簇材料（不同之处在于使用FAM荧光基团标记的sgc8适体探针替代原有的sgc8适体探针），接着将样品分别与新鲜的小鼠血清混合，使得血清最终含量为10vol%，然后在37 ℃下孵育 0、0.5、1、2、4、6和8小时。实验结束后将混合样品与 6 × Loading buffer混合，之后使用 6%的聚丙烯酰胺凝胶在 0.5 × TBE 缓冲液中，电压为80 V条件下对产物进行凝胶电泳分析。
其中，所用的FAM荧光基团标记的sgc8适体探针如下：
5’-FAM-TATGTCTCGAGATGGTCCATTTTTTATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA-3’。
图4A为基于DNA四面体的靶向DNA纳米团簇材料（sgc8-eNC）在10%新鲜鼠血清下孵育不同时间点的凝胶电泳分析图。实验结果表明，sgc8-eNC具有很好的血清稳定性，即使在孵育24 h的情况下，其材料基本不发生降解。
实施例3 基于DNA四面体的靶向DNA纳米团簇材料（sgc8-eNC）的靶向稳定性分析
首先根据实施例2的方法构建基于DNA四面体的靶向DNA纳米团簇材料（不同之处在于使用FAM荧光基团标记的sgc8适体探针替代原有的sgc8适体探针），接着将样品分别与新鲜的小鼠血清混合，使得血清最终含量为10vol%，然后在 37 ℃下孵育4和8小时，得到预处理后的靶向DNA纳米团簇材料。然后在预先培养HeLa细胞的24孔细胞培养板中加入30 μL预处理后的靶向DNA纳米团簇材料和170 μL DMEM培养基，在37 ℃、5% CO2的加湿气氛中培养2 h。孵育完成后，将HeLa细胞用不含EDTA的胰蛋白酶消化，并连续重悬于1 mL 1×PBS缓冲液（pH = 7.4）中。通过在流式细胞仪上对至少 10000个细胞进行计数来分析荧光强度。
图4B为基于DNA四面体的靶向DNA纳米团簇材料（sgc8-eNC）在10vol%新鲜鼠血清下孵育不同时间后材料的靶向稳定性分析数据。使用流式细胞仪得到的荧光强度代表sgc8-eNC的靶向稳定性。从图4B中可以看出，即使sgc8-eNC在10 vol% 新鲜鼠血清下孵育8h后，其靶向稳定性依然保持不变，证明了sgc8-eNC具有很好的靶向稳定性。
实施例4 基于DNA四面体的靶向DNA纳米团簇材料（sgc8-eNC）在细胞靶向识别上的应用
首先根据实施例1的方法构建基于DNA四面体的靶向DNA纳米团簇材料（sgc8-eNC）（使用FAM荧光基团标记的T5探针替代原有的T5探针组装材料）。
所用的FAM荧光基团标记的T5探针为：
5’-p-GCGAGTATGGAGTCAACTGCC/FAMdT/TCCACGGTGATAGGATCGAATGCTGGATACGT-3’。
对于悬浮细胞（CEM和 Ramos），取出 5×104个细胞并离心（1200 RPM，5分钟）以获得细胞沉淀。以D-PBS缓冲液（葡萄糖终浓度为4.5 g/L，氯化镁终浓度为5 mM）为洗涤缓冲液洗涤细胞两次后，将细胞沉淀重悬在175 μL的结合缓冲液中，结合缓冲液是通过添加牛血清白蛋白（最终浓度为1毫克/毫升）和酵母提取RNA（最终浓度，0.1毫克/毫升）到洗涤缓冲液中制备的。然后，加入25 μL sgc8-eNC并充分混合，然后在5% CO2的湿润气氛中在37℃下孵育2小时。将所得溶液离心（1200 RPM，5 分钟），将沉淀用洗涤缓冲液（500 µL）洗涤两次，然后加入Hoechst 33342浓度为10 μg/mL，在室温下放置15分钟。随后，将细胞离心（1200 RPM，5分钟）以去除残留的Hoechst 33342，并重新悬浮在20 µL结合缓冲液中。将细胞样品放入共聚焦皿中，在Leica SP8激光扫描共聚焦显微镜上镜进行共聚焦激光扫描。Hoechst 33342的激发波长为405 nm，而FAM的激发波长为 488 nm。
对于贴壁细胞（HeLa和L02），将5×104个细胞培养在24孔塑料板中，盖上圆形盖玻片并在DMEM完全培养基（含10vol% FBS 和1wt%青霉素-链霉素）中培养，在37℃下在含有5%CO2的加湿培养箱中过夜。细胞用1×PBS缓冲液（pH = 7.4）洗涤3次后，加入25 μL sgc8-eNC和175 μL DMEM完全培养基，然后在37℃、5% CO2的湿润气氛中孵育2小时。接下来，将细胞用1×PBS缓冲液（pH = 7.4）洗涤两次并用4%多聚甲醛固定15分钟。再次用1×PBS缓冲液（pH = 7.4）洗涤后，细胞在室温下用 Hoechst 33342（10 μg/mL）染色5分钟。最后，将细胞用1×PBS缓冲液（pH = 7.4）洗涤两次以去除残留的 Hoechst 33342。最后Leica SP8激光扫描共聚焦显微镜上镜进行共聚焦激光扫描。Hoechst 33342 的激发波长为405 nm，而FAM的激发波长为 488 nm。
