CN114099695A - 一种ra16-a与dna四面体载体共聚物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种RA16‑A与DNA四面体载体共聚物，所述RA16‑A序列为RA16在3’端添加20个poly A，DNA四面体载体的四条单链DNA的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1‑4所示，RA16‑A与DNA四面体载体的摩尔比为1:1。本发明解决了双特异性RNA适配体RA16在体内循环时间短、易降解的问题，利用DNA纳米结构负载的RA16可以显著提高RA16在细胞、体内靶组织的循环时间，提高RA16在细胞或肿瘤组织中的富集度和存活时间，成功实现了RA16在肿瘤区域的长富集，可作为肿瘤诊断试剂用于活体成像。此外，该核酸适配体本身可以抑制肿瘤细胞生长，通过与DNA四面体偶联，可进一步装载肺癌化疗药物、siRNA、单克隆抗体等，实现长效的靶向给药。

Description

一种RA16-A与DNA四面体载体共聚物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物纳米医药领域，具体涉及一种靶向递送体系，更具体地，本发明涉及一种RA16-A与DNA四面体载体共聚物及其制备方法和应用。
背景技术
肺癌是全世界癌症死亡的最常见原因。非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌病例的85％–90％。传统的癌症疗法(如化疗和放疗)会出现严重的副作用，包括胃肠道不适、器官损伤并且严重影响生活质量。
目前针对非小细胞肺癌的新疗法，在过去的几十年中，表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)最常用于肺癌治疗。这些抑制剂用于含有EGFR突变的晚期非小细胞肺癌患者与化疗相比大大降低了周身毒性，显著提高了病人生存率，因此靶向治疗十分必要。
适配体是一类单链的寡核苷酸片段(DNA或RNA)，在生物环境中能够折叠成特定的空间结构，通过空间互补、静电作用、范德华力、氢键等作用，可与特定的靶标高度亲和的结合。由于适配体具有与靶物质结合的特异性，与抗体相比，其分子量更小，易于合成，又无免疫原性；与同为核酸的小干扰RNA(siRNA)等相比，其作用形式和作用范围更为多样，因此，适配体非常具有开发为特异性的与靶组织结合的靶向诊断或靶向治疗制剂的价值。同时，适配体分子量小、易于通过化学合成，便于储存和运输，无论和抗体还是同为核酸的小核酸比，都有一定的优势，因此，适配体被广泛应用于体外诊断、体内成像和靶向制剂的开发中。截至目前，RNA适配体药物在一些疾病的诊断和治疗领域已取得了不错的成效。FDA已批准了Eyetch/Pfizer开发的针对VEGF的核酸适配体——pegaptanib(商品名Macugen)用于治疗年龄相关性黄斑病症。
在此前的研究中，我们研发团队报道了首例利用聚乙二醇(PEG)修饰的RNA文库，直接在人非小细胞肺癌荷瘤裸鼠体内开展的活体SELEX技术，富集到对于人非小细胞肺癌具有靶向及抑瘤双特异功能的RNA适配体RA16(CN201610168486.9)。该技术不仅有效降低了以往在体外筛选过程中筛选文库与高丰度非靶蛋白的非特异性结合，提高了与原位组织特异性结合靶序列的筛选概率和针对性，而且，由于在筛选的过程中引入了PEG修饰，筛选到的RNA适配体更容易进行各种修饰和偶联，而不易在修饰过程中丧失其生物学特性，具有极大的后期开发潜力。然而，尽管我们已对 RA16进行了部分修饰，增强了其组织稳定性和半衰期，由于RNA自身易降解、易清除的特性，我们仍需继续探索并进一步提高其稳定性、载药能力及生物相容性，进一步开发更适用于临床的纳米级靶向药物递送系统。
尽管目前已经通过SELEX技术筛选出了不少核酸适配体，然而真正进入临床诊断和靶向治疗的核酸适配体却屈指可数，不少大量费时费力筛选出的核酸适配体由于稳定性差等因素并不能真正应用到临床诊断与治疗工作中去。因此利用药物递送系统增加体内循环的半衰期，增加药物稳定性成为一种可实现的方法，而与合成材料相比，来源于内源性材料的载体优越的生物相容性在纳米医学的发展中非常有利。因此利用具有纳米级尺寸、高载药能力、生物相容性，粘附适体分子后拥有靶标识别高亲和力，并且具有良好的细胞内化效率的DNA纳米材料作为载体具有很大的发展前景。
