CN110201191B - 一种功能性蛋白质和花青染料分子的复合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种功能性蛋白质和花青染料分子的复合物，它是由花青染料分子和功能性蛋白质经过可控自组装形成的复合物，所述的复合物外层为所述的功能性蛋白质，所述的功能性蛋白质内部包裹有所述的花青染料分子。本发明所述的复合物相比现有近红外二区探针具有发光和体内行为的明显改善，在近红外二区具有显著提高的成像效果，可应用于活体荧光成像和分子成像。本发明还提供制备所述复合物的方法和所述复合物在近红外二区作为荧光分子成像显像剂的应用。
Description
技术领域
本发明属于近红外成像探针技术领域，具体涉及一种新型的基于功能性蛋白质和花青染料的复合物，及其制备方法和作为近红外二区复合物探针的应用。
背景技术
目前生物成像技术的发展极大地丰富了研究者探索生物过程、机制的手段，而荧光成像(fluorescence imaging)具有成像速度快、灵敏度高、可进行靶向设计等优点，被广泛应用于细胞、组织及活体成像中。生物成像主要借助特定的荧光探针，选用合适的成像设备(包括从可见光区到近红外区敏感的宽场或显微设备)，来研究生物学过程和信息的方法。荧光成像技术的关键是运用足够的信号对比度来分辨细胞或组织的细微结构，进而分析特定区域的特征、状态，甚至特定分子的表达、分布等信息。荧光成像技术同时还具有分辨率高、无损探测等优点，因此广泛应用于探索疾病发病机理，临床疾病检测，术中导航手术等领域。
正如我们在专利文献CN107796796A中陈述，生物荧光成像在活体成像方面仍然面临巨大的瓶颈和挑战，主要原因有两个方面：其一是生物体本身存在可见光波段的自发荧光，导致活体成像的背景增大，分辨率大大降低；其二由于光子在穿透生物体存在着强烈的散射作用，因此无法进行比较深的活体荧光成像。解决此问题的方法就是选用发射波长较长的近红外一区(750-900纳米)甚至近红外二区(1000-1700纳米)的荧光材料进行生物成像。
虽然我们以及其他研究者实现了IRDye 800CW等花青染料的荧光发射拖尾应用于近红外二区(900-1500纳米)成像，从而使其作为一种现成的商业染料可直接应用于近红外二区活体成像。但花青染料的近红外二区发光效率相对较低、容易光漂白、活体稳定性较差，体内应用较易扩散的弱点，导致其成像窗口较短。因此，想要真正意义的推动近红外二区成像技术的临床应用，实现活体成像的低背景、优良的穿透深度和较低的生物组织散射，我们迫切需要发光质量高、体内循环时间长且稳定的近红外二区探针。
发明内容
本发明的首要目的是提供一种发光和体内行为明显改善的近红外二区探针复合物，可应用于活体荧光成像和分子成像。
本发明的另一个目的在于提供制备所述探针复合物的方法。
本发明的再一个目的在于提供所述探针复合物在近红外二区作为荧光分子成像显像剂的应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
首先，提供一种功能性蛋白质和花青染料分子的复合物，它是由花青染料分子和功能性蛋白质经过可控自组装形成的复合物，所述的复合物外层为所述的功能性蛋白质，所述的功能性蛋白质内部包裹有所述的花青染料分子。
本发明所述的复合物中，所述的花青染料分子是具有以下任意一种骨架结构的衍生物：
具有所述骨架1的花青染料分子进一步优选ICG或IR-125；
具有所述骨架2的花青染料分子进一步优选IR-820、IR-830或Cy7.5；
具有所述骨架3的花青染料分子进一步优选DiR或HITCI；
具有所述骨架4的花青染料分子进一步优选IRDye800cw、IR-783、IR12-N3、Cy7、IR-775、或IR-780；
本发明所述的复合物中，最优选的花青染料分子为IR-783、IR-12N3或ICG。
本发明所述的复合物中，所述的功能性蛋白质可以是现有的多种具有生理功能的蛋白质，包括催化蛋白、运输蛋白、免疫蛋白、调节蛋白等。本发明优选的功能性蛋白质包括：白蛋白、糖蛋白、脂蛋白、球蛋白或其他抗体；所述的其他抗体进一步优选爱必妥(Erbitux)、anti-CD31抗体或赫塞汀(herceptin)等。