图5为基于DNA四面体的靶向DNA纳米团簇材料（sgc8-eNC）与不同细胞孵育的激光共聚焦成像数据。图5A和图5B为sgc8适体探针靶向细胞（CEM和HeLa能够高表达PTK7蛋白，sgc8适体探针可以靶向识别这一蛋白）的细胞成像数据，可以看出sgc8-eNC有效的被CEM和HeLa细胞摄取，而作为对照的不添加sgc8适配体的载药系统材料则基本没有被摄取。图5C为非靶向癌细胞（Ramos），图5D为人正常细胞（L02），这二者均不会被sgc8适体识别，所以无论是不添加适配体的载药DNA纳米团簇材料还是sgc8-eNC都不被这二种细胞摄取。这一现象证明了sgc8-eNC具有精准靶向识别作用，能够特异性识别靶细胞，这为靶向给药的潜在应用奠定了基础。
实施例5 基于DNA四面体纳米团簇的靶向载药系统（Dox-sgc8-NC）的载药量评估
使用实施例1的方法构建了基于DNA四面体的靶向DNA纳米团簇材料（sgc8-eNC），接下来使用盐酸阿霉素这一蒽环类药物作为模型来对Dox-sgc8-NC的载药量进行考察分析。具体实验步骤如下：
为了评价Dox-sgc8-NC对抗癌药物阿霉素（Dox）的载药能力，将固定浓度为2 μM的Dox与不同浓度的sgc8-eNC混合在1×T4 DNA连接酶缓冲液中，在37 ℃下孵育过夜，形成稳定的基于DNA四面体纳米团簇的靶向载药系统。以氙灯作为激发光源，使用日立F-7000 荧光光谱仪测试荧光光谱。
图6A为Dox-sgc8-NC的载药量评估数据。得益于大量的杂交碱基对，sgc8-eNC在空间上可以很好地装载化学抗癌药物，如阿霉素（Dox）。由于Förster共振能量转移，Dox在优先插入G-C碱基对之间后荧光会被猝灭。然后，通过监测Dox荧光强度的变化来评估加载到sgc8-eNC中的Dox的量。实验结果表明，随着sgc8-eNC浓度的增加，Dox溶液的荧光强度逐渐降低。350 pM的sgc8-eNC可以装载2 μM Dox混合时 其载药量高达1:5670（即1分子的sgc8-eNC可以装载5670个分子的Dox药物），这表明Dox-sgc8-NC具有超高的药物负载量。
实施例6 基于DNA四面体纳米团簇的靶向载药系统（Dox-sgc8-NC）的稳定性评估
使用实施例1的方法构建了基于DNA四面体纳米团簇的靶向载药系统（Dox-sgc8-NC），接下来对Dox-sgc8-NC的稳定性进行考察分析。具体实验步骤如下：
在1×PBS缓冲液（pH = 7.4）下， 将所构建的Dox-sgc8-NC在微型透析装置（3.5KMWCO）中进行稳定性评估实验。首先在微型透析装置中加入100 μL Dox-sgc8-NC，另外一个装置中加入等量游离Dox (20μM) 作为对照样品。微型透析装置保持在3 mL的1×PBS缓冲液（pH = 7.4）上，并在室温和避光条件下进行透析。在不同时间点（0、1、2、4、8、14、24、48h）从透析液中取出200 μL溶液，在Hitachi F-7000荧光光谱仪上测量不同透析液的荧光强度在氙灯下作为激发光源，选择495 nm的激发波长，收集 500 至 700 nm 范围内的荧光光谱。最后，将 200 μL样品返回到透析液中以保持原始体积不变。
图6B为Dox-sgc8-NC的稳定性分析数据，与游离药物溶液的快速扩散相比，Dox-sgc8-NC的药物扩散效率可以忽略不计，这表明Dox在Dox-sgc8-NC中的有效载荷是稳定的，可以防止药物在血液循环中的泄漏。
实施例7 基于DNA四面体纳米团簇的靶向载药系统（Dox-sgc8-NC）在生物成像和肿瘤靶向给药中的应用
使用实施例1的方法构建了基于DNA四面体纳米团簇的靶向载药系统（Dox-sgc8-NC），接下来对Dox-sgc8-NC在生物成像和肿瘤靶向给药中的应用进行探究。具体实验步骤如下：
首先在BALB/c雄性裸鼠（约20 克，4~6 周龄）右腋皮下接种HeLa细胞（细胞数为1.0×107个），建立HeLa荷瘤小鼠模型。