发明内容
发明目的：鉴于现有技术中存在的上述问题，本发明的主要目的在于解决现有技术的缺陷，本发明提供一种RA16-A与DNA四面体载体共聚物，其为靶向抑瘤双特异性适配体纳米药物，该体系是利用DNA四面体结构作为DNA载体，它是拥有固定空间结构的最小DNA纳米载体单元，成功装载了通过活体筛选获得的靶向及抑制人非小细胞型肺癌的双特异性适配体RA16。
为实现上述目的，本发明提供了一种RA16-A与DNA四面体载体共聚物，所述 RA16-A为在RA16 3’端添加20个poly A，DNA四面体载体的四条单链DNA的核苷酸序列分别如SEQID NO：1-4所示，其中，所述四条单链DNA中的任意一条在3’端添加20个poly T，RA16-A与DNA四面体载体的摩尔比为1:1。
在本发明的一个具体实施例中，通过在SEQ ID NO：4的核苷酸序列的3’端添加 20个poly T，已实现与RA16的互补。
优选地，所述四条单链DNA和RA16-A中的任意一个在共聚前先进行荧光标记。
所述荧光标记为FITC、Alexa 488、Cy3、Cy5和Cy7中的任意一种。在具体实施时，直接使用标记的核苷酸链参与退火，通过自组装获得荧光标记的共聚物。
本发明进一步提出了上述RA16-A与DNA四面体载体共聚物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)RA16-A的合成：通过PCR合成相应的模板链DA16-T，然后经体外转录得到；
(2)DNA纳米载体对RA16-A的负载：利用PCR程序升温后退火将两两互补的四条单链DNA与RA16-A通过碱基互补完成负载，得到RA16-A与DNA四面体载体共聚物，其中，四条单链DNA的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1-4所示。
其中，退火程序为：80～95℃10～20min，4℃30～40min。
本发明进一步提出了所述RA16-A与DNA四面体载体共聚物在制备靶向非小细胞型肺癌的诊断试剂中的应用。
本发明还提出了RA16-A与DNA四面体载体共聚物在制备用于抑制非小细胞型肺癌的药物中的应用。
在另一方面，本发明提出了上述RA16-A与DNA四面体载体共聚物在生物检测、活体成像、基因载体、药物传递中的应用。
更进一步地，本发明提出了一种靶向非小细胞型肺癌的药物，其为上述共聚物与非小细胞型肺癌的化疗药物、siRNA或单克隆抗体中的任意一种的复合物。
有益效果：本发明主要解决了双特异性RNA适配体RA16在体内循环时间短、易降解的问题，利用DNA纳米结构负载的RA16可以显著提高RA16在细胞、体内靶组织的循环时间，提高RA16在细胞或肿瘤组织中的富集度和存活时间，成功实现了RA16在肿瘤区域的长富集，可作为肿瘤诊断试剂用于活体成像。此外，该核酸适配体本身可以抑制肿瘤细胞生长，通过与DNA四面体偶联，可进一步装载肺癌化疗药物、siRNA、单克隆抗体等，实现长效的靶向给药。通过成功合成纳米粒子，并通过建立非小细胞肿瘤动物模型验证该纳米粒子有以下优势：
1)本发明所得到的纳米体系制备简单，原料易得，该方法设计巧妙、条件温和、操作简单、产率较高，能够扩大量生产，可有效应用于工业生产中；
2)本发明所得纳米粒子容易被细胞摄取，并且具有良好的生物相容性，易实现临床转化；
3)静脉给药的条件下，可以保证RA16靶向性的同时，提高RA16在肿瘤区域富集的能力，以及血浆半衰期；
4)可进一步偶联、装载肺癌化疗药物、siRNA、单克隆抗体等，实现长效的肿瘤靶向给药，提高肿瘤部位的药物浓度和作用时间。
附图说明
图1 DA16-T以及RA16-A琼脂糖凝胶电泳图；
图2 DTA-16纳米药物的制备示意图；
图3 DTA-16合成过程Native-page表征图；
图4AFM立体图；
图5DTA-16纳米粒子的动态光散射和Zeta电位表征图；
图6 DTA-16纳米粒子细胞摄取共聚焦显微镜图；
图7 DTA-16纳米粒子细胞活力柱状图，其中，C：control；R：RA16；D:DTN； A:DTA-16；
图8 DTA-16纳米粒子在体内分布。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
本发明一方面提供了一种RA16-A与DNA四面体载体共聚物，具体包括如下步骤：
1)RA16-A的合成与表征