本发明优选的一种实施方式中，所述的复合物是由所述的花青染料分子和白蛋白经过可控自组装形成的，所述的复合物外层为白蛋白，所述的白蛋白内部包裹有所述的花青染料分子；所述的花青染料分子为IR-783、IR-12N3或ICG。所述的白蛋白可以是人血清白蛋白或动物血清白蛋白。
在此基础上，本发明进一步提供制备所述复合物的方法，包括：
1)将含有所述的功能性蛋白质的溶液A与含有所述的花青染料分子的溶液B混合，控制所述的功能性蛋白质与所述的花青染料分子达到1:0.5～1的摩尔比，共混孵育4-24小时；纯化后得到中间产物；
2)在55℃～70℃下加热1)所得中间产物5～15分钟，得到所述的复合物。
本发明的制备方法中，通过特定比例共混后，所述的花青染料分子会被所述的功能性蛋白质稳定地包覆形成纳米颗粒；再进一步加热处理得到稳定的复合物。该复合物整体呈澄清透明的液体。
为了增加所述复合物形成的纳米颗粒尺寸，本发明优选的方案中，1)所述的溶液A进一步含有二硫键还原剂和/或氨基交联剂。所述的二硫键还原剂与所述的功能性蛋白质的比例控制在40-60:1；所述的氨基交联剂与所述的功能性蛋白质的比例控制在15～25:1。所述的二硫键还原剂可以打断所述功能性蛋白质中的双硫键，促进花青染料分子被更好地包裹；所述的氨基交联剂可以交联所述功能性蛋白质中的氨基形成Schiff碱结构。最终可以实现多个功能性蛋白质组装在一起形成50-100纳米尺寸的复合物颗粒。
本发明的方案中，所述的二硫键还原剂可以是现有技术中适合用于细胞生物学研究的各种二硫键还原剂，例如2-巯基乙醇(beta-ME)、二硫苏糖醇(DTT)或还原型谷胱甘肽(GSH)，本发明优选GSH；所述的氨基交联剂可以是现有技术中适用于蛋白质交联的各种交联剂，本发明优选和氨基有高反应活性的双官能度交联剂，最优选戊二醛或双琥珀酰亚胺酯(双NHS)。
本发明进一步优选的方案中，1)所述的纯化是用30k的离心滤膜洗涤以除去未反应的二硫键还原剂和/或氨基交联剂等分子。
本发明人通过实验发现，所述的制备方法中，1)所述的功能性蛋白质在混合溶液中的浓度会对所得复合物的尺寸产生影响，以白蛋白和IR-783复合为例，调控白蛋白浓度从2.5mg/ml到40mg/ml制备IR-783@白蛋白复合物时，发现40mg/ml的反应浓度产生了大量的沉淀聚集(如图4所示)，而采用20mg/ml以下的白蛋白反应浓度，尤其是20mg/ml时，所得复合物尺寸比较理想。因此本发明优选的制备方法中，1)中控制所述的溶液A和溶液B混合后功能性蛋白质的浓度在2.5～20mg/ml，更优选控制在20mg/ml。
本发明人通过实验还发现，所述的制备方法中，1)所述的功能性蛋白质与花青染料分子的反应比例也会影响所得复合物的尺寸。同样以白蛋白和IR-783的反应为例，在两者比例从1:0.0625到1:2的变化过程中，我们发现1:2的比例有些许沉淀产生(图5A)，且尺寸变大(图5B)；因此本发明优选的制备方法中，1)所述的功能性蛋白质与所述的花青染料分子比例优选控制在1:1。
另外，针对1)所述的功能性蛋白质与花青染料分子共混后的孵育时间对复合物尺寸的影响，我们采用1:0.5和1:1两个比例进行实验验证，发现随着反应时间的增加，复合物尺寸呈现增大的趋势(如图6所示)。因此本发明优选的制备方法中，1)所述的共混孵育时间为24小时。
对于本发明制备方法中2)所述的加热温度，本发明人也通过实验观察了从室温、50、60到70摄氏度的不同温度下处理纯化后的复合物的效果，发现室温和50摄氏度的处理温度形成的复合物稳定性较差，染料分子可从复合物中扩散出来；而70摄氏度的反应温度又大大降低了复合物亮度(图9)。因此本发明优选的制备方法中，2)所述的加热温度为55～60℃，最优选60℃。
进一步地，本发明还提供所述复合物在近红外二区作为荧光分子成像显像剂的应用。
本发明所述的应用方案中，所述的近红外二区是波长在900纳米以上的近红外光波段；优选1000纳米以上的近红外光波段；更优选1100纳米以上的近红外光波段；最优选1200纳米以上的近红外光波段。
本发明所述的应用方案中，所述的荧光分子成像包括在各种细胞、组织或其他活体生物中的成像。