生物成像应用：首先根据实施例1的方法构建基于DNA四面体纳米团簇的靶向载药系统（Dox-sgc8-NC）（不同之处在于使用Cy5荧光基团标记的T5探针替代原有的T5探针）。当荷瘤小鼠的肿瘤体积达到约400 mm3 时，通过尾静脉注射Dox-sgc8-NC。小鼠麻醉后在IVIS成像光谱系统（640 nm滤光片激发）上对小鼠或器官进行荧光成像，检测DNA纳米团簇精准靶向载药系统材料在小鼠体内的生物分布。
所用的Cy5修饰的DNA四面体组装探针5（FAM-T5）探针为： 5’-P-GCGAGTATGGAGTCAACTGCC/Cy5dT/TCCACGGTGATAGGATCGAATGCTGGATACGT-3’。
肿瘤靶向给药的应用：首先使用实施例1的方法构建了基于DNA四面体纳米团簇的靶向载药系统（Dox-sgc8-NC）。当小鼠肿瘤体积达到适当大小（约 100 mm3）时，每3天尾静脉注射生理盐水（对照组）、游离Dox或Dox-sgc8-NC（Dox剂量为2.0 mg/kg），连续给药18天，整个实验过程中保证小鼠每日正常饮食。在新给药前每3天用游标卡尺估计肿瘤体积，并按公式（a2b）/2计算，其中a和b分别为肿瘤的宽度和长度。
图7A为Dox-sgc8-NC在生物成像中的应用。可以清楚地观察到在尾静脉注射后4小时后，Dox-sgc8-NC聚集在肿瘤部位，且荧光值达到最高。8小时后，大量递送到肿瘤部位的Dox-sgc8-NC逐渐被清除，显示出明显的通透性和滞留效应。为了更精确观察Dox-sgc8-NC在每个组织和肿瘤中的分布，在尾静脉注射后纳米材料4小时后处死小鼠，收集小鼠的主要器官（心、肝、脾、肺和肾）及肿瘤组织，并获得体外荧光强度图像（图7A）。结果显示，Dox-sgc8-NC在肿瘤组织荧光明显增强，这为肿瘤靶向性提供了进一步的证据。
图7B为DNA纳米团簇精准靶向载药系统对荷瘤小鼠（HeLa）的靶向给药治疗后的肿瘤体积生长情况。在观察到Dox-sgc8-NC可以准确靶向肿瘤部位后，将游离阿霉素（FreeDox）、Dox-sgc8-eNC分别通过尾静脉注射到 HeLa荷瘤裸鼠体内。另一组小鼠在相同条件下注射生理盐水（Saline）作为对照。治疗前，所有小鼠均表现出相似的肿瘤生长趋势。图7B显示了肿瘤体积的变化，仅用生理盐水治疗的肿瘤生长最快，在治疗18天后能够达到∼3000mm3，而在接受游离Dox治疗的小鼠中，发现肿瘤大小略有缩小，这可能是由于肿瘤部位药物积累不足所致。与对照组相比，Dox-sgc8-eNC实验组小鼠的肿瘤生长受到极大的抑制（约为生理盐水组的8.7倍），表明Dox-sgc8-eNC可以应用于肿瘤的靶向给药治疗。
实施例8 通用型的DNA纳米团簇靶向载药系统的构建及其可行性分析
参照实施例1的方法构建了基于DNA四面体纳米团簇的靶向载药系统，并对新构建的DNA纳米团簇精准靶向载药系统进行激光共聚焦成像分析。具体实验步骤如下：
使用实施例1的方法分别构建了基于DNA四面体的靶向DNA纳米团簇材料AS1411-eNC和S6-eNC，不同之处在于将sgc8核酸适配体替换成AS1411核酸适配体或S6核酸适配体，然后对其进行靶向性测试。所使用的核酸适配体如下：
AS1411核酸适配体：5’-TATGTCTCGAGATGGTCCATTTTTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTG
GTGGTGG-3’;
S6核酸适配体：5’-TATGTCTCGAGATGGTCCATTTTTTTGTGGCCAGTCACTCAATTGG
GTGTAGGGGTGGGGATTGTGGGTTG-3’。
图8A为构建了靶向MCF-7癌细胞的AS1411-eNC，使用激光共聚焦成像对其进行评估；其中图8B为构建了靶向A549癌细胞的S6-eNC，使用激光共聚焦成像对其进行评估；以上都证明基于DNA四面体纳米团簇的精准靶向载药系统具有较好的通用性和应用潜力。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (8)

1.一种基于DNA四面体纳米团簇的靶向载药系统，其特征在于：所述的靶向载药系统包括DNA四面体、T4 DNA连接酶、sgc8核酸适配体探针和抗癌药物；
所述的DNA四面体由如下7条DNA探针组装而成：
T1： 5’-p-AGGAGATACACGATTACAGCTTGCTACACGATTCAGACTTAGGAATGTTCGATCAGGCAGGGTCCAAT-3’，