RA16-A序列由RA16在3’端添加20个poly A而来，通过PCR合成相应的模板链DA16-T，再进行体外转录获得。
2)DNA纳米载体对RA16-A的负载
利用PCR程序升温后退火将两两互补的四条寡核苷酸链(称为P1，P2，P3，P4-T，其中，P1-P4长64bp，P4-T为63+20bp)与RA16-A通过碱基互补完成负载，该体系称为DTA-16。
其中，P1、P2、P3、P4各自有配对区域，进行互补配对，形成一个正四面体，P4 的poly-T延伸出去在四面体外侧，与RA16-A的poly A互补，配对结合在一起，形成DTA-16(如图2所示)。
2)DTA-16纳米粒子的表征
通过Native Page凝胶电泳证明纳米粒合成成功，通过动态光散射(DLS，Zetasizer Nano Instruments)测量尺寸分布，用过zeta电位判断表面电性。通过原子力显微镜(AFM) 观察纳米粒尺寸及形态。
本发明的第二方面，包含在细胞层面判断单纯载体对细胞活力的影响，以及细胞对该纳米粒子的摄取能力。具体地：
1)利用CCK8检测试剂经检测该纳米粒子的细胞毒性。
2)通过负载荧光基团并与细胞共孵育，通过激光共聚焦显微镜观察细胞对该纳米粒子的摄取。
本发明的第三方面，包含该发明所示的纳米药物作为荧光诊断探针诊断裸鼠非小细胞肺癌模型的方法，通过皮下注射人大细胞肺癌细胞(H460细胞)制造人源化肿瘤模型，并通过静脉注射该纳米药物进行肿瘤活体成像。具体地：
1)非小细胞肿瘤动物模型的建立
通过对5周大的Balb/c裸鼠皮下注射人大细胞肺癌细胞(H460细胞)制造人源化非小细胞肿瘤模型。
2)体内荧光成像
对纳米粒子进行荧光标记，在模型小鼠体内，尾静脉给药后利用小动物荧光成像系统观察不同时间点小鼠荧光分布情况，给药72h后取组织观察各组织荧光分布。
下述实施例中涉及的核苷酸序列如表1所示：
表1各核酸链序列表
Figure BDA0003377122920000051
Figure BDA0003377122920000061
下面通过具体的实施例详细说明本发明。
实施例1 RA16-A的合成与表征。
(1)DA16-T的制备以及表征
DA16-T为RA16-A的模板链，RA16-A序列由RA16在3’端添加20个poly A而来。
按表2条件配制1000μL反应体系：
表2
Figure BDA0003377122920000062
Figure BDA0003377122920000071
配制好反应体系后，其中一组作为不添加DA16模板空白对照。
反应条件如表3所示：
表3
Figure BDA0003377122920000072
完成PCR反应后，进行琼脂糖电泳(120V,40min)，并观察产物扩增效果。目的条带123bp。
利用生工SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒，遵照试剂商描述步骤纯化并跑胶验证条带位置。
(2)RA16的体外转录
获得侧链带氨基修饰的RA16，转录体系如表4所示：
表4
Figure BDA0003377122920000073
Figure BDA0003377122920000081
将反应体系置于37℃水浴中，过夜反应结束后，95℃，5分钟，终止体外转录。取1μL体外转录产物，通过琼脂糖电泳出孔后亮度及迁移位置，判断转录是否成功，并推算RNA产物的量。利用苯酚/氯仿抽提标准程序来纯化RA16，最后加入三倍体积的无水乙醇，1/10体积的3M NaAc(pH5.2)，和10μL核酸助沉剂，置于-20℃或-80℃沉淀2小时之后可以使用，亦可储存在-80℃至少三个月。
(3)RNA重悬
上述乙醇沉淀后的RNA，首先于4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，随后用 70％冷乙醇洗涤一次，4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，将RNA沉淀置于室温干燥，待沉淀基本干后，悬于RNA refolding buffer中。
结果如附图1所示，DA16-T链位置归属正确扩增成功，RA16-A位置归属正确表示转录成功。
实施例2 DNA四面体合成、表征以及药物负载能力表征。
(1)合成以及Native PAGE表征：