现有的基于单个分子的近红外二区成像探针具有量子效率低、活体弥散较快、稳定性较差等弱点，不管在小动物活体成像还是手术导航方面都存在着不可解决的成像瓶颈。由于其较短的成像窗口，必须进行多次注射给药达到肿瘤部位可视化的目的，但这种大剂量的多次给药，同时也大大增加了背景信号，从而使近红外二区低背景和高穿透深度的优势大大折扣。我们在本发明提出过程中运用体内丰富存在的白蛋白对花青染料分子进行包裹改性，首次实现了白蛋白包裹的花青染料探针，由于花青分子被白蛋白稳定的地包覆，一方面由于限制振转弛豫以及增强分子内扭曲电荷转移过程，大大增加了近红外二区发光效率；另一方面被白蛋白包裹的复合结构大大增强了体内循环时间，从而降低了单个分子的弥散较快、稳定性较差的弱势。在实现白蛋白包裹花青染料分子的过程中，我们通过优化反应条件实现了所得探针长循环时间的血管成像，从而制备得到发光和体内行为明显改善的近红外二区探针系统，有望应用于后续的近红外二区临床导航手术中。
我们同时验证了，其他功能性蛋白质和花青染料以相同方式形成的复合物可实现靶向肿瘤的理想效果。进而我们详细对比了其在近红外一区和近红外二区的成像效果，证明了花青复合物在近红外二区具有显著提高的成像效果。
基于本发明的方案，未来我们还可以进一步对白蛋白的一级胺进行DOTA螯合环的共价接枝，实现近红外二区/正电子发射型计算机断层显像(PET)的双成像探针，将大大提高临床检测以及手术导航的精确性。
总之，本发明的复合物比目前手术导航中使用的吲哚菁绿具有发光效率高、背景散射小，弥散较慢等优点，将大大提高活体成像的信噪比和穿透深度。
附图说明
图1是实施例2-5所述的4种反应方案的示意图。
图2是实施例2-5所述的反应原理示意图。
图3A是实施例1中IR-783，IR-12N3和ICG三染料分子制备的白蛋白复合物的实物图。
图3B是实施例1中IR-783，IR-12N3和ICG三染料分子制备的白蛋白复合物的动态光散射粒径分布图。
图4是本发明对反应白蛋白浓度优化过程的尺寸分布和产品实物图。
图5A是本发明对于反应投料比的优化过程的产品实物图。
图5B是本发明对于反应投料比的优化过程的产品尺寸分布图。
图6是本发明对与反应时间的优化对应的复合物尺寸分布图。
图7是凝胶电泳分析实施例2-5中四种反应方案制备的复合物分子量分布图。
图8是实施例2-5中四种反应方案制备的复合物透射电子显微镜表征图；方案二(C2)、方案三(C3)制备的尺寸相比于方案一(C1)、方案四(C4)更大。
图9体现了本发明中处理温度对于复合物粒径的影响，较高的后处理温度可以制备更加稳定及粒径分布在50-100纳米的复合物，优化的后处理温度为60摄氏度；
图10是实施例6对于实施例2-3制备的IR-783@白蛋白复合物的活体成像效果评估图(A、B和C三组中每组的两行分别为近红外一区和二区的成像效果图)，体现了所述复合物理想的血管成像能力。
图11是实施例6对于实施例3-5制备的IR-783@白蛋白复合物的活体成像效果评估图，体现了所述复合物理想的血管成像能力和体内循环时间。
图12是实施例7中LED激发下复合物对小鼠大腿血管的成像效果图，可以发现随着成像区间的红移，成像效果明显提高。
图13是实施例7中对于小鼠血管成像时间窗的评估，可以发现在近红外二区录像记录的三十分钟内，血管信号保持完好，具有较高的血管/肌肉信噪比。
图14是实施例7中复合物探针实现小鼠脑血管成像的近红外一、二区成像对比图。
图15是实施例8中对于小鼠脑血管的显微成像图，相比于单纯的花青分子，复合物具有显著改进的脑血管成像能力，可对小至3微米的毛细血管进行成像。
图16是实施例9中选用功能蛋白爱必妥(Erbitux)和花青染料复合制备的近红外二区复合探针，进而实现了SCC肿瘤的靶向近红外二区成像。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的阐述。
各实施例中所使用的包覆试剂配制如下：用磷酸缓冲溶液(PBS)配制40mg/ml(602μM)的牛血清白蛋白(BSA)溶液，配置26.7mM花青染料(ICG,IR-783和IR-12N3)的DMSO溶液，配置0.25M的含15％DMSO的谷胱甘肽溶液，配置0.25M的戊二醛溶液。
实施例1.