T2： 5’-p-GCAGTTGACACGAACATTCCTAAGTCTGAAATTTATCCATCGCCATAGTAGACCTATCACCGTGGAAG -3’，
T3： 5’-ATGGACCATCTCGAGACATATTTCGTGTAGCAAGCTGTAATCGACTCTACCCTAAGTAAGCAAGACACAACTACTATGGCGATGGATAAA-3’，
T4： 5’-p-TAAGCCAGCCATAAGTCAGTATCTCCTATTGGACCCTGCCTGAACACTGATCCG-3’，
T5： 5’-p-GCGAGTATGGAGTCAACTGCCTTCCACGGTGATAGGATCGAATGCTGGATACGT-3’，
T6： 5’-p-CAGCATTCGAAGTCCAGTTTCTGGACATGTGTCTTGCTTACTTAGGGTAGAGAACCACGTTTCGTGGTAGACTTATGGC-3’，
LS：5’-p-TGGCTTACGGATCAGTGAACCATACTCGCACGTATC-3’；
所述的sgc8核酸适配体探针为： 5’-TATGTCTCGAGATGGTCCATTTTTTATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA-3’；
所述的抗癌药物为蒽环类抗癌药物。
2.一种构建权利要求1所述的基于DNA四面体纳米团簇的靶向载药系统的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：基于DNA四面体的靶向DNA纳米团簇材料的构建：
S1-1：将浓度均为10 µM的DNA探针T1~T6和LS各取0.5 µL，与2.5µL 10×T4 DNA连接酶缓冲液和18 µL超纯水共同加入到0.5 mL离心管中，使用微量移液器混合均匀；
S1-2：将步骤S1-1得到的混合溶液置于金属加热块上，在90 ℃加热反应5分钟后，逐渐冷却到室温以确保DNA四面体的成功组装；
S1-3：待步骤S1-2结束后，向反应液中添加0.5 µL 10 µM的sgc8核酸适配体探针，并在37 ℃下孵育2 h，以得到sgc8配置的DNA四面体结构；
S1-4：待步骤S1-3结束后，向反应液中添加0.5 µL 400 U/µL的T4 DNA连接酶，并在16℃条件下孵育过夜，以促进靶向DNA纳米团簇的组装；
S1-5：待步骤S1-4结束后，将反应液在65 ℃下灭酶10分钟，即得到所述的基于DNA四面体的靶向DNA纳米团簇材料sgc8-eNC；
S2：基于DNA四面体纳米团簇的靶向载药系统的构建：
将sgc8-eNC和抗癌药物在1×T4 DNA连接酶缓冲液中共同孵育，其中sgc8-eNC的终浓度为0 - 3.5 nM，抗癌药物的终浓度为0 - 20 µM，孵育条件为：37 ℃黑暗环境中过夜孵育，孵育完成后即得到所述基于DNA四面体纳米团簇的靶向载药系统。
3.一种由权利要求1所述的靶向载药系统改造而来的通用型靶向载药系统，其特征在于：所述通用型靶向载药系统为针对靶细胞改变载药系统中的核酸适配体探针的序列所得。
4.根据权利要求3所述的通用型靶向载药系统，其特征在于：所述通用型靶向载药系统为针对靶细胞MCF-7人乳腺癌细胞改变载药系统中的核酸适配体探针的序列所得；改变后的核酸适配体探针的序列为：
5’-TATGTCTCGAGATGGTCCATTTTTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’。
5.根据权利要求3所述的通用型靶向载药系统，其特征在于：所述通用型靶向载药系统为针对靶细胞A549腺癌人类肺泡基底上皮细胞改变载药系统中的核酸适配体探针的序列所得；改变后的核酸适配体探针的序列为：
5’-TATGTCTCGAGATGGTCCATTTTTTTGTGGCCAGTCACTCAATTGGGTGTAGGGGTGGGGATTGTGGGTTG-3’。
6.如权利要求1所述的基于DNA四面体纳米团簇的靶向载药系统在制备靶向肿瘤药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的肿瘤选自白血病、淋巴瘤、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌和肺癌。
8.如权利要求1所述的基于DNA四面体纳米团簇的靶向载药系统在生物成像中的应用。
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