利用分光光度计测试各链浓度以及RA16-A浓度，其中，各链浓度范围是 12nM-25nM，缓冲液是1xTM buffer+Mg2+，各链比例为等摩尔量的1：1：1：1，分别在50μL体系中合成P1，P2双链结构，P1，P2，P3三链体系，P1+P2+P3+P4(DTN) 框架结构以及P1+P2+P3+P4-T+RA16-A(DTA-16)。
其中，1xTM buffer+Mg2+通过将10xTM buffer+Mg2+稀释得到。其中，10X TMbuffer 通过如下方法配制：精密称取968.8mg Tris，4.066g MgCl2·6H2O，将其倒入50mL离心管中，加入40mL去离子水振荡混匀，用冰醋酸调到pH值为8即可。
退火程序如下表5所示。
表5
Figure BDA0003377122920000091
准备浓度为10％的Native-page胶。根据跑胶标准程序将制好的各个样品上样照胶：用4S red(上海生工)染色液，避光染胶20min，在照胶仪中观察。
合成步骤示意图如附图2所示，合成结果如附图3所示，其中，marker中最大的核酸条带为500bp，我们发现，从P1、P1+P2到DTN，DTA-16，条带逐渐升高，最终大于500bp marker所处位置，且在每个泳道中均出现明亮单一的条带，说明结构合成较好。该结果表明四面体合成成功，且连接RA16后不会影响DNA四面体整体结构的完整性，RA16与DTN复合后显著提高了半衰期与体内稳定性。实际上，P1～P4每条DNA链都可以修饰ploy-T。
(2)原子力学显微镜表征结构：
按上述制样步骤，在50μL体系中合成DTN和DTA-16。将两种待测样品稀释至终浓度20nM，过0.22微米滤膜之后，用移液枪吸取5μL稀释后样品，倾斜打在云母片表面，尽可能增大表面积。烘箱烘干，待云母片表面上的液体挥发，即制样完成，可以立即去检测或者储存待用。利用原子力显微镜，扫描云母片表面平整度，从而检测纳米粒子的外型。值得注意的是AFM的数据只有Z轴才有实际意义，代表实际大小。
如附图4所示，原子力学显微镜成像显示，DNA载体为四面体结构，从纵坐标的亮度可以看出，DNA四面体尺寸在5nm左右，连接RA16以后的高度在8nm左右。
(3)DLS检测粒径分布及zeta电位检测
分别用约1ml的1ⅹTM buffer+Mg2+将上述样品稀释10-20倍，用移液枪吹打均匀后加入到干净的样品池中；使用马尔文Nano ZS90粒径和电位仪测量粒径分布及Zeta 电位。如附图5所示，DLS结果显示，RA16连接DTN之后流体力学半径变大，分布较窄，进一步证明DTN四面体合成成功，并且RA16与DTN四面体连接成功。如附图5所示，Zeta电位显示纳米粒子表面均呈负电荷，同时证明合成成功且结构较为稳定。
实施例3 DTA-16的细胞毒性以及细胞摄取
(1)细胞摄取具体实验步骤如下：
1)按实施例2中合成步骤完成DTA-16的折叠与配对过程。
2)标记NHS-FITC荧光，在1M NaHCO3缓冲液体系中加入荧光染料(摩尔比1： 10)，4℃孵育2h后用YM-3KDa～10KDa超滤管超滤，去除多余的荧光染料，RA16 用类似的方法标记水溶性FITC-NHS。
3)细胞培养与铺板
将细胞培养在37℃，5％CO2的培养箱中，待融合度达到90％时将H460细胞(购自ATCC)按5ⅹ104～1ⅹ105个细胞/孔的密度传代至共聚焦皿中培养24h，用倒置显微镜观察，若细胞状态良好，细胞数量适中，即可进行后续实验。
4)给药
将培养皿中的培养基吸出扔掉，加入200μL PBS清洗两至三次，分别将用无血清培养基配制好的200nM样品混合液(Control组RA16组、DTN组、DTA-16组)用涡旋混匀仪混匀后，加入到共聚焦培养皿的中心，培养4h后，洗1-3遍，每皿加入至少 200μl细胞核染色工作液(hoechst 33242)，37℃染色15min后用1ⅹPBS洗三遍，每皿加200μl～300μl无酚红培养基，于共聚焦显微镜下观察并拍照。
如附图6所示，其中RA16所带荧光为FITC，DTN所带荧光为Cy3(通过在聚合前多对其中一条核苷酸链进行标记)，蓝色是细胞核荧光，结果显示DTA-16可以并不影响RA16被细胞摄取，后续可以用于细胞内靶向药物递送治疗。
(2)载体安全性检测