选用三种典型的花青染料ICG,IR-783和IR-12N3分别参照图1提供的4种方案用白蛋白包覆，具体方案如下：
方案一：500微升白蛋白溶液中加入500微升PBS，加入11微升花青染料，混匀之后，在37摄氏度震荡箱中反应24小时，用30k的离心滤膜洗涤五遍，后处理温度为60摄氏度10分钟。
方案二：500微升白蛋白溶液中加入500微升PBS，加入60微升谷胱甘肽溶液混匀；加入11微升花青染料混匀，在37摄氏度震荡箱中反应24小时，用30k的离心滤膜洗涤五遍，后处理温度为60摄氏度10分钟。
方案三：500微升白蛋白溶液中加入500微升PBS，加入60微升谷胱甘肽和24微升戊二醛溶液混匀；加入11微升花青染料混匀，在37摄氏度震荡箱中反应24小时，用30k的离心滤膜洗涤五遍，后处理温度为60摄氏度10分钟。
方案四：500微升白蛋白溶液中加入500微升PBS，加入24微升戊二醛溶液混匀；加入11微升花青染料混匀，在37摄氏度震荡箱中反应24小时，用30k的离心滤膜洗涤五遍，后处理温度为60摄氏度10分钟。
形成的复合物均澄清透明，稳定性良好(如图3A所示，其中C1、C2、C3和C4分别对应图1中的方案一至方案四)；如图3B所示，其中实施例2、3制备的复合物尺寸相对较大(参见横坐标中GSH和GSH+GTD对应的数据点)，证明其多个白蛋白组装在一起形成了50-100纳米复合结构。经测试证明四个方案制备的复合物均可以作为近红外二区探针。
以下重点列举以IR-783作为被包覆花青染料分子的实施例来说明本发明制备的复合物的性能特征和应用优势。
实施例2.简单共混制备IR-783与白蛋白的复合物
制备方案如图1“方案一”所示，具体包括：在40mg/ml(602μM)的BSA溶液中加入IR-783溶液，控制白蛋白与IR-783达到1:1的摩尔投料比，混匀，并控制白蛋白反应浓度在20mg/ml，在37摄氏度震荡箱中反应24小时，用30k的离心滤膜洗涤五遍，后处理温度为60摄氏度10分钟，其反应过程及所得复合物结构可参见图1、2的示意，透射电子显微镜下呈纳米颗粒状，见图8最左侧图所示。所得复合物记作“IR-783@BSA”。
实施例3.共混后谷胱甘肽还原制备IR-783与白蛋白的复合物
制备方案如图1“方案二”所示，具体包括：在40mg/ml(602μM)的BSA溶液中加入60微升0.25M的含15％DMSO的谷胱甘肽溶液，再加入IR-783溶液，控制白蛋白与IR-783达到1:1的摩尔投料比，混匀；并控制白蛋白反应浓度在20mg/ml，在37摄氏度震荡箱中反应24小时，用30k的离心滤膜洗涤五遍，后处理温度为60摄氏度10分钟，其反应过程及所得复合物结构可参见图1、2的示意，透射电子显微镜下呈纳米颗粒状，见图8左起第二张图所示。所得复合物记作“IR-783@BSA-GSH”。
实施例4.共混后谷胱甘肽还原及戊二醛交联制备IR-783与白蛋白的复合物
制备方案如图1“方案三”所示，具体包括：在40mg/ml(602μM)的BSA溶液中加入60微升0.25M的含15％DMSO的谷胱甘肽溶液和24微升0.25M的戊二醛溶液，再加入IR-783溶液，控制白蛋白与IR-783达到1:1的摩尔投料比，混匀；并控制白蛋白反应浓度在20mg/ml，在37摄氏度震荡箱中反应24小时，用30k的离心滤膜洗涤五遍，后处理温度为60摄氏度10分钟，其反应过程及所得复合物结构可参见图1、2的示意，透射电子显微镜下呈纳米颗粒状，见图8左起第三幅图所示。所得复合物记作“IR-783@BSA-GSH-GTD”。
实施例5.共混后戊二醛交联制备IR-783与白蛋白的复合物
制备方案如图1“方案四”所示，具体包括：在40mg/ml(602μM)的BSA溶液中加入24微升0.25M的戊二醛溶液，再加入IR-783溶液，控制白蛋白与IR-783达到1:1的摩尔投料比，混匀；并控制白蛋白反应浓度在20mg/ml，在37摄氏度震荡箱中反应24小时，用30k的离心滤膜洗涤五遍，后处理温度为60摄氏度10分钟，其反应过程及所得复合物结构可参见图1、2的示意，透射电子显微镜下呈纳米颗粒状，见图8最右侧图所示。所得复合物记作“IR-783@BSA-GTD”。
我们进一步利用凝胶电泳对于实施例2-5的四个反应方案的复合物进行尺寸表征，发现实施例3采用的方案二和实施例4采用的方案三产生了较大的组装体(图7中的C2,C3)，这个结果和图3B中的动态光散射数据和透射电镜数据(图8)相符。
实施例6.近红外区活体成像效果评估
我们针对实施例2-5制备的复合物IR-783@BSA、IR-783@BSA-GSH、IR-783@BSA-GSH-GTD和IR-783@BSA-GTD在近红外一、二区成像设备中进行活体体内成像效果评估。
如图10所示，IR-783@BSA和IR-783@BSA-GSH复合物都表现了较好的体内成像效果。与单纯的IR-783分子较快的排出体外相反，IR-783@BSA和IR-783@BSA-GSH均表现了提高的体内代谢行为。近红外二区成像可以更加清楚的分辨小鼠血管，证实了其增长的体内代谢行为。同时，IR-783@BSA-GSH比IR-783@BSA具有更优的亮度和血管成像能力。
我们进一步对比IR-783@BSA-GSH，IR-783@BSA-GSH-GTD和IR-783@BSA-GTD三种复合物的体内成像行为。我们证实IR-783@BSA-GSH和IR-783@BSA-GSH-GTD两种复合物都具有较好的成像亮度和体内循环时间(图11)，适合血管等多种成像应用。
实施例7.小鼠血管成像能力评估
我们选用IR-783@BSA-GSH或IR-783@BSA-GSH-GTD复合物进一步评估其小鼠血管成像能力。由于复合物较高的近红外二区量子产率，我们可以应用小功率的近红外LED光源进行激发，实现较好的从近红外一区到二区不同区间的小鼠大腿血管成像。如图12所示，在近红外LED的激发下，得到了优异的血管成像效果，而且随着成像子区间的红移，在1200或1300纳米以上波段获得了极优的血管成像能力。
我们进一步通过近红外二区录像，记录了注射上述两种复合物之后的血管成像窗口时间(图13)，发现录像记录的三十分钟内，上述两种复合物在血管中信号得到很好的保持，血管/肌肉信噪比可以达到6到8。我们又在剃毛的C57小鼠脑部验证了上述两种复合物探针的血管成像能力，如图14所示，上述两种复合物在近红外二区达到了优异的脑血管成像能力，有望应用于后续的脑部血管疾病研究及手术导航。
实施例8.小鼠血管显微成像效果
选用优化的复合物探针，我们实现了小鼠脑血管的显微成像。目前近红外活体成像主要集中在活体宽场设备，而显微成像能够更加明确的确定组织中的精细结构，从而实现活体研究疾病模型。如图15所示，注射了IR-783@BSA复合物的小鼠脑组织可实现高质量的近红外二区微小血管成像，对小至3微米的血管可精确辨认。而与之相反，单纯的IR-783分子无法做到类似的成像效果。