使细胞密度为6.5×104/mL BEAS-2B、H460；将密度为6.5×104/mL的细胞混合液加到96孔板中，每个孔中加100μL，96孔板的四周每孔加100μL PBS。将种好细胞的96孔板放入CO2培养箱中培养24h。按上述方法合成纳米粒，按下列分组加入用无血清培养基配制的各样品1)Control+PBS，2)DNA纳米笼(即DTN)：DTN在100 μL体系中的浓度为100nM，3)DTA-16在100μL体系中的浓度为100nM，培养箱中孵育6h后，用无血清培养基洗2遍，每孔加100μl含10μl CCK8溶液的无血清培养基检测细胞活力。
结果如图7所示，摄取纳米粒子依然保持很高的细胞活性，说明粒子具有很好的安全性以及高的生物安全性。
实施例4 DTA-16在体内分布以及肿瘤靶向性
(1)动物模型的建立
将处于对数生长期的H460细胞消化，离心，重悬于PBS中，用PBS洗细胞两遍，重悬于无血清1640培养基中，使细胞浓度为2×106个/100μl；
选用5周的Balb/c裸鼠，于小鼠右前肢腋下皮下位置注射100μl细胞悬液，观察注射部位形成皮丘，用无菌棉棒轻摁，避免肿瘤细胞渗出。
(2)样品准备
按上述方法制备各组样品，并在RA16上标记水溶性Cy5.5 NHS，配制1mg/ml Cy5.5NHS的DMSO溶液，将PCR管中体系合并在1.5ml EP管中，按RA16：Cy5.5 摩尔比1:10在1MNaHCO3，PH＝8.3～9.0缓冲液环境中室温标记1.5～2h。并按实例3 中超滤方法纯化未标记上的荧光分子。
(3)给药及成像
分别向两组样品中加入生理盐水配成药液，从管中取出5μl稀释10倍，调整活体成像曝光值。对照组尾静脉注射100μl生理盐水；RA16、DTA-16组均注射0.5nmol，按0、12、24、36，48h，72h时间间隔固定曝光值对整个小鼠进行成像。荧光衰弱后，处死小鼠取主要组织(脑，心，肝，脾，肺，肾，肌肉)及肿瘤通过体外荧光成像进行材料分布分析。
如附图8显示，RA16组以及DTA组均有肿瘤富集趋势，但DTA-16组相较于RA16 组具有更快地肿瘤富集速度，并且在48h之后活体成像依然有持续的肿瘤富集能力，在72h后取器官明显可以看出DTA-16组肿瘤部位富集的荧光强度更亮，证明该体系可以帮助核酸适配体延长体内代谢时间，增加半衰期，提高了RA16适配体作为诊断探针的可能性。
综上所述，本发明提供了一种制备、应用DNA纳米材料偶联RNA适配体的方法，并进一步应用为靶向诊断试剂，为人非小细胞肺癌的诊断与治疗提供新的手段，该方法工艺简单、操作易控、安全性高、成本较低、周期较短。此外，该体系可进一步应用于与肺癌化疗药物、siRNA、单克隆抗体等结合，构成靶向性药物，以实现肺癌的靶向治疗。该纳米药物具有高负载率，DNA四面体-适配体共聚物被成功制备且制备方法简便可重复性好，通过体内外实验证明该体系能被肿瘤细胞摄取、显著提高适配体 RA16的稳定性、半衰期且生物相容性高。同时，该体系能偶联多种荧光分子，获得荧光四面体-适配体共聚物应用于肿瘤的活体成像，活体成像结果显示，应用该体系的荧光四面体-适配体的半衰期比单纯荧光适配体提高了约三倍。
本发明提供了一种靶向抑瘤双特异性适配体纳米药物的制备思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
序列表
<110> 苏州方舟生物科技有限公司
<120> 一种RA16-A与DNA四面体载体共聚物及其制备方法和应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 63
<212> DNA
<213> P1核苷酸序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgggtagtca gcgctaccac acacagaact ccctacgaca ttggcatgag atactcggag 60
acc 63
<210> 2
<211> 63
<212> DNA
<213> P2核苷酸序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtctccgagt atctcatgcc catttgtgcc tagggtatca cgctttatct gtagctcgcc 60
ccc 63
<210> 3
<211> 63
<212> DNA
<213> P3核苷酸序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggagttctgt gcttggatca cgcgtcggtt gttgtgatac cctaggcaca aatgatgtcg 60
tag 63
<210> 4
<211> 63
<212> DNA
<213> P4核苷酸序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggggcgagct acagataaag aacaaccgac gcgtgatcca atgtggtagc gctgactacc 60
cac 63
<210> 5
<211> 83
<212> DNA
<213> P4-T核苷酸序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggggcgagct acagataaag aacaaccgac gcgtgatcca atgtggtagc gctgactacc 60
cacttttttt tttttttttt ttt 83
<210> 6
<211> 44
<212> DNA
<213> 16-TRP核苷酸序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctactgacgt gatgcaatgc actctttttt tttttttttt tttt 44
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> FP核苷酸序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cactaatacg actcactata gggagagaac aatg 34
<210> 8
<211> 103
<212> DNA
<213> DA16核苷酸序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cactaatacg actcactata gggagagaac aatgacctgc ggtgccaagc cgtcgggtta 60
tgttgatctc ctcaaggacg agtgcattgc atcacgtcag tag 103

Claims (9)

1.一种RA16-A与DNA四面体载体共聚物，其特征在于，所述RA16-A为在RA16 3’端添加20个poly A，DNA四面体载体的四条单链DNA的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1-4所示，其中，所述四条单链DNA中的任意一条在3’端添加20个poly T，RA16-A与DNA四面体载体的摩尔比为1:1。
2.根据权利要求1所述的RA16-A与DNA四面体载体共聚物，其特征在于，所述四条单链DNA和RA16-A中的任意一个在共聚前先进行荧光标记。
3.根据权利要求2所述的RA16-A与DNA四面体载体共聚物，其特征在于，所述荧光标记为FITC、Alexa 488、Cy3、Cy5和Cy7中的任意一种。
4.权利要求1所述的RA16-A与DNA四面体载体共聚物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）RA16-A的合成：通过PCR合成相应的模板链DA16-T，然后经体外转录得到；
（2）DNA纳米载体对RA16-A的负载：利用PCR程序升温后退火将两两互补的四条单链DNA与RA16-A通过碱基互补完成负载，得到RA16-A与DNA四面体载体共聚物，其中，四条单链DNA的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1-4所示。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，退火程序为：80~95℃ 10~20 min， 4℃ 30~40 min。
6.权利要求1所述的RA16-A与DNA四面体载体共聚物在制备靶向非小细胞型肺癌的诊断试剂中的应用。
7.权利要求1所述的RA16-A与DNA四面体载体共聚物在制备用于抑制非小细胞型肺癌的药物中的应用。
8.权利要求1所述的RA16-A与DNA四面体载体共聚物在生物检测、活体成像、基因载体、药物传递中的应用。
9.一种靶向非小细胞型肺癌的药物，其特征在于，其为权利要求1所述的共聚物与非小细胞型肺癌的化疗药物、siRNA或单克隆抗体中的任意一种的复合物。
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