实施例9.其他功能性蛋白质与花青染料分子的复合物
我们利用爱必妥(Erbitux)和花青染料参照实施例2的方法共混复合，制备可靶向肿瘤EGFR受体的靶向复合物。我们在接种了头颈癌肿瘤(SCC)的裸鼠模型中，验证了所述靶向复合物优良的靶向能力(图16)，虽然此靶向复合物具有较强的肝脏吸收，但其仍然具有一定的分子成像应用前景。
Claims (16)
1.一种用于血管成像的功能性蛋白质和花青染料分子的复合物，它是由花青染料分子和功能性蛋白质经过可控自组装形成的复合物，所述的复合物外层为所述的功能性蛋白质，所述的功能性蛋白质内部包裹有所述的花青染料分子；所述的花青染料分子为IR-783、IR12-N3或IR-780；所述的功能性蛋白质为白蛋白。
2.一种用于血管成像的功能性蛋白质和花青染料分子的复合物，它是由花青染料分子和白蛋白经过可控自组装形成的，所述的复合物外层为白蛋白，所述的白蛋白内部包裹有所述的花青染料分子；所述的花青染料分子为IR-783或IR-12N3。
3.一种制备权利要求1所述复合物的方法，由以下步骤组成：
1）将含有所述的功能性蛋白质的溶液A与含有所述的花青染料分子的溶液B混合，控制所述的功能性蛋白质与所述的花青染料分子达到1:0.5~1的摩尔比，共混孵育4-24小时；纯化后得到中间产物；所述的花青染料分子选自IR-783、IR12-N3或IR-780；所述的功能性蛋白质为白蛋白；所述的溶液A进一步含有二硫键还原剂和/或氨基交联剂；所述的二硫键还原剂与所述的功能性蛋白质的比例控制在40-60:1；所述的氨基交联剂与所述的功能性蛋白质的比例控制在15~25:1；所述的二硫键还原剂选自2-巯基乙醇、二硫苏糖醇或还原型谷胱甘肽；所述的氨基交联剂是和氨基有高反应活性的双官能度交联剂；
2）在55℃~70℃下加热1）所得中间产物5~15分钟，得到所述的复合物。
4.权利要求3所述的方法，其特征在于：1）所述的二硫键还原剂为还原型谷胱甘肽；所述的氨基交联剂为戊二醛或双琥珀酰亚胺酯。
5.权利要求3所述的方法，其特征在于：1）中控制所述的溶液A和溶液B混合后功能性蛋白质的浓度在2.5~20 mg/ml。
6.权利要求3所述的方法，其特征在于：1）中控制所述的溶液A和溶液B混合后功能性蛋白质的浓度在20 mg/ml。
7.权利要求3所述的方法，其特征在于：1）所述的功能性蛋白质与所述的花青染料分子摩尔比控制在1:1。
8.权利要求3所述的方法，其特征在于：1）所述的共混孵育时间为24小时。
9.权利要求3所述的方法，其特征在于：2）所述的加热温度为55~60℃。
10.权利要求3所述的方法，其特征在于：2）所述的加热温度为60℃。
11.权利要求1所述的复合物在制备近红外二区荧光分子成像显像剂中的应用。
12.权利要求11所述的应用，其特征在于：所述的近红外二区是波长在900纳米以上的近红外光波段。
13.权利要求11所述的应用，其特征在于：所述的近红外二区是波长在1000纳米以上的近红外光波段。
14.权利要求11所述的应用，其特征在于：所述的近红外二区是波长在1100纳米以上的近红外光波段。
15.权利要求11所述的应用，其特征在于：所述的近红外二区是波长在1200纳米以上的近红外光波段。
16.权利要求11所述的应用，其特征在于：所述的荧光分子成像包括在各种细胞、组织或其他活体生物中的成像。